右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后認知功能障礙的影響及其機制

張臣 蔡靈樂 李浩田 王娜 謝毅 袁甲翔

(1鄭州市第九人民醫院普外科，河南 鄭州 450053；2河南省人民醫院普外科；3鄭州大學第一附屬醫院微創外科)

術后認知功能障礙指患者手術前無精神和認知方面問題，但在麻醉術后患者發生不穩定的神經系統并發癥〔1〕。術后認知功能障礙表現為自身認知能力大幅度下降、記憶功能衰退、生活及工作能力降低和患者情緒性格出現較大的變化，病情嚴重者可能出現患者人格變動〔1,2〕。老年患者術后認知功能障礙的發病率明顯高于年輕患者，其原因是老年患者因其年齡過大，神經系統日趨老化，精神狀態日益衰落，身體狀態并不足以承受手術創傷和麻醉不良反應〔3,4〕。研究發現年齡>65歲的患者在接受非心臟手術后短期術后認知功能障礙發生率接近26%，長期術后認知功能障礙發生率約為10%〔5〕。隨著我國老齡化的加劇，老年患者術后認知功能障礙增加在醫院就診住院時長、擴大當前相應的醫療資源缺口、增添家庭及社會醫療支出。不僅嚴重影響患者日后生活自由和品質，也增添了患者家庭經濟壓力和社會醫療支出。術中麻醉是老年患者術后認知功能障礙的重要誘因，因此優化麻醉手段是對老年患者快速康復外科的一個重要環節〔6,7〕。右美托咪定是一種高選擇性腎上腺素能受體激動劑，手術中用作鎮靜劑和輔助劑，在重癥監護室中用作鎮靜劑。通過與受體的結合使藍斑神經元超極化抑制去甲腎上腺素釋放。近些年研究表明右美托咪定具有保護神經元和抗感染作用〔8〕。本研究探究右美托咪定對老年大鼠闌尾手術術后認知功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及干預方式 4月齡SPF級雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。飼養12個月后，大鼠被隨機空白組(n=6)、模型組(n=12)和治療組(n=12)；對空白組大鼠不做任何操作；模型組和治療組均使用七氟烷麻醉后行闌尾切除術；將大鼠放入Datex-Ohmeda型氣麻機的麻醉箱中，使用輸出濃度為2%的七氟烷對大鼠進行麻醉誘導，待大鼠麻醉后，使用輸出濃度為1%的七氟烷對大鼠進行維持麻醉，使用脫毛膏對大鼠腹部進行脫毛，75%酒精消毒大鼠腹部后，在大鼠中下腹部正中切口，打開腹腔，撐開切口，迅速找到闌尾，然后在闌尾根部用止血鉗夾住，在止血鉗內側用4-0號絲線扎緊，打外科結，再用剪刀剪除其外側的闌尾，用含碘0.5%的安多福消毒闌尾殘端，然后回納，最后分層縫合腹部肌肉和皮膚。治療組的大鼠在術前和術后24 h給予右美托咪定(100 μg/kg)治療；3組大鼠的其他飼養條件完全相同。

1.2Morris水迷宮試驗 試驗原理：趨利避害是動物的本能，大鼠在水中有強烈的逃避水環境的愿望，并以最快、最直接的途徑逃離水環境，學習逃離過程體現了大鼠的空間記憶力。由于水池內沒有參照物，所以大鼠的有效安全定位能力需參考水箱外的結構。Morris水迷宮試驗在術前4 d開始進行訓練，每組每天訓練4次(包括4個象限)，連續4 d。潛伏平臺放在第一象限內，訓練時依次從4個象限將大鼠放入水中，大鼠從入水到找到潛伏平臺時間為本次逃避潛伏期，大鼠找到潛伏平臺后讓其在上面停留15 s，如果大鼠在90 s內未找到潛伏平臺則人為將其引導上潛伏平臺，同時逃逸潛伏期計為90 s，每天4個象限逃逸潛伏期平均值作為當天逃逸潛伏期。術后第2天開始對各組大鼠進行Morris水迷宮試驗；在術后第2天開始對各組大鼠Morris水迷宮訓練1次，在訓練結束2 h后進行正式測試，測試時將潛伏平臺移開，選定與潛伏平臺相對的象限為入水點,記錄大鼠90 s內穿過原平臺位置的次數，連續測試4 d，計算每組大鼠每天的逃避潛伏期。

1.3血漿細胞因子水平檢測 末次Morris水迷宮試驗后，將各組大鼠進行麻醉，取各組大鼠外周血，離心分離血漿。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組血漿中白細胞介素(IL)-1β，IL-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，具體方法參照IL-1β，IL-6，TNF-α ELISA試劑盒說明書，其中IL-1β，IL-6，TNF-α ELISA試劑盒購于RD system公司。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 末次Morris水迷宮試驗后，將各組大鼠進行麻醉，取大腦海馬組織，采用10%甲醛溶液固定組織24 h，然后將固定的組織脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片。將制備的石蠟切片進行HE染色和TUNEL染色。將切片脫蠟固定后，使用山羊血清封閉，使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標記熒光檢測法，凱基生物)對大鼠海馬區細胞凋亡情況進行分析，具體方法參照試劑盒說明書。

1.5實時熒光定量PCR(RT-PCR) 末次Morris水迷宮試驗后，將各組大鼠進行麻醉，取大腦海馬組織，采用Trizol法提取海馬中RNA，然后反轉錄獲得cDNA，采用RT-PCR檢測海馬組織中細胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α mRNA表達水平。IL-1β引物：上游5′-GATGTCGAGAGTCCCAATGA-3′，下游5′-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3′；IL-6引物：上游5′-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3′，下游5′-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3′；TNF-α引物：上游5′-GGCTAATTCAGTTAGGCGGC-3′，下游5′-CGGAGGACTTTGTAATGCAC-3′。

1.6Western印跡檢測 末次Morris水迷宮試驗后，將各組大鼠進行麻醉，取大腦海馬組織，使用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液對組織進行裂解。使用Western印跡對裂解液中Aβ、剪切的多聚ADP-核糖聚合酶(cleaved PARP)-1、剪切的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、核因子κB抑制蛋白(IκB)α磷酸化及細胞核內NF-κB p65核積累量進行分析檢測，抗大鼠Aβ、cleaved PARP-1、cleaved-caspase3、代謝類蛋白(GAPDH)、IκBα、NF-κB p65、Lamin B1抗體均購于Abcam公司。

1.7統計學方法 采用GraphPad8.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后認知功能的影響 模型組術后2、3、4、5 d的Morris水迷宮測試逃避潛伏期較空白組顯著延長(P<0.05)，而治療組術后2、3、4、5 d Morris水迷宮測試逃避潛伏期較模型組顯著縮短(P<0.05)，見表1。

表1 各組術后不同時點Morris水迷宮測試逃避潛伏期的比較

2.2右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后血漿細胞因子水平的影響 與空白組比較，模型組血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，而治療組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 各組闌尾切除術術后5 d血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化

2.3右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后海馬組織細胞損傷的影響 空白組海馬區神經元細胞整齊規則有序致密，細胞形態大小正常，細胞核清晰可見且分布規則，模型組海馬區神經元細胞嚴重受損，排列無規則，細胞結構不清晰，細胞密度顯著下降，染色較深，觀察到神經細胞的核固縮，但是治療組海馬區神經元細胞受損程度相比于模型組顯著改善，見圖1。模型組海馬組織中Aβ蛋白表達(2.33±0.15)較空白組(0.07±0.02)升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，而治療組海馬組織中Aβ蛋白表達(1.12±0.09)較模型組下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組海馬組織HE染色(×400)

圖2 Western印跡檢測各組Aβ蛋白表達

2.4右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后海馬組織神經元細胞凋亡的影響 模型組海馬區凋亡細胞數目〔(25.68±5.39)個〕較空白組〔(3.89±1.92)個〕增加，而治療組海馬區凋亡細胞數目〔(14.82±3.71)個〕較模型組降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。模型組海馬組織中cleaved-caspase3和cleaved PARP1蛋白表達較空白組顯著增加，而治療組海馬組織中cleaved-caspase3和cleaved PARP1較模型組顯著下降(P<0.05)，見圖4、表3。

圖3 各組海馬組織凋亡細胞數目TUNEL染色(×400)

圖4 Western印跡檢測各組海馬組織cleaved PARP-1和cleaved-caspase3

表3 各組cleaved PARP1和cleaved caspase 3相對灰度值

2.5右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后海馬組織炎癥反應的影響 模型組海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表達水平較空白組顯著升高，而治療組海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表達水平較模型組顯著降低(P<0.05)，見表4、表5、圖5。

圖5 Western印跡檢測各組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達

表4 各組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平變化

表5 各組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達比較

2.6右美托咪定對老年大鼠闌尾切除術術后海馬組織NF-κB通路的影響 與空白組比較，模型組海馬組織中IκBα磷酸化水平、NF-κB p65蛋白表達升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組海馬組織中IκBα磷酸化水平、NF-κB p65蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖6、表6。

圖6 Western印跡檢測各組IκBα磷酸化、NF-κB p65蛋白表達

表6 各組IκBα磷酸化、NF-κB p65比較

3 討 論

認知功能損害是一種主要表現為注意力、記憶力和信息處理能力下降的圍術期認知功能障礙，嚴重影響了老年患者術后的生活質量。針對這類圍術期并發癥，加速康復外科的應用顯得尤為必要。加速康復外科理念是將圍術期有循證醫學證據的措施加以整合，將多個學科的最新研究證據相結合的一種集成新理念,它強調減少圍術期的各種應激，以促進患者術后各器官功能盡快康復、減少圍術期的各種并發癥、縮短患者的住院時間〔9〕。如術前更為人性化的心理疏導及術前準備，術中微創手術的實施，外科、麻醉科、麻醉護士的協調配合，術后的鎮痛，不安放或盡早拔除引流管等〔9〕。老年患者圍術期認知功能障礙主要是由于麻醉對神經元損傷引起的，因此合理的麻醉方式是針對老年患者加速康復外科的主要研究方向。

右美托咪定除了具有鎮定作用外，還具有抑制神經元細胞凋亡〔10〕。但是其對老年急腹癥術后認知功能的作用尚不得知。本研究在老年大鼠上行闌尾切除手術，通過Morris水迷宮檢測大鼠術后的空間學習能力。Morris水迷宮利用重復試驗評估學習和空間定位導航能力，已被證明是一種穩健可靠的測試并獲得廣泛認可，被廣泛應用在學習記憶，阿爾茨海默病、神經生物學等諸多領域〔11〕。Aβ的沉積不僅與神經元的退行性病變有關，而且可以激活一系列病理事件，具有很強的神經毒性作用。本研究結果表明右美托咪定能夠顯著改善老年大鼠闌尾切除術術后認知功能障礙。

神經炎癥是認知功能障礙發生的重要原因，而研究表明右美托咪定具有改善抑制炎癥反應的功能〔12,13〕。本研究結果表明，右美托咪定干預能夠顯著降低老年大鼠闌尾切除手術引發的機體炎癥及神經炎癥。NF-κB信號通路在炎癥反應中起重要作用，其控制轉錄的DNA、細胞因子產生。靜默狀態下NF-κB分子與IκB分子結合在一起，分布在細胞質中，當機體受到刺激后，IκB分子會發生磷酸化，磷酸化后的IκB與NF-κB分子分離，繼而NF-κB分子進入核內調控生物學活動。研究發現NF-κB信號通路通過促進水腫組織及創面中的炎癥反應，阻礙組織水腫恢復及創面愈合〔14,15〕。