下調miR-146a對牙髓炎模型大鼠的干預效果及作用機制

劉琳 張敏 息雪娜

(1哈勵遜國際和平醫(yī)院(衡水市人民醫(yī)院)口腔科，河北 衡水 053000；2張家口學院)

牙髓炎的原因有很多，包括細菌感染、物理化學刺激和免疫反應，其中細菌感染是導致牙髓疾病的主要因素〔1〕。由于口腔不是無菌環(huán)境，所以當齲齒或外傷等疾病導致牙齒缺損沒有及時治療時，以細菌為基礎的致病因素會通過牙齒缺損感染牙髓，從而導致牙髓炎〔2〕。牙髓炎的主要表現(xiàn)為牙痛，根據根管學的臨床表現(xiàn)和治療預后，可分為可逆性牙髓炎和不可還原性牙髓炎〔3〕。去除刺激因素并給予一定的治療后，牙髓可以恢復到原來的狀態(tài)，如果外界刺激持續(xù)，牙髓炎癥將繼續(xù)發(fā)展，最終發(fā)展為以自發(fā)性疼痛為標志癥狀的不可逆牙髓炎〔4〕。根據病程和疾病特點，不可復性牙髓炎又可分為急性牙髓炎、慢性牙髓炎、牙髓炎和逆行性牙髓炎〔5〕。本文皆在探討下調miR-146a對牙髓炎模型大鼠的干預效果及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究動物：采購于河南中醫(yī)藥大學(SYXK(豫)2020-0003)的SPF級SD大鼠共40只，6～9月齡，平均(7.50±1.20)月齡，體重250～315 g，平均(282.5±26)g，保持光照12 h/d，相對濕度24%～36%、溫度(27.50±4.25)℃的環(huán)境內喂養(yǎng)大鼠1 w，本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過。主要試劑：miR-146a(上?？泼羯锟萍加邢薰?；白細胞介素(IL)-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海彩佑實業(yè)有限公司，貨號：YS04529B)；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-R0040)；IL-6 ELISA試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號：LCS31109)；IL-1β ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-R0548)；Toll樣受體(TLR)4一抗(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號：MAB6248)；核因子(NF)-κB一抗(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：YT828-TUV)。

1.2慢病毒載體構建 miR-146a表達下調的慢病毒載體構建、大鼠miR-146a序列查找及設計由上海GeneChem公司完成，重組miR-146a上調病毒載體、miR-146a下調載體由上海GeneChem公司合成，并經測序驗證，病毒滴度為108 TU/ml，制備完成將重組慢病毒載體在-80℃保存。

1.3分組及建模 將40只SPF級SD大鼠平均分為4組，每組10只，選擇3組大鼠建立牙髓炎模型，參考韓耀倫等〔6〕研究實驗進行構建：首先將3組大鼠進行麻醉，并采取仰臥位將其固定，用鑷子使大鼠上頜張開，暴露其上頜磨牙，進行消毒后，將大鼠左側上頜第一磨牙、第二磨牙用高速渦輪機005號球鉆頜面開髓，髓孔大約1 mm，當觀察到牙本質呈現(xiàn)紅色后，使用金屬探針加壓形成穿髓孔開放髓腔，使髓腔充分暴露。觀察牙髓血管擴張并伴隨著充血現(xiàn)象，冠髓部白細胞大量浸潤，表示建模成功。

1.4慢病毒轉染 選取10只建模成功大鼠設為上調組，對其牙髓部注射含10 μl重組miR-146a上調病毒載體的慢病毒懸液；另選取10只建模成功大鼠設為下調組，對其牙髓部注射含10 μl miR-146a下調載體的慢病毒懸液；剩余建模成功的10只大鼠設為模型組，為進行建模處理的大鼠設為空白組，并對兩組分別注射與上述兩組等量的生理鹽水。于2 w后觀察各組大鼠的變化情況。

1.5miR-146a基因表達量 采集所有大鼠心臟血液，2 000 r/min 4℃離心10 min，收集血清。miRNA采用mirVana PARIS Kit試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液，混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿，搖晃30～60 s；離心5 min 14 000 r/min在室溫下操作。把上清液放到另一個管中，加入1.25倍無水乙醇充分混勻，然后加入柱中，離心30 s 12 000 r/min，棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次，12 000 r/min離心1 min；95℃預熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min，收集miRNA。miR-146a上游引物序列：5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′。U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游：5′-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3′。實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應液管中。

1.6病理組織學觀察 各組腹腔注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分離牙髓組織，將提取的牙髓組織制作成標本，用4%多聚甲醛固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋，作3 μm的切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，使用光學顯微鏡觀察海馬神經病理變化。

1.7IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 采集所有大鼠血樣本，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取上清液，采用ELISA檢測，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，將樣品加入96孔酶標板中，每孔50 μl，隨后將其樣品加于至酶標板孔的底部位置，在進行加入的過程中對于孔壁盡量不要去觸碰，加入之后進行搖勻，待搖勻后使用封板膜將其進行封板，置于37℃常溫中進行孵育30 min。洗板3次，除去空白孔，其余的兩孔內均分別加入50 μl的酶標試劑，37℃溫育30 min。洗板3次，在3孔中按照先后順序先加入50 μl的顯色劑A，再加入50 μl的顯色劑B，在37℃常溫中進行溫育30 min。每孔加入終止液50 μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。以空白孔凋零，450 nm波長依順序測量各孔的吸光度，分析IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.8TLR4、NF-κB蛋白 采用Western印跡檢測，取所有大鼠牙髓組織蛋白。對組織標本以磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗后，行30 min裂解，3 000 r/min離心處理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，添加完成蛋白緩沖液后開始進行100℃加熱5 min。凝膠電泳、轉膜，取膜，4℃下固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，TBST連續(xù)洗膜3次，處理5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組miR-146a表達、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達量比較 與空白組相比，模型組、上調組，下調組miR-146a基因表達量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號通路蛋白顯著升高(P<0.01)；上調組miR-146a表達、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號通路蛋白顯著高于模型組(P<0.05)；下調組miR-146a表達、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號通路蛋白顯著低于模型組、上調組(均P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組miR-146a表達、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號蛋白表達比較

圖1 Western印跡檢測各組細胞TLR4/NF-κB信號通路蛋白

2.2病理學觀察 空白組牙髓組織無明顯變化。模型組穿髓點有壞死區(qū)出現(xiàn)，周圍環(huán)繞少量纖維組織，且有大量炎癥細胞浸潤，根髓血管擴張、充血，出現(xiàn)大量紅細胞。上調組冠髓被大量炎癥細胞占據，大量成纖維細胞、牙本質細胞液化、體積變形，根髓空泡出現(xiàn)變形且排列紊亂。下調組牙髓組織內輕度炎癥反應，在光鏡下可以觀察到穿髓點下方有少量中性粒細胞浸潤，牙本質細胞排列紊亂，根髓正常，血管內有少量紅細胞。見圖2。

圖2 各組牙髓炎病理觀察(HE染色，×400)

3 討 論

牙髓炎是臨床常見病，疼痛是臨床主要癥狀，且導致該病的因素較多，嚴重影響患者的身心健康〔7,8〕。此外，牙髓炎還會影響牙齒的血液循環(huán)、營養(yǎng)供應，而嚴重的牙髓炎還會引起牙髓壞死、根尖周炎，是牙齒脫落的重要原因〔9〕。牙髓炎的發(fā)展過程中，輕度炎癥可引起牙髓組織自我再生、自我修復能力，重度炎癥則會導致牙髓壞死〔10〕。

miRNA通過和靶基因mRNA 3′非轉錄區(qū)互相配對，從而引起mRNA的降解抑制，在轉錄后水平對基因的表達呈負調控。目前在人體內已發(fā)現(xiàn)530余種miRNAs，在疾病發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。侯云華等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎(CP)患者在唾液中miR-146a表達水平的明顯升高，miR-146a表達水平的高低與疾病嚴重程度具有相關性。目前尚未有研究miR-146a在牙髓炎的機制作用，所以牙髓炎后miR-146a是否參與調控其炎癥反應及其主要的靶基因都不明確〔12,13〕。本研究結果表明，miR-146a可能與牙髓炎癥反應相關，且可能在牙髓炎恢復過程中對炎癥反應的調控發(fā)揮重要的作用。

TNF-α對于機體內部的腫瘤細胞有明顯殺傷力，但是對于正常細胞不具備殺傷作用，其廣泛存在于機體中，在機體炎癥反應中較為活躍，可作為各種信號通路的關鍵環(huán)節(jié)〔14,15〕。IL-1β廣泛參與炎癥反應中，研究證明在發(fā)生牙髓炎時IL-1β水平明顯升高，并且參與了牙髓炎的免疫反應〔16〕。IL-6具有多生物學活性的特征。其在機體中的高表達可以促進細胞的分化和浸潤，上調其他炎性細胞因子的表達，加重炎癥損傷和神經根超敏，最終導致疼痛、麻木等相關癥狀〔17,18〕。有研究表明，炎性因子能夠通過調控牙髓細胞的炎癥反應，參與牙髓炎的整個過程。有研究顯示，IL-8和IL-6水平明顯高于正常牙髓炎患者。IL-8 在炎癥前期發(fā)揮調節(jié)作用，炎癥前期IL-8就會起到調節(jié)影響，炎癥受損位置IL-8了募集中性粒細胞對炎癥反應起到介導作用，在促炎階段IL-8是第二大細胞因子〔19,20〕。本研究結果說明，下調miR-146a可有效降低炎癥反應，起到保護牙髓細胞的作用。TLR4/NF-κB信號在細胞的氧化應激、炎性反應等生理病理過程中起到重要的作用〔21〕。NF-κB活化后不僅可以調節(jié)免疫反應中的基因，還可以轉錄上調炎癥相關基因的表達。NF-κB可以激活各種外界刺激，包括血流切應力。TLR4是哺乳動物的Toll樣受體。有研究顯示，TLRs家族不僅在免疫應答中發(fā)揮重要作用，而且與各種炎癥性疾病密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a對牙髓炎具有良好的抑制效果，其原因可能為miR-146a通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的方式抑制機體炎癥反應，從而達到對牙髓炎的抑制效果，更好的保護牙髓細胞不受侵害。

綜上，下調miR-146a基因可能經作用于TLR4/NF-κB信號通路后，抑制炎癥反應，miR-146a可以成為牙髓炎診斷和病情判斷的分子標志物。