桃金娘葉乙醇提取物對小鼠蓖麻油性腹瀉及兔離體空腸平滑肌的影響

文靜 羅凱萍 方瑩瀅 呂遠霞 周艷梅 李春臣 吳小橋 楊春妮 張建武

(川北醫學院 1藥學院，四川 南充 637100；2醫學影像學院；3臨床醫學院)

桃金娘為桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的干燥根，其果實、花、葉均可入藥，具有養血、止血、澀腸、固精之功效。現代藥理研究表明，桃金娘還具有抗氧化〔1〕、抗菌〔2〕、抗病毒〔3〕、降血糖〔4〕等作用，在醫藥、保健品和化妝品中具有廣泛的應用價值。桃金娘因其收澀之性而具有澀腸固精之功效，臨床可用于治療慢性痢疾〔5〕。然而目前僅有少數報道桃金娘為一些藥用食品和組合藥物的藥味之一，可用于治療幼兒腹瀉、病毒性細菌性感染腹瀉及內服治療慢性結腸炎，并未廣泛應用于臨床腹瀉的治療，其對胃腸道的作用及作用機制也鮮有報道。因此，本實驗從離體和在體兩個方面評估桃金娘在胃腸道方面的作用，為臨床治療腹瀉提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 95%乙醇、碳酸氫鈉、氯化鉀、葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、無水氯化鈣、氯化鈉、氯化鐵、氯化鋁、醋酸鉀(成都市科隆化學品有限公司)，純化水(杭州娃哈哈集團有限公司)，乙酰膽堿(成都化夏化學試劑有限公司，純度：99%，批號：2017032301)，維拉帕米(美國 MedChemExpress 生物科技公司，純度：99.97%，批號：25193)，蓖麻油(河南省華龍藥業有限公司，批號：20180407)，沒食子酸(中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-19032801，純度：99.04%)，乙腈(Northscht，色譜純)，生理鹽水(浙江國鏡藥業有限公司，批號：H33020482)

臺氏液制備：將氯化鈉 40 g，氯化鉀 1 g，氯化鈣 1 g，二水合磷酸二氫鈉 0.325 g，一水合葡萄糖 5.5 g，碳酸氫鈉 5 g，七水合硫酸鎂 1.3 g，溶于1 000 ml純化水中，備用。

1.1.2實驗儀器 Agilent-1220 高效液相色譜儀(Agilent，美國)，色譜柱(Aglient-ZORBAX SB-C18)，電子分析天平(Mettle AE 240)，旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)，真空減壓干燥箱(武漢奧普森試驗設備有限公司，ZK 6050B)，HW-400E恒溫平滑肌槽，BL-420F生物機能實驗系統，FT-100生物張力傳感器(四川成都泰盟公司)，優普純水/超純水制造系統(四川優普超純科技有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(YDYQ,101-2A)，粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司，FW177)，超聲儀(東莞市柯橋超聲設備有限公司，KQ-300DE)。

1.1.3藥物的提取 桃金娘葉購于廣西玉林市，經川北醫學院藥學院楊蘭老師鑒定為桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的葉。將自然風干的桃金娘葉用粉碎機粉碎成粗粉，精密稱定100 g，置于1 L的圓底燒瓶中，加入10倍量95%乙醇(分析純)，浸泡24 h，然后回流提取3次，每次3 h，合并濾液，旋轉蒸發濃縮成浸膏，置于真空減壓干燥箱中干燥，得桃金娘葉乙醇提取物(RText)，經計算浸出率為33.26%。提取物置于4℃冰箱中儲存備用。

1.1.4實驗動物 健康雄性昆明小鼠(體重18～22 g)和健康大白兔體重(2.0～2.5 kg)均購買于川北醫學院實驗動物中心〔許可證編號：SYXK(chuan)2018-076〕。將動物置于12 h光照黑暗循環條件下飼養，且將溫度控制在23～26℃。飼養期間動物可以自由獲取食物和水。本實驗嚴格遵循動物倫理和實驗準則。

1.2方法

1.2.1高效液相色譜法鑒定RT ext中的化學成分

1.2.1.1色譜條件 色譜柱Aglient-ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，采用等度洗脫(流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，80∶20)，波長為272 nm，流速為0.4 ml/min，柱溫28℃,進樣量為5 μl。

1.2.1.2對照品溶液制備 精密稱定沒食子酸對照品，加甲醇溶解，搖勻，制成每1 ml含0.1 mg的沒食子酸對照品溶液，對照品溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.1.3供試品溶液制備 精密稱定RT ext 0.02 100 g，加甲醇溶解并定容至1 ml容量瓶中，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1.2.2體內實驗

1.2.2.1急性毒性實驗〔6,7〕選取18～22 g健康雄性小鼠36只，隨機分為6組，每組6只，分別灌胃0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg的RT ext給各組小鼠，記錄灌胃后14 d內的毒性跡象及死亡情況，小鼠在記錄期間可自由進食飲水。以劑量為橫坐標，死亡率為縱坐標建立劑量反應曲線確定其半數致死量(LD50)。采用單次給藥最大劑量來評估RT ext的安全性。

1.2.2.2蓖麻油誘導的腹瀉 本部分實驗參照Guo等〔8〕及Tadesse等〔9〕的實驗方法，先進行預實驗，小鼠灌胃給予0.5 ml蓖麻油，篩選出表現為腹瀉的小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。陰性對照組灌胃生理鹽水(20 ml/kg)，陽性對照組灌胃維拉帕米(50 mg/kg)，RT ext按照低、中、高濃度灌胃給藥，劑量分別為125、250和500 mg/kg。給藥之后將每只小鼠單獨放在事先準備的籠子中，并在籠子下墊吸墨紙，以便觀察小鼠糞便情況。給藥處理30 min后，各組小鼠灌胃給予蓖麻油(20 ml/kg)誘導腹瀉。觀察給予蓖麻油后4 h內的固體糞便、半固體糞便、液體糞便的數量及初始半固體糞便出現的時間，并用以下公式來判斷腹瀉程度。

排空指數=固體糞便數量×1+半固體糞便數量×2+液體糞便數量×3。

1.2.3體外實驗

1.2.3.1離體標本的制備 選用健康家兔，實驗前24 h作禁食(不禁水)處理，用木槌猛擊家兔枕部致死，立即剖開腹腔，以幽門與十二指腸交界處為起始部取空腸部分。立即放入通有95% CO2和5% O2混合氣體的臺式液中，將腸內容物清洗干凈并去除腸系膜，剪成1.5～2.0 cm的腸段，放入新鮮配制的臺氏液中，并于恒溫水浴箱(37℃±0.5℃)中保存，每隔10 min用臺氏液換洗一次，保持標本活性。

1.2.3.2RT ext對離體空腸平滑肌自主收縮的影響 取一段腸管，一端用線結扎固定于通氣溝，另一端連接張力換能器。平滑肌槽需保持恒溫(37℃±0.5℃)，平滑肌槽中通入含95% CO2和5% O2的混合氣體，將氣泡速度調節為每秒鐘1～2個，設置前負荷為1 g，穩定30 min后，依次累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生藥)/ml〕，每次加藥時間間隔為200 s，另設陰性對照組和陽性對照組，陰性對照組間隔3 min加臺氏液，陽性對照組間隔3 min累計加入維拉帕米(0.001～10.000 μmol/L)，采用BL-420F生物機能實驗系統記錄腸管的收縮情況，觀察記錄加藥前后的平均值和最小值。

1.2.3.3RT ext對乙酰膽堿和氯化鉀誘導的空腸平滑肌的影響 設備連接同1.2.3.2，待空腸平滑肌標本在肌槽中穩定30 min后，分別加入乙酰膽堿(10 μmol/L)和氯化鉀(KCl，60 μmol/L)進行預處理，待出現最大波峰后立即用新鮮配制的臺氏液反復沖洗直至基線恢復，之后再次加入同濃度乙酰膽堿和KCl預孵15 min，采用BL-420F生物機能實驗系統記錄空腸平滑肌的收縮曲線，然后再分別累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生藥)/ml〕和維拉帕米(0.001～3.000 μmol/L)，記錄加藥后平均值和最小值。

1.2.3.4RT ext對CaCl2誘導的空腸平滑肌的影響 為了進一步確定RT ext對Ca2+內流的影響，設計本實驗。首先讓腸管置于臺氏液中進行平衡，待張力穩定后用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的無鈣高鉀(60 mmol/L)的溶液替換臺氏液30 min，以除去組織中的Ca2+。再換用不含EDTA的無鈣高鉀(60 mmol/L)溶液平衡15 min。然后加入RT ext構建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的劑量-效應曲線，觀察RT ext不同劑量對空腸平滑肌收縮率的影響。然后加入維拉帕米(1 μmol/L)，構建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的劑量-效應曲線，觀察空腸平滑肌收縮率的變化。在沒有RT ext和維拉帕米存在的情況下3×10-2mol/L CaCl2誘導的收縮被認為是100%〔10〕。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、配對t檢驗。

2 結 果

2.1高效液相色譜法鑒別RT ext中的化學成分 RT ext中含沒食子酸。在上述1.2.1.1的色譜條件下，沒食子酸的分離度良好，空白、標準品、樣品的色譜見圖1。

圖1 空白(A)、標準品(B)、RT ext樣品(C)的HPLC色譜圖(1沒食子酸)

2.2體內實驗

2.2.1急性毒性實驗 RT ext 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg灌胃給藥，在14 d觀察期內未出現任何死亡或毒性跡象。在最大耐受量實驗中，單次灌胃的RT ext的最高劑量為16 g/kg，而結果顯示小鼠在觀察期間沒有出現任何死亡及身體行為的變化，可預估其LD50值大于16 g/kg。

2.2.2蓖麻油誘導的腹瀉 與陰性對照組對比，維拉帕米組與RT低、中、高劑量組小鼠的半固體糞便產生時間顯著延長(P<0.001)；與陰性對照組相比，陽性藥維拉帕米組與RT低、中、高劑量組腹瀉指數顯著均下降(P<0.001，P<0.01)，RT中劑量作用明顯(P<0.05)，RT低劑量有降低趨勢，但與陰性對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。見表1。提示RT ext對蓖麻油誘導的腹瀉有顯著的抗腹瀉活性，但其作用不及維拉帕米強。

表1 不同濃度RT ext對蓖麻油誘導小鼠腹瀉模型的初始半固體出現時間及排空指數的影響

2.3體外實驗

2.3.1RT ext對家兔離體空腸平滑肌自主收縮的影響 陰性對照組單加臺氏液后空腸平滑肌自主收縮并未受影響(圖2C)，RT ext可抑制兔空腸平滑肌的自主收縮，且呈濃度依賴性(圖2A)，0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml RT平滑肌百分收縮率分別為：(94.50±1.67)%、(90.76±2.41)%、(84.67±4.09)、(76.53±3.52)%、(46.37±3.02)、(27.63±2.74)%、(7.56±2.55)%，其作用與維拉帕米組的效果相似(圖2B)，0.01、0.03、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L 維拉帕米平滑肌百分收縮率分別為(79.44±5.37)%、(87.44±2.97)%、(82.64±3.32)%、(69.70±2.33)%、(46.39±3.28)%、(21.25±3.35)%、(9.87±2.28)%，表現為平均收縮力下降，其EC50值分別為0.68 g/L 95%(CI：0.61～0.81 g/L，n=6)和0.57 μmol/L(95%CI：0.48～0.66 μmol/L，n=6)。

圖2 不同濃度RT ext(A)、維拉帕米(B)及臺式液(C)對兔離體空腸平滑肌自主收縮的影響(橫坐標為時間，間隔200 s，縱坐標為平滑肌收縮幅度)

2.3.2RT ext對Ach和KCl誘導的空腸平滑肌的影響 RT ext能濃度依賴性的抑制由Ach誘導的腸管收縮，EC50為0.43 mg/ml(95%CI：0.35～0.53 mg/ml，n=6)，維拉帕米的EC50為0.39 μmol/L(95%CI：0.344 6～0.435 3 μmol/L，n=6)。此外，RT ext能濃度：依賴性地抑制由KCl誘導的腸管收縮，EC50為0.13 mg/ml(95%CI：0.11～0.17 mg/ml，n=6)，維拉帕米的EC50為0.064 μmol/L(95%CI：0.056～0.070 μmol/L，n=6)。見表2、表3。

表2 不同濃度的維拉帕米對Ach和KCl預處理后兔離體空腸平滑肌百分數收縮率的影響

表3 不同濃度的RT ext對Ach和KCl預處理后兔離體空腸平滑肌百分收縮率的影響

2.3.3RT ext對CaCl2誘導空腸平滑肌的收縮的影響 與CaCl2陰性對照組相比，RT ext 1 mg/ml和維拉帕米0.03 μmol/L可極顯著降低累加CaCl23×10-4～3×10-2mol/L時平滑肌的收縮率(P<0.001)；RT ext 3.00 mg/ml維拉帕米0.1 μmol/L可顯著降低累加CaCl21×10-4～3×10-2mol/L時平滑肌的收縮率(P<0.001,P<0.01)。RT ext可抑制CaCl2誘導的兔離體空腸平滑肌的手術，且呈劑量依賴性，其作用趨勢和維拉帕米一致。見表4。

表4 CaCl2對兔離體空腸在無和有RT ext及維拉帕米情況下平滑肌收縮率的影響

4 討 論

腹瀉是一種常見的消化道疾病，臨床多表現為腸黏膜的分泌旺盛與吸收障礙，胃腸蠕動加快，排便次數增多，糞質稀薄如同水樣或含有異常成分等。長期腹瀉可引起患者腸道正常菌群失調、營養不良、免疫力下降等〔11〕。據報道〔12〕，每年全球人群腹瀉發生率約為5%，嚴重危害人類健康，目前已成為全球發展中國家突出的公共衛生問題。腹瀉的致病因素較多，可由多種疾病引起，因此給臨床治療帶來了一定的困難。中醫藥理論強調“整體觀念”“辨證論治”，其“異病同治”的理論非常符合腹瀉的治療。中醫學根據腹瀉的便次頻繁、糞質稀薄或完谷不化的癥候特點將其歸屬于“泄瀉”的范疇，其病名首見于《內經》，故中醫藥治療腹瀉已有非常悠久的歷史。

據報道，任何5 g/kg無毒物質都是相對安全的〔13〕，而本研究的急性毒性實驗結果表明，口服RT ext至16 g/kg不會產生任何毒性及死亡跡象，故認為RT ext口服安全性良好，為后續實驗奠定基礎。

蓖麻油是從蓖麻的種子中提取而來，蓖麻油本身并無致瀉的作用，蓖麻油引起腹瀉的原因主要是其皂化后可生成刺激性較強的蓖麻油酸鈉，可促進炎癥介質的合成與釋放，引起小腸炎癥，致使腸腔積液，從而引起急性腹瀉。在蓖麻油誘導的小鼠腹瀉實驗中，RT ext 低、中、高劑量均可顯著延長半固體糞便出現的時間，表明桃金娘具有抗腹瀉活性。桃金娘的成熟果實中富含黃酮苷、酚類物質；根和樹皮含有鞣質、生物堿等；葉的主要成分為桃金娘油，也富含黃酮苷、水解鞣質。已有研究證實桃金娘鞣質可通過抑制胃腸收縮運行或降低腸道蠕動、降低腹腔毛細血管和腸絨毛膜通透性、抑制炎癥介質合成釋放等機制產生抗腹瀉作用〔14〕。也有報道顯示，桃金娘4種酚類成分具有體外抗豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的藥理活性,鞣花酸、白藜蘆醇、沒食子酸具有抗豬流行性腹瀉病毒藥物研究和開發價值〔15〕。而本研究也確定桃金娘中含有沒食子酸。此外，黃酮類化合物可以抑制自體蛋白和前列腺素的釋放〔16〕。因此推測，桃金娘的抗腹瀉活性可能與其所含有的鞣質、酚類物質及黃酮類成分發揮的抗炎等作用有關。

本研究經結果顯示，RT ext可以抑制空腸平滑肌的自主收縮，且呈濃度依賴性；RT ext對乙酰膽堿所致平滑肌收縮有顯著的緩解作用，且呈濃度依賴性。本結果也進一步印證RT ext可以緩解蓖麻油誘導的小鼠腹瀉這一現象。乙酰膽堿是腸神經系統中主要的興奮性神經遞質〔17〕，能激動M膽堿受體，M受體耦聯G蛋白(GP)，使胞內第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)濃度上升，進而引起Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化激發平滑肌產生收縮效應〔18〕。本實驗結果顯示RT ext能舒張乙酰膽堿誘導的空腸平滑肌收縮，作用趨勢與陽性藥維拉帕米一致，因此推測RT ext對空腸平滑肌自主收縮的抑制作用可能與阻斷M受體有關。

平滑肌的收縮有賴于細胞質中游離鈣的存在，阻斷鈣通道或是Ca2+釋放減少都會減弱腸平滑肌的收縮。L-型鈣通道是細胞興奮過程中調節細胞內鈣離子濃度保持在正常范圍內的主要離子通道〔19〕。高濃度的K+可打開電壓依賴性L型鈣通道，允許外Ca2+內流，從而促進腸平滑肌的收縮〔20,21〕。而如果有物質能夠松弛高K+誘導的腸平滑肌收縮則提示該物質可能為鈣拮抗劑〔22〕。本實驗結果顯示，RT ext能松弛氯化鉀誘導的腸平滑肌收縮，RT ext拮抗空腸平滑肌收縮的機制可能是通過非競爭性方式抑制外鈣內流。

綜上所述，RT ext具有顯著抗腹瀉的活性。且RT ext能濃度依賴性抑制離體兔空腸平滑肌的自主收縮，其作用機制可能與阻斷M受體及L型鈣離子通道有關。當然，RT ext對胃腸道的其他作用機制仍需要進一步研究。