miR-140-3p靶向調控KMT5B對老年牙髓干細胞成牙本質分化的影響及機制

劉帆 宋楠 安琪

(1東南大學附屬中大醫院江北院區口腔科，江蘇 南京 210000；2長春市口腔醫院牙體牙髓科)

人牙髓干細胞(hDPSCs)是具有高度增殖能力及多向分化潛能的成體間充質干細胞，牙髓損傷發生后牙髓干細胞可遷移至損傷部位并發生定向分化，進而促進修復，因此牙髓干細胞成牙本質分化在牙齒再生過程中發揮重要作用〔1～3〕。既往研究顯示，不同年齡組和代數的干細胞生物學活性具有一定程度差異〔4，5〕，微小RNA(miR)-140-3p可參與多種干細胞凋亡、分化、增殖等，且與人骨髓間充質干細胞衰老有密切關系〔6〕。甲基轉移酶(KMT)5B與細胞增殖、分化等聯系密切，且涉及機體多種器官、細胞、組織，在牙齒再生、發育過程中發揮至關重要的作用〔7〕。本文擬分析miR-140-3p靶向調控KMT5B對老年牙髓干細胞成牙本質分化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1研究材料 主要試劑：RPMI1640培養基(武漢益普生物科技有限公司)，DMEM培養基(美國Sigma公司)，牙本質涎磷蛋白(DSPP)、骨橋蛋白(OPN)、P21、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、關鍵轉錄因子Runt相關轉錄因子(RUNX)2抗體(abcam 公司)，二抗(北京索萊寶有限公司)，酶標儀、實時熒光定量PCR(賽默飛世爾公司)。研究細胞：收集本院因阻生齒或牙周病的老年患者健康完整恒牙，取出牙髓，分離、純化獲得牙髓干細胞，本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2細胞培養 牙髓干細胞放入含10%胎牛血清的DMEM培養箱，于37℃ 5%CO2、95%N2培養箱中培養，培養密度達到80%左右重復傳代操作。

1.3hDPSCs中miR-140-3p、KMT5B mRNA相對表達量檢測 提取未分化、分化hDPSCs中總RNA，逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量法鑒定miR-140-3p、KMT5B表達量，采用Primer5.0軟件設計引物序列，miR-140-3p正義：5′-GGAGGGGATTCAAAGACCTA-3′，反義：5′-TTATTCCAAAGCTGCATGT-3′；KM-T5B正義：5′-GCATACAGCACTTACTCCCG-3′，反義：5′-TCGCGATGCTGATCACAAC-3′。啟動PCR儀，反應體系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYBGreen，加蒸餾水至20 μl。反應條件：95℃ 3 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，72℃ 10 min，共進行40個循環，采用2-△△Ct方法計算出miR-140-3p、KMT5B的表達量。

1.4細胞轉染 取對數牙髓干細胞，將其接種于6孔板，細胞融合至80%時，將培養細胞分為si-NC組(不做處理的牙髓干細胞)，si-miR-140-3p組(轉染 miR-140-3p inhibitor)，KMT5B-NC組(轉染KMT5B mimics的陰性對照)，KMT5B組(轉染KMT5B mimics)，si-miR-140-3p+anti-KMT5B-NC組(轉染miR-140-3p mimics陰性對照)，si-miR-140-3p+anti-KMT5B組(轉染miR-140-3p mimics)，對其進行48 h培養。

1.5礦化結節相對數量檢測 取對數生長期的hDPSCs細胞，將培養液棄去，通過40 g/L多聚甲醛固定，染色采用茜素紅染液，通過倒置顯微鏡對礦化結節情況進行觀察，Image-J軟件定量分析，顯微鏡下計數5個孔，計算平均值，獲得礦化結節相對數量。

1.6細胞增殖情況 采用噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖情況，調整測定細胞濃度，將其接種于96孔板中，并在孔板中加入200 μl細胞懸液，放入37℃、5% CO2環境中進行培養，2 h后加入10 μl MTT試劑，孵育4 h后采用酶標儀對OD值進行測定，并計算增殖率。

1.7Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1 通過Western印跡對Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1相對表達量進行檢測，取細胞上清液，將50 μg蛋白加入凝膠緩沖液，加熱變性。待凝膠電泳后轉膜，取模，在4℃環境下進行1 h封閉處理，加入后分別加入1∶1 000 TBST給予稀釋的Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1一抗，4℃孵育過夜保存，使用0.05%～0.10%Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween去污劑進行洗膜，使用1∶10 000的二抗在室溫下孵育1 h后TBST洗膜，二氨基聯苯胺顯色，使用Labwork凝膠圖像掃描所獲得膠片，以GAPDH為內參，計算Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1蛋白表達量。

1.8雙熒光素酶報告試驗 采用starBase網站對miR-140-3p靶基因進行預測，結果顯示miR-140-3p中含有與KMT5B互補核苷酸序列，包括WT-miR-140-3p、MUT-miR-140-3p，將WT-miR-140-3p、MUT-miR-140-3p、KMT5B-NC、KMT5B轉入hDPSCs細胞，進行雙熒光素酶檢測。

1.9統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1miR-140-3p、KMT5B在未分化牙髓干細胞、分化牙髓干細胞中的表達 與未分化牙髓干細胞(1.02±0.11、1.56±0.17)對比，分化牙髓干細胞miR-140-3p表達量(2.28±0.31)升高，KMT5B表達量(0.75±0.05)降低，差異有統計學意義(t=6.635、7.294，P=0.003、0.002)。

2.2干擾miR-140-3p對牙髓干細胞分化、增殖的影響 與si-NC組相比，si-miR-140-3p組miR-140-3p表達降低(P<0.05)，說明干擾miR-140-3p的牙髓干細胞構建成功。與si-NC組相比，si-miR-140-3p組礦化結節相對數量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1降低，P21升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 干擾miR-140-3p對牙髓干細胞分化、增殖的影響

2.3KMT5B過表達對牙髓干細胞分化、增殖的影響 與KMT5B-NC組相比，KMT5B組KMT5B表達量顯著升高(P<0.05)，表明上調KMT5B的牙髓干細胞構建成功。與KMT5B-NC組相比，KMT5B組礦化結節相對數量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1降低，P21升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 KMT5B過表達對牙髓干細胞分化、增殖的影響

2.4miR-140-3p靶向調控KMT5B表達 雙熒光素酶報告試驗顯示，與KMT5B-NC組(1.01±0.11、0.97±0.09)相比，KMT5B可使WT-miR-140-3p熒光素酶活性(0.31±0.04)顯著降低(t=18.910，P=0.001)，對MUT-miR-140-3p熒光素酶活性(0.96±0.08)影響較小(t=0.263，P=0.796)。

3 討 論

hDPSCs可接觸介質硬度而向軟骨及組織、平滑肌組織、神經組織等不同組織分化，正常情況下牙髓干細胞在牙髓組織中存在，當牙組織發生損傷時，牙髓干細胞可在微環境特定信號驅動下向損傷部位遷移并分化，最終起到修復損傷牙組織的作用〔8～10〕。

miRNA可通過特異性對靶基因進行識別并結合，進而參與細胞增殖、凋亡、細胞及干細胞功能重編程等生物過程，不同類型miRNA差異性表達可能與牙髓干細胞增殖、表型、分化的調控存在聯系〔11〕。miR-140-3p可通過調控轉化生長因子受體參與骨髓間充質干細胞的成脂、成骨分化〔12,13〕。研究表明〔14,15〕，miR-140-3p過表達時堿性磷酸酶(ALP)水平升高，而ALP是可參與骨礦化組織代謝、再生的主要物質，可促進鈣化進程，同時可反映牙髓干細胞成牙本質分化情況，因此miR-140-3p對成牙本質分化具有促進作用。本研究結果表明，miR-140-3p可能為牙髓干細胞成牙本質分化的重要靶點。

相關學者研究發現〔16〕，KMT5B是可調控牙組織衍生的蛋白質，在牙髓干細胞缺氧情況下KMT5B表達呈上升趨勢，可通過抑制DSPP、OPN表達降低ALP活性抑制牙髓干細胞的成牙本質分化，而在敲除KMT5B牙髓干細胞的缺氧受損分化能力增強，表明KMT5B對受損牙源分化具有抑制作用。本研究結果提示，miR-140-3p可靶向KMT5B調控牙髓干細胞礦成牙本質分化能力。

Runx2可與靶基因的啟動子進行結合，進而對OPN、骨鈣素等成骨相關靶基因起調控作用，對牙髓干細胞分化造成了影響，增強Runx2表達可促進牙髓干細胞礦成牙本質分化〔17〕。DSPP為典型成骨分化相關指標，對ALP活性、細胞增殖活性、鈣結節產生具有促進作用，進而推動了牙髓干細胞骨形成〔18〕。OPN可與羥基磷灰石晶體進行結合，進而參與了鈣離子信號傳導過程，推動了初期礦化過程〔19,20〕。P21可使細胞周期延長，進而對牙髓干細胞增殖起抑制作用〔21，22〕。CyclinD1對細胞周期可起到調節作用，對G2/M期轉變及有絲分裂具有促進作用，有利于牙髓干細胞增殖〔23,24〕。本研究結果表明，下調miR-140-3p可靶向調控KMT5B，影響牙髓干細胞礦成牙本質分化及增殖。

綜上，miR-140-3p在牙髓干細胞礦化后表達升高，抑制其表達后牙髓干細胞礦化結節相對數量減少，分化相關指標水平下降，增殖受抑可能是通過調控KMT5B實現，表明干擾miR-140-3p可靶向調控KMT5B影響老年人牙髓干細胞成牙本質分化。