喹諾酮類抗菌藥對細菌性角膜炎模型大鼠的干預效果及作用機制

陳果 宋穎輝 王華

(湖南省人民醫院 1眼視光中心，湖南 長沙 410000;2肝膽外科臨床實驗室)

細菌性角膜炎主要臨床表現為眼部紅腫、疼痛，視力水平下降，眼瞼流淚、分泌物較多〔1，2〕。常見的誘發細菌性角膜炎的致病菌包括細球菌、假單胞菌、葡萄球菌等，細菌性角膜炎癥狀具有發病較急、病情進展較快、嚴重程度較高的特點〔3，4〕。細菌性角膜炎得不到及時治療可能會發展為角膜組織穿孔，致使眼球組織萎縮〔5，6〕。近年來，伴隨社會經濟的不斷進步，人們生活水平及壓力不斷升高，導致細菌性角膜炎的發病率呈現不斷上升趨勢，但目前對其有效的治療方式還是以抗菌治療為主〔7，8〕，本文通過建立細菌性角膜炎大鼠模型，探討莫西沙星對其具體的干預效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，8～10月齡，平均(9.0±0.9)月齡；體重225～238 g，平均(231.8±5.2)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.9±2.5)℃的環境中喂養1 w，光照12 h/d。

主要試劑：兔抗小鼠toll樣受體(TLR)4抗體(艾美捷科技有限公司)；大鼠核轉錄因子(NF)-κB p65抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；小鼠抗大鼠白細胞介素(IL)-6、IL-1β抗體(北京匯智和源生物技術有限公司)；兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(上海紐普生物科技有限公司)；小鼠抗兔過氧化氫酶(CAT)抗體(上海博湖生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠丙二醛(MDA)抗體〔卡梅德生物科技(天津)有限公司〕；小鼠抗兔氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)抗體(上海瑞番生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 30只大鼠中挑選10只不進行處理的大鼠作為正常組。其余20只建立細菌性角膜炎模型：選擇大鼠左眼作為實驗眼，建模前3 d使用氧氟沙星滴眼預防感染，3次/d。對大鼠進行麻醉處理，使用環鉆于大鼠左眼角膜顳下方進行鉆切，鉆切深度至角膜組織1/3厚度位置，于切痕位置向大鼠角膜淺基質層內注射100 μl金黃色葡萄球菌，待大鼠直徑2 mm層間水腫、混濁區域后使用氧氟沙星眼膏涂抹大鼠左眼。將20只細菌性角膜炎大鼠隨機分為模型組、藥物干預組各10只，藥物干預組大鼠眼結膜下注射0.05 ml莫西沙星注射液，正常組、模型組大鼠眼結膜下注射等量蒸餾水，3組大鼠均連續干預14 d，觀察效果。

1.2.2角膜潰瘍面積、浸潤深度、中央厚度檢測 使用眼表活體共焦顯微鏡觀察各組大鼠角膜潰瘍面積、角膜浸潤深度，使用超聲角膜厚度測厚儀檢測角膜中央厚度，并進行組間比較。

1.2.3標本采集、蘇木素-伊紅(HE)染色 所有大鼠干預結束后，取各組大鼠尾部靜脈血2 ml,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環境中保存待檢。對各組大鼠采用頸椎脫臼法處死后，取各組大鼠角膜組織，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片。首先將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察，統計角膜炎癥細胞計數。

1.2.4角膜炎癥指數檢測 角膜炎癥指數評價項目包括病灶面積、病變深度兩項。病灶面積：1分：病灶面積在角膜組織占比<25%；2分：病灶面積在角膜組織占比≥25%且<50%；3分：病灶面積在角膜組織占比≥50%且<75%；4分：病灶面積在角膜組織占比≥75%。病變深度：1分：虹膜、瞳孔清晰，角膜混濁程度較輕；2分：角膜組織較為混濁，通過病灶能夠觀察到虹膜、瞳孔；3分：角膜組織不透明，混濁不均勻；4分：角膜組織混濁致密且均勻。

1.2.5Western印跡檢測TLR4、NF-κB p65相對表達量 提取50 μg蛋白，凝膠電泳、轉膜，取膜，4℃下固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(TLR4、NF-κB p65一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，TBST連續洗膜3次，處理5 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平 將待測血清標本置于室溫后，先將血清樣本放置于試管中，并采用稀釋液進行稀釋。在反應孔內將稀釋好的55 μl標準品加入其中，于常溫中進行100 min的孵育。使用洗滌液來進行洗滌3次，隨后將50 μl的抗體工作液加入至其中，置于恒溫環境中進行60 min的孵育。洗滌后加入120 μl的終止液，最終于450 nm波長出測定吸光度，繪制IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.7散射比濁法檢測CAT、MDA、OX-LDL水平 對提取的待測標本在凝固的過程中發生變化的散射光確定檢測，在光探檢測器為90°直角的單色光源中向血清樣本加凝血激活劑，在樣品凝塊的過程中，散射光的強度會慢慢增加，當血清樣本完全凝固后，光探測器會發生變化，會送到檢測器上處理并且描出凝固曲線后檢測CAT、MDA、OX-LDL水平變化。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行F值檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組角膜組織病理學觀察 如圖1所示，正常組角膜組織上皮細胞排列整齊，結構完整，無炎性細胞浸潤現象；模型組角膜組織上皮細胞排列較為雜亂，膠原纖維腫脹，炎性細胞浸潤現象嚴重；藥物干預組角膜組織膠原纖維排列較為整齊，炎性細胞浸潤現象明顯減輕。

圖1 各組角膜組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.2各組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度對比 如表1所示，與模型組比較，藥物干預組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度、角膜炎癥指數、炎癥細胞密度及TLR4、NF-κB p65相對表達量對比

2.3各組角膜炎癥指數、炎癥細胞密度比較 如表1所示，與正常組比較，模型組、藥物干預組角膜炎癥指數、炎癥細胞密度顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預組角膜炎癥指數、炎癥細胞密度降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組TLR4、NF-κB p65相對表達量對比 如表1、圖2所示，與正常組比較，模型組、藥物干預組TLR4、NF-κB p65相對表達量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預組TLR4、NF-κB p65表達降低，具有統計學差異(P<0.05)。

圖2 各組TLR4、NF-κB p65表達

2.5各組IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較 如表2所示，與正常組比較，模型組、藥物干預組IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預組IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

2.6各組CAT、MDA、OX-LDL水平比較 如表3所示，與正常組比較，模型組、藥物干預組CAT水平降低，MDA、OX-LDL水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預組CAT水平升高，MDA、OX-LDL水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組CAT、MDA、OX-LDL水平比較

3 討 論

隨著目前臨床糖皮質激素、抗生素等藥物的濫用，克雷白桿菌、葡萄球菌、草綠色鏈球菌等細菌誘發的感染與日俱增，引起廣大專家學者的關注。近年來，我國細菌性角膜炎癥狀發病率一直居高不下，據不完全統計，我國每年新增細菌性角膜炎病例數高達數十萬〔9～11〕。臨床常用的治療細菌性角膜炎的手段為抗菌治療〔12〕。喹諾酮類抗菌藥是臨床常用的抗菌藥物，主要以細菌DNA為靶點，對革蘭陰性菌具有較強的殺滅作用，莫西沙星為第四代喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌能力強的特點〔13～15〕。

細菌性角膜炎作為一種眼部細菌感染性疾病，主要表現為角膜組織潰瘍性病變〔16〕。本研究結果說明，使用莫西沙星進行干預，能夠促進大鼠角膜組織潰瘍修復，改善細菌性角膜炎大鼠角膜組織厚度。細菌性角膜炎與角膜組織炎癥反應密切相關〔17〕，本研究結果顯示，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星對細菌性角膜炎大鼠進行干預，大鼠角膜炎癥指數、炎癥細胞密度顯著降低，出現這一研究結果的原因可能是因為使用莫西沙星進行干預調控炎癥通路。

TLR4/NF-κB信號通路參與機體炎癥反應、細胞凋亡等病理過程〔18,19〕。本研究結果說明，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星進行干預能夠調控TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達，減輕下游炎癥因子水平，減輕細菌性角膜炎大鼠角膜組織炎癥反應，從而發揮干預效果。

有研究表明，角膜炎癥狀的發生發展伴隨著角膜組織氧化應激損傷。減輕氧化應激損傷是治療角膜炎癥狀嚴重程度的關鍵〔20，21〕。CAT、MDA、OX-LDL是臨床較為常用的評價機體抗氧化能力的指標。本研究結果說明使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星能夠有效緩解氧化應激損傷程度，干預效果較好。

綜上，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星對細菌性角膜炎模型大鼠進行干預，能夠促進大鼠角膜組織潰瘍修復，減輕大鼠角膜組織炎癥反應，從而減輕細菌性角膜炎大鼠角膜組織氧化應激損傷，其功能可能與調控TLR4/NF-κB信號通路及下游炎癥因子水平有關。