基于TGF-β/Smad信號通路研究NF-κB在電針抗慢性疲勞綜合征中的作用及機制

韓玲 顏志浪 胡美鳳

(1宜春學院，江西 宜春 336000；2江西中醫藥大學科技學院；3南昌市洪都中醫院)

慢性疲勞綜合征(CFS)是以極度疲勞為特征的一種證候群，持續或反復發作，且在運動后加重，經充分休息不能緩解，嚴重影響人們的學習、工作和生活。現有研究顯示炎癥反應和氧化應激可能與 CFS 的發病有關，而核轉錄因子(NF)-κB可以調節細胞內炎癥反應和氧化應激，有可能參與CFS的發病過程〔1,2〕。針刺作為傳統的特色醫療手法，臨床用于治療CFS已顯示出較好的療效，有研究顯示針刺治療CFS的機制可能是通過抑制腦組織炎性反應〔3,4〕。本研究觀察電針干預對CFS大鼠的改善作用，并基于轉化生長因子(TGF)-β/Smad信號通路探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 36只SPF級健康雄性SD大鼠，體重200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。

1.1.2實驗試劑 褪黑素ELISA試劑盒，美國ADL公司生產；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所；兔抗 TGF-β、Smad、NF-κB p65 抗體，武漢博士德生物科技有限公司生產；多辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G，北京中杉金橋生物科技有限公司生產；電化學發光(ECL)試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3實驗儀器 華佗牌一次性針灸針，蘇州醫療用品有限公司生產，規格0.3 mm×25 mm；G6805-2電針治療儀，常州市武進長城醫療器械有限公司；EPS300 型電泳儀，上海天能科技有限公司；MT-20水迷宮圖像跟蹤系統，成都泰能科技有限公司生產；TES-1350A 型噪音計，臺灣泰仕公司；PCR 反應擴增儀，美國 Bio-Rad 公司；Tanon-4200SF型數碼凝膠圖像分析系統，上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1造模 36只大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組，模型組、電針組采用力竭游泳加慢性復合應激刺激多重因素制備CFS模型。正式造模前，先將大鼠置于水溫(25±2)℃，深 35 cm 的水池中適應性游泳 3 d，每次游泳 20 min，1次/d；適應后大鼠尾部負重體重5%的鉛塊，在水池中游泳至力竭；大鼠負重游泳后，按照隨機數字表法進行兩種慢性刺激，包括：禁水12 h，禁食12 h，夾尾1 min，通宵照明和噪聲刺激(110 dB，1 h)。

1.2.2電針治療方法 于造模14 d后對大鼠進行針刺治療，穴位：雙側感覺區、百會穴、寧神穴，用0.35 mm×25 mm毫針快速刺入皮下15 mm，連接電針儀并調節為連續波，每次30 min，1次/d，連續治療14 d。對照組不給予任何干預，模型組每天給予電針組相同時間的捆綁，不予治療。

1.3觀察指標

1.3.1鼠尾懸掛實驗 大鼠呈倒掛狀，尾端1 cm處固定于一水平木板上，兩側用木板隔開動物視線。記錄大鼠在6 min內的靜止時間(大鼠完全靜止不動狀態的總時間)及掙扎次數(大鼠向上翻轉的總次數)。

1.3.2力竭游泳實驗 將大鼠置入游泳池，水溫(20±1)℃，記錄大鼠從入水至游泳力竭的時間(頭部沉入水中10 s未浮出水面)。

1.3.3水迷宮實驗 使用水迷宮跟蹤系統，記錄大鼠從入水到爬上平臺所需時間(超過120 s按120 s記錄)、有效區停留時間。

1.3.4采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿褪黑素含量 治療結束第2天進行，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，從0∶00起每4 h采樣1次(0∶00、4∶00、8∶00、12∶00、16∶00、20∶00)，取股動脈血樣，置于抗凝管中，靜置20 min，離心15 min(4℃，3 000 r/min)，取上清液，按試劑盒說明書采用ELISA進行檢測。

1.3.5免疫組化法(IHC)檢測NF-κB p65蛋白表達 大鼠麻醉，生理鹽水灌注后冰上迅速取出腦海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復，3%過氧化氫(H2O2)浸泡10 min，封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育 30 min，加適量二氨基聯苯胺(DAB)，蘇木素復染 1.5～2.0 min，乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果，每組重復測量 3 次。

1.3.6熒光定量PCR(qPCR)技術檢測TGF-β1、Smad mRNA表達 取大腦海馬組織，提取組織總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作。反應條件：95℃，45 s，95℃ 15 s，60℃，40 s，進行45個循環。引物序列：TGF-β1正向引物：5′-GGTCACCTGTCCCCTCTCCT-3′，反向：5′-CTGGAGTGTCCATGGGACAG-3′；Smad4正向引物：5′-CAACATCCACCAAGTAATCGC-3′，反向：5′-CTCTCAATAGCTTCTGTCCTG-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACCC-3′。每組進行3次測定，取平均值，圖像分析儀掃描凝膠密度，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.3.7Western印跡檢測TGF-β、Smad蛋白表達 取大腦海馬組織，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，在低溫環境下進行研磨、充分裂解，離心15 min(4℃、12 000 r/min)，取上清液。用 BCA 法進行蛋白定量，通過電泳、轉膜、脫脂、封閉、剪膜，加入一抗TGF-β、Smad、GAPDH，4℃ 孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育 2 h，TBST 洗滌，用ECL試劑顯色后，化學發光儀成像。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1電針對CFS大鼠鼠尾懸掛靜止時間及掙扎次數、力竭游泳時間影響 與對照組比較，模型組靜止時間明顯延長、掙扎次數明顯減少，力竭游泳時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，電針組靜止時間明顯縮短，掙扎次數明顯增多，力竭游泳時間明顯延長(P<0.01)。見表1。

表1 電針對CFS大鼠鼠尾懸掛靜止時間及掙扎次數、力竭游泳時間影響

2.2電針對CFS大鼠水迷宮用時及有效區停留時間影響 與對照組比較，模型組水迷宮用時明顯延長，有效區停留時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠水迷宮用時明顯縮短，有效區停留時間明顯延長(P<0.01)。見表2。

表2 電針對CFS大鼠水迷宮用時及有效區停留時間影響

2.3電針對CFS大鼠褪黑素含量的影響 與對照組比較，模型組褪黑素含量變化趨勢明顯不同，其中4∶00 褪黑素含量明顯高于對照組，日間含量明顯低于對照組，晝夜波動程度明顯減弱；與模型組比較，電針組褪黑素含量晝夜波動程度增大，變化趨勢與空白組基本一致，下半夜含量降低，4∶00降低明顯，而白天褪黑素含量升高。見表3。

表3 不同時間電針對CFS大鼠褪黑素含量的影響

2.4電針對CFS大鼠海馬區可見NF-κB p65蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組海馬區NF-κB p65陽性表達細胞數量明顯增加，顏色較深(P<0.01)；與模型組比較，電針組海馬區 NF-κB p65陽性細胞表達明顯減少，顏色較淺(P<0.01)。見表4。

2.5電針對CFS大鼠海馬區TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組海馬區TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達明顯增加(P<0.01)，與模型組比較，電針組海馬區TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見表4、圖1。

表4 電針對CFS大鼠蛋白及mRNA表達的影響

圖1 電針對CFS大鼠TGF-β1、Smad4 蛋白表達的影響

3 討 論

頭針作為一種常見的針刺療法，可以調神益智、醒腦開竅、改善肢體功能，頭針結合電刺激可以加強刺作用，更有效的改善大腦功能〔5,6〕。鼠尾懸掛實驗掙扎次數可反映大鼠的體力狀況，靜止時間可反映大鼠的絕望情緒〔7〕，常用以評價動物的心理抑郁程度。力竭游泳實驗可以判斷大鼠的體力情況，用以評價動物體力及是否疲勞。水迷宮實驗是目前最常用于評價動物學習和記憶能力的方法。3個實驗結合可以全面評價大鼠的軀體和心理疲勞狀態。本研究說明大鼠出現心理、體力不同程度的疲勞；力竭游泳時間縮短，說明慢性疲勞大鼠出現了體力疲勞癥狀，水迷宮用時延長，有效區停留時間縮短，說明大鼠出現了學習、記憶能力的下降；3個實驗反映了大鼠體力、學習記憶力的下降和情緒反應的改變，即“軀體疲勞”和“心理疲勞”狀態，經過電針雙側感覺區、百會穴、寧神穴治療后，大鼠鼠尾懸掛實驗靜止時間縮短，掙扎次數增加，力竭游泳時間延長，水迷宮平臺潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，說明電針可顯著改善CFS大鼠的軀體疲勞和學習記憶能力。

褪黑素的晝夜分泌節律是維持人體睡眠-覺醒節律的生理基礎，可通過調節睡眠狀態改善認知功能，維持正常的神經心理狀態〔8,9〕。褪黑素晝夜分泌節律異常與CFS睡眠障礙、認知功能下降、情緒障礙等臨床表現較為相似，所以臨床常用外源性的褪黑激素治療CFS〔10〕。本研究說明電針可以恢復CFS大鼠褪黑素的晝夜節律紊亂，改善大鼠的睡眠障礙。

NF-κB信號通路可在各階段介導炎性反應，是機體炎性反應的關鍵指標〔11〕。NF-κB主要以 p50/p65 二聚體形式存在，其中NF-κB p65含轉錄活化區，參與基因轉錄的起始調節。當機體受到刺激，NF-κB 便移位于細胞核，并促進多種炎癥因子如TNF、IL-1β 及TGF-β1 的釋放〔12,13〕。本研究結果提示海馬區炎性改變可能與CFS的發病相關，電針治療可降低海馬區的NF-κB p65蛋白表達，說明電針治療可以抑制CFS大鼠海馬區的炎性反應。TGF-β 對細胞具有雙向調節作用，同時參與體內生理生化、信號轉導與調控，對神經系統具有一定的保護作用〔14,15〕。有研究表明，腦內 TGF-β 水平升高可產生疲勞感覺，在 CFS患者的腦脊液中發現TGF-β 水平的增加，所以推測CFS發病與TGF-β 水平升高相關。Smad是TGF-β超家族信號傳導成員，負責將TGF-β超家族信號從細胞內傳遞到細胞核。有研究表明 CFS 海馬中 Smad4呈現高表達〔16〕，在 TGF-β 當作配體的受體復合物激活下 Smads 進入核內，共同調節靶基因的轉錄。本研究提示電針對 CFS 模型大鼠治療作用機制可能與 TGF-β/Smad 信號通路有關。