腦梗死模型大鼠血清中GAP-43、TNF-α和血管形成素-1表達水平

方建偉 李愛芹

(承德市中心醫院神經內科，河北 承德 067000)

近年來腦梗死發病率和致殘率持續升高，嚴重影響了患者的生活質量，給患者家庭帶來沉重負擔，也給社會帶來很大壓力〔1,2〕。腦梗死不僅會使大腦細胞死亡，更會破壞血腦屏障，使其失去阻擋多種物質進入腦部組織的作用，使腦脊液的物質成分和比例失衡，引起其他疾病〔3,4〕。生長相關蛋白(GAP)-43與神經細胞再生和突觸發育關系密切。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種對正常細胞無明顯毒副作用，卻可以殺死非正常細胞的因子，還可促進細胞增殖分化，增強有絲分裂原或外來抗原刺激B細胞的增殖和Ig分泌〔5〕。血管形成素(Ang)-1是神經細胞損傷后間質血管新生的蛋白質，可促進間質的肉芽組織的形成，還可改善局部血液循環，保護神經細胞的正常功能〔6〕。本文探討腦梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表達水平的變化及其神經功能的變化。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選擇SD健康雄性大鼠40只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。其年齡10～11周齡，平均(10.3±0.5)周齡，體重220～250 g,平均(236.6±12.4)g，飼養溫度為22～25℃，室內濕度35%～40%，飼養室定時予紫外線消毒。并飼喂統一標準飼料，自由活動。選取15只作為對照組，不做任何處理。剩下的20只做成腦梗死模型，為腦梗死模型組。另外養5只大鼠備用，避免實驗動物因實驗過程中出現死亡及其他因素導致的動物死亡，進而保證數據的完整性。本研究所做實驗均獲得醫院倫理會批準。

1.2模型制備 將除去對照組的15只大鼠禁食不禁水飼養12 h，然后給予10%的水合氯醛麻醉，用線栓法將麻醉的大鼠制作大鼠腦梗死動物模型。把大鼠仰臥固定在實驗臺上，充分暴露其頸部皮膚，用75%的酒精消毒后，打開大鼠頸部皮膚，利用分離針分離出頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在遠心端結扎頸外動脈，然后在頸內動脈遠心端和頸總動脈近心端，用動脈夾阻斷循環血流。將頸外動脈在結扎處剪斷，從剪斷處插入栓線，直至頸內動脈處，然后打開頸內動脈夾，繼續推進栓線，直到遇到阻力，當阻斷大腦中動脈血流后，繼續將栓線深插入18～20 mm，最后固定栓線并縫合皮膚。2 h后再次用10%的水合氯醛麻醉大鼠，把栓線拔出來，縫合傷口，75%酒精消毒。模型制備完成后，給予大鼠抗感染護理，讓其自由攝食和飲水。大鼠蘇醒后，左側表現為Horner征，提尾時右側前肢內收屈曲,右前爪不能伸展或存在右側轉圈障礙，則建模成功。手術過程中，死亡2只，感染1只，另外還有1只建模失敗，其神經病理癥狀不明顯，予以剔除。備用大鼠補上，以保證數據的完整性。

1.3酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠血清中GAP-43的水平 抽取各組大鼠清晨空腹靜脈血3 ml，使用離心機離心處理10 min，轉速為3 000 r/min，分離出血清和紅細胞；加入乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素，3 000 r/min離心10 min,取上清液；再3 000 r/min離心10 min，取組織勻漿，加入生理鹽水中，搗碎，3 000 r/min離心10 min,取上清液。于-20℃冰箱中保存,待檢。運用酶聯免疫法測定血清GAP-43的水平。在測定時，嚴格按照GAP-43試劑盒說明書進行操作，把待測樣本加入GAP-43試劑盒中，血清中受檢測物質與固相載體上的酶量充分結合，并成一定的比例，用洗滌的方法除去雜質，加入微孔板酶標儀中，其形成的復合物中加入酶反應的底物，最后形成有色產物，通過比色檢測血清中GAP-43的量，進行接下來的指標水平比較。

1.4電化學發光免疫分析法檢測血清TNF-α、Ang-1的水平 嚴格按照化學發光免疫分析儀操作步驟進行操作。采用i2000全自動微粒子化學發光免疫分析儀及其配套試劑進行檢測。將魯米諾發光底液加入待測樣本中，與辣根過氧化物酶(HRP)反應后，形成中間體，處于激發狀態的中間體穩定后，會發射光子。然后使用發光信號測量儀測量光子數值，檢測TNF-α、Ang-1的水平。

1.5RT-PCR技術檢測GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA表達水平 操作過程嚴格按照定量PCR儀的操作說明書進行。首先加入稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μl，然后加入MgCl2溶液1.5 μl，之后加入上游引物和下游引物各0.5 μl，混勻后加入水至25 μl。分別放在94℃、55℃和72℃的環境中各反應1 min，此循環連續進行35次，最后在72℃環境中反應延長5 min，重復3次以上。采用2-△△Ct方法計算出需要檢測GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA的表達水平。

1.6大鼠改良神經功能缺損評分(mNSS) 參照劉雙鳳等〔7〕對大鼠神經功能mNSS的方法，檢測對照組大鼠、腦梗死大鼠造模后1 d、3 d、7 d的神經功能，包括提尾試驗3分，將老鼠放于地板行走試驗3分，感覺試驗2分、平衡木試驗6分，反射活動和異常運動試驗4分，5個方面的神經功能mNSS，評分滿分為18分。得分越高其神經功能損傷越嚴重。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色測定腦梗死體積 造模成功后對各組大鼠進行10%水合氯醛腹腔麻醉，對大鼠右心室進行快速灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)，隨即斷頭取腦，在4%多聚甲醛中固定48 h之后放于模具之中，并沿冠狀進行切片，向前囟方向切片2張，向小腦方向切片3張，切片保證每片厚約2 mm，并做石蠟包埋處理。對所取大鼠腦組織切片做HE染色，并使用數碼相機進行拍攝，利用Image-PmPlus6.0圖像分析系統對大鼠腦梗死體積比例進行計算。大鼠腦梗死體積=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區大腦半球的體積)/正常側大腦半球體積。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達比較 對照組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA水平在各時間段無統計學意義(P>0.05)。大鼠造模后，其腦梗死1 d、7 d、14 d時GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)；腦梗死7 d時大鼠GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達水平明顯高于腦梗死1 d時，腦梗死1 d時GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達水平明顯高于腦梗死14 d時(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達比較

2.2兩組mNSS及腦梗死體積比較 對照組mNSS及腦梗死體積在各時間段無統計學意義(P>0.05)。腦梗死1、7、14 d的大鼠mNSS均明顯高于對照組(P<0.05)；且腦梗死1 d大鼠mNSS明顯高于腦梗死7 d大鼠，腦梗死7 d大鼠mNSS明顯高于腦梗死14 d大鼠(P<0.05)；腦梗死1、7 d的大鼠腦梗死體積均明顯高于腦梗死14 d大鼠(P<0.05)。見表2。

表2 兩組mNSS及腦梗死體積比較

3 討 論

腦梗死治療后高復發率、高死亡率及高致殘率，極大影響了患者的生活質量〔8〕。有資料顯示，腦梗死的發病率有明顯上升并呈現年輕化的趨勢。所以，加深對腦梗死的研究可以為腦梗死的臨床判斷和治療提供重要的參考價值，也可為疾病的治療提供新的思路和方法〔9～11〕。正常情況下，腦毛細血管與腦細胞之間存在血腦屏障，血腦屏障可以有效阻止有害物質進入腦組織，進而避免腦組織損傷，或降低有害物質的侵害。依靠這種方式，維持了腦組織內環境的穩態，這對于生物的生存有著重要的意義〔12,13〕。然而，當腦梗死后發生，血清中炎癥介質明顯升高，氧自由基及蛋白水解酶等大量增加，會對微血管內皮細胞進行破壞，進而導致血腦屏障通透性增加，有害物質會隨著血液循環進入腦組織，這樣對腦組織造成嚴重損傷，尤其是在腦神經元再生過程中，呈現出物質表達水平及交換速度加快情況，腦組織內環境穩態被破壞。

GAP-43具有調解軸突延伸的作用，改變細胞形態，同時其作為細胞內信號，可有效增強與G蛋白偶聯受體之間的關聯性〔14〕。正常情況下，GAP-43的表達水平很低，血清中的水平也很少，但是當腦梗死發生時，腦組織損傷部位周圍神經元的傳入側支發芽，反應性軸突再生，形成負反饋機制，此時，GAP-43的表達水平升高，但也不會一直升高，會隨著修復時間的延長而逐漸下降。由于血腦屏障被破壞，血清中的GAP-43水平也會隨之發生不同的變化〔15,16〕。因此，檢測血清中GAP-43的水平可以作為研究神經生長發育和損傷修復等神經可塑性的方法之一。本研究表明，大鼠腦梗死發生后，其血清中的GAP-43和TNF-α mRNA表達水平迅速升高，當達到最大值后，又開始回落，大鼠的神經功能也有所改善。這可能是由于大鼠腦組織受到損傷后，迅速表達出大量的GAP-43，隨著損傷修復速度的增加，GAP-43的表達持續增多，當修復到一定程度時，損傷部位周圍神經元的傳入側支和反應性軸突增多，神經末梢的表面積也隨之增加，隨著新突觸的形成，更多的樹突和軸突之間建立聯系，此時，損傷部位周圍神經元的傳入側支發芽和反應性軸突再生減少或者停止，GAP-43的表達水平也隨之下降。

TNF-α具有促進細胞增殖和分化等作用〔17〕。TNF-α通過刺激B細胞增殖，促進Ig分泌，也可通過促進與細胞增殖相關的一些原癌基因的表達，刺激細胞周期由G0期向G1期轉化〔18〕。本研究顯示，大鼠腦梗死發生后，其血清中TNF-α和TNF-α mRNA的表達迅速增多。這可能是由于大鼠腦部神經元受到損傷后，失去其正常功能，為了維持腦組織的功能，需要周圍神經細胞代償性再生，TNF-α和TNF-α mRNA大量表達，以促進周圍神經細胞從細胞周期的Go期向G1期轉變，促進細胞的分裂增殖，以形成新的突觸。當損傷修復到機體所能達到的最大程度時，就逐漸減慢或停止修復，TNF-α的表達也隨之回降。

ANG-1是血管內皮細胞的特異性受體酪氨酸激酶-2的配體，為血管生成的主要物質之一，對維持新生血管的穩定性具有重要作用，且可影響血管重構和血管的成熟〔19〕。可見，ANG-1在調節血管功能方面發揮著重要作用。本研究表明，大鼠腦梗死發生后，其血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表達迅速增多。這可能是由于大鼠腦梗死發生后，血腦屏障受到破壞，血清中各種因子的正常平衡打破，血管的完整性不能維持，血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表達增多，以發揮其重構血管的作用，并維持修復后血管的完整性。當血管修復到機體所能修復的最大程度時，血管的重構減弱或停止，ANG-1的表達也降低。

綜上，檢測腦梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表達水平，可以更好地判斷模型大鼠的腦部神經損傷的嚴重程度，為腦梗死的臨床判斷、以后的治療以及預后恢復情況提供重要的參考價值。