硒代胱氨酸逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌TKI靶向藥物耐藥體外抗腫瘤的作用機(jī)制

劉露 董健 張勇 尹新潔

(1華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院，湖北 武漢 430100；2湖北省荊門(mén)市第一人民醫(yī)院)

相關(guān)流行病數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)指出，2016年在世界范圍內(nèi)有140萬(wàn)人由于肺癌而失去生命，并且有超過(guò)180萬(wàn)例肺癌的發(fā)病人群，肺癌使人類(lèi)的生存健康及日常生活均受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)〔1〕。此外，就我國(guó)國(guó)內(nèi)臨床的情況來(lái)看，牽涉到社會(huì)人口結(jié)構(gòu)老齡化并且吸煙的情況沒(méi)有顯著好轉(zhuǎn)，導(dǎo)致肺癌疾病在局部地區(qū)的發(fā)展趨勢(shì)較不樂(lè)觀(guān)，因此醫(yī)學(xué)界正在積極應(yīng)對(duì)肺癌帶來(lái)的不良影響，不斷優(yōu)化臨床肺癌相關(guān)的治療方案。近年來(lái)提出的靶向治療方法應(yīng)用非常廣泛，其也能夠作為治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在特定病理階段的主要方式之一，臨床的反饋表示其具有靶向精準(zhǔn)及安全性明確等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，靶向藥物中的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)在肺癌的臨床治療中使用較多〔2～5〕。TKI治療機(jī)制涉及其通過(guò)突變的表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)導(dǎo)致酪氨酸活化過(guò)程出現(xiàn)異常從而精確對(duì)于EGFR的磷酸化過(guò)程進(jìn)行阻斷，并且通過(guò)影響和細(xì)胞凋亡存在聯(lián)系的信號(hào)通路表達(dá)，加速肺癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，由于該類(lèi)藥物具有較為確切的療效，現(xiàn)已作為EGFR陽(yáng)性肺癌患者首選治療藥物〔6〕。但通過(guò)臨床用藥的長(zhǎng)期觀(guān)察，在患者治療進(jìn)行至8個(gè)月左右之后會(huì)出現(xiàn)與耐藥相關(guān)的一系列情況，這是影響療效的一大因素〔7〕。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體及人體中必要的微量元素“硒”在一些腫瘤疾病的預(yù)防和治療中意義重大，并且其對(duì)于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥現(xiàn)象存在一定效果〔8～10〕，就其對(duì)于NSCLC耐藥及體外抗腫瘤的作用鮮見(jiàn)研究。本研究探討硒代胱氨酸逆轉(zhuǎn)NSCLC TKI靶向藥物耐藥體外抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 人NSCLC NCI-H1975 細(xì)胞株(購(gòu)自上海歌凡生物細(xì)胞庫(kù))；硒代胱氨酸(SeC，購(gòu)自河南康之旺生物科技有限公司)；吉非替尼(GEFITINIB)片(批準(zhǔn)文號(hào)：H20090759，購(gòu)自齊魯藥業(yè))；胰酶(購(gòu)自遼寧天醫(yī)生物制藥有限公司)；胎牛血清(FBS，購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(均購(gòu)自天津銳爾康生物科技有限公司)；單體三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白(p-Ras)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、p-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、p-蛋白激酶B(Akt)一抗及二抗(均購(gòu)自英國(guó)Biorbyt)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(購(gòu)自常州金壇良友儀器有限公司)；小型800D離心機(jī)(購(gòu)自常州天瑞儀器有限公司)；SH1000型酶標(biāo)儀(購(gòu)自中國(guó)天美科學(xué)儀器有限公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司)；EPS-300型電泳儀(購(gòu)自上海天能科技有限公司)；BOT-860型凝膠成像儀(購(gòu)自北京中儀博騰科技有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將NSCLC細(xì)胞放置于室溫條件的恒溫水浴鍋中復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，其中含有FBS、適量鏈霉素和青霉素的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，于5%濃度CO2、室溫、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期收集細(xì)胞為研究對(duì)象。

1.3檢測(cè)SeC對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖影響 使用胰酶對(duì)對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化，孵育完成即添加完全培養(yǎng)液進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備，將細(xì)胞調(diào)整為2×105個(gè)/ml接種在96孔板，滴加SeC濃度分別為0、5、10、15、20、25 μmol/L各200 μl，各梯度的濃度設(shè)置6復(fù)孔，孵育至24、48、72 h，進(jìn)行MTT添加，繼續(xù)進(jìn)行4 h的培養(yǎng)，后使用2 000 r/min的離心機(jī)10 min，得到沉淀后向其中添加二甲基亞砜(DMSO)共同震蕩使其溶解，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-給藥組OD /對(duì)照組OD)×100%。

1.4檢測(cè)SeC對(duì)NSCLC細(xì)胞耐藥影響 使用胰酶對(duì)于對(duì)數(shù)期NSCLC細(xì)胞進(jìn)行消化，孵育完成即添加完全培養(yǎng)液進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備，將細(xì)胞調(diào)整為2×105個(gè)/ml接種在96孔板，設(shè)置GEFITINIB組、預(yù)處理+SeC+GEFITINIB組、SeC+GEFITINIB組、預(yù)處理+GEFITINIB組，各組6復(fù)孔，GEFITINIB組添加0.5 μmol/L GEFITINIB溶液100 μl；預(yù)處理+SeC+GEFITINIB組先運(yùn)用SeC進(jìn)行預(yù)處理，然后添加15 μmol/L SeC 100 ml和0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl；SeC+GEFITINIB組直接添加15 μmol/L SeC 100 ml和0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl；預(yù)處理+ GEFITINIB組運(yùn)用SeC進(jìn)行預(yù)處理，孵育0.5 h，添加0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl。孵育48 h后MTT檢測(cè)各組的OD值，計(jì)算IC50 值，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=GEFITINIB組IC50/SeC預(yù)處理組IC50。

1.5檢測(cè)SeC對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡的影響 按照上述步驟對(duì)細(xì)胞孵育24 h，分為對(duì)照組、GEFITINIB組、SeC組及SeC+GEFITINIB聯(lián)合用藥組，GEFITINIB組中添加200 μl的濃度為0.1 μmol/L GEFITINIB，SeC組添加200 μl的濃度為15 μmol/L的SeC，SeC+GEFITINIB聯(lián)合用藥組先用SeC預(yù)處理，然后添加15 μmol/L的SeC 和0.1 μmol/L的GEFITINIB，對(duì)照組添加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，72 h添加胰酶消化，離心棄上清后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，進(jìn)行重懸后添加由熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V ，經(jīng)固定后離心棄乙醇進(jìn)行PBS重懸，15 min孵育結(jié)束添加碘化丙啶(PI)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行各組細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。

1.6Western印跡檢測(cè)各組NSCLC細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白的水平 細(xì)胞培養(yǎng)和分組同上，添加裂解液BCA定量試劑盒檢測(cè)總蛋白，電泳儀進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后添加5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉再添加鼠 p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt一抗(1∶800)，β-Actin為內(nèi)參，孵育后添加羊抗鼠 Ig G二抗(1∶2 000 )孵育，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯、定影，凝膠成像分析儀進(jìn)行電泳結(jié)果的分析，計(jì)算蛋白水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SeC對(duì)NSCLC細(xì)胞體外增殖的影響 與SeC 0 μmol/L組相比，培養(yǎng)各時(shí)間段時(shí)SeC 0、5、10、15、20、25 μmol/L組NSCLC細(xì)胞OD值均明顯下調(diào)(P<0.05)，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率明顯上調(diào)(P<0.05)，并且SeC的劑量越大，培養(yǎng)的時(shí)長(zhǎng)越久該差異性越顯著。通過(guò)計(jì)算得知48 h時(shí)SeC對(duì)于NSCLC細(xì)胞IC50、IC15數(shù)值分別為20.40 μmol/L、15.60 μmol/L，因此本研究接下來(lái)步驟選擇15 μmol/L 為SeC濃度。見(jiàn)表1。

表1 SeC對(duì)于NSCLC體外增殖的影響

2.2比較各給藥培養(yǎng)方式對(duì)NSCLC細(xì)胞耐藥性影響 GEFITINIB組、預(yù)處理+SeC+GEFITINIB組、SeC+GEFITINIB組、預(yù)處理+GEFITINIB組IC50水平分別為：(0.27±0.04)μmol/L、(0.02±0.01)μmol/L、(0.04±0.01)μmol/L、(0.06±0.01)μmol/L。SeC可顯著逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對(duì)GEFITINIB藥物的耐藥程度(P<0.05)，各組細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為預(yù)處理+SeC+GEFITINIB組(13.50)>SeC+GEFITINIB組(6.75)>預(yù)處理+GEFITINIB組(4.50)，差異具有顯著性(P<0.05)。

2.3各組NSCLC細(xì)胞凋亡率比較 SeC組、GEFITINIB組及SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞的凋亡率均較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)；與SeC組比較，GEFITINIB組及SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞凋亡率均顯著上升(P<0.05)；與GEFITINIB組比較，SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡流式圖

2.4各組NSCLC細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白水平比較 SeC組、GEFITINIB組及SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞中的p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt蛋白水平均較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；GEFITINIB組及SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞中的p-Ras、p-ERK及p-PI3K、p-Akt均較SeC組表達(dá)顯著下降(P<0.05)；SeC+GEFITINIB聯(lián)用組培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞中的p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt較GEFITINIB組表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率及NSCLC細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白水平比較

1～4:對(duì)照組，SeC組，GEFITINIB組，SeC+GEFITINIB聯(lián)合組圖2 Western印跡檢測(cè)各組NSCLC細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白

3 討 論

NSCLC是一類(lèi)對(duì)于人類(lèi)健康具有嚴(yán)重威脅的疾病，適用手術(shù)的患者局限。相較于放、化療有顯著幫助，但其具有不可忽視的毒副作用〔11〕。近年來(lái)腫瘤治療的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向了靶向藥物治療，GEFITINIB作為T(mén)KI類(lèi)藥物用作治療NSCLC取得了相當(dāng)?shù)寞熜В瑫r(shí)其于治療期產(chǎn)生的耐藥性也不容忽視，因?yàn)檫@涉及臨床治療結(jié)局〔12〕。耐藥性的產(chǎn)生有原發(fā)和繼發(fā)兩種類(lèi)型，原發(fā)性產(chǎn)生與EGFR信號(hào)通路中PTEN功能減弱及K-ras分子的突變等變化相關(guān)，繼發(fā)性產(chǎn)生與腫瘤微環(huán)境的變化及促癌性基因的表達(dá)增加等相關(guān)〔13〕。因此逆轉(zhuǎn)靶向藥物在機(jī)體中產(chǎn)生的耐藥性是提高療效、確保臨床安全的必要舉措。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，硒代胱氨酸可以抑制相關(guān)蛋白活性，對(duì)乳腺癌腫瘤紫杉醇耐藥進(jìn)行抑制，此外，硒代胱氨酸還可以控制多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)水平來(lái)對(duì)相關(guān)藥物治療胰腺癌耐藥效果進(jìn)行改善〔14～16〕。就其對(duì)于NSCLC耐藥及體外抗腫瘤的作用鮮見(jiàn)研究。

本研究結(jié)果提示，SeC對(duì)于 NSCLC細(xì)胞的體外增殖具有顯著的控制效果，且依賴(lài)劑量和時(shí)間的特征明顯。 通過(guò)SeC對(duì)NSCLC細(xì)胞耐藥影響進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示行SeC預(yù)處理再進(jìn)行SeC+GEFITINIB聯(lián)合用藥得到的耐藥性逆轉(zhuǎn)效果最佳。本研究結(jié)果提示，SeC有顯著的促腫瘤細(xì)胞凋亡效果，并且其與GEFITINIB聯(lián)用會(huì)進(jìn)一步對(duì)其促進(jìn)凋亡的效果進(jìn)行增強(qiáng)，協(xié)同治療作用顯著。

TKI靶向藥對(duì)于EGFR具有抑制作用，EGFR于NSCLC 細(xì)胞中具有較高的水平，其機(jī)制涉及其控制Ras-Raf-MEK-ERK及PI3K-Akt通路對(duì)NSCLC 細(xì)胞的血管生成、增殖及轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生影響，TKI靶向藥通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞周期的阻滯導(dǎo)致凋亡加速，從而發(fā)揮抗腫瘤效果〔17,18〕。PI3K-Akt通路的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)子涉及PI3K、Akt等，眾多與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究都發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮的重要角色。Ras-Raf-MEK-ERK通路能夠?qū)τ谀[瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，通路相關(guān)蛋白磷酸化的程度越大，通路的活化程度就越大〔19,20〕。本研究結(jié)果提示，SeC+GEFITINIB聯(lián)用可以降低NSCLC細(xì)胞中上述的蛋白表達(dá)，下調(diào)Ras-Raf-MEK-ERK及PI3K-Akt通路表達(dá)或許是SeC逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)機(jī)制，具體調(diào)控的分子級(jí)聯(lián)效應(yīng)有待進(jìn)一步研究討論。

綜上，硒代胱氨酸能夠一定程度上逆轉(zhuǎn)NSCLC TKI靶向耐藥性，其在體外抗腫瘤的機(jī)制涉及抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt蛋白的胞內(nèi)水平有關(guān)。