重復異丙酚麻醉通過mTOR通路誘導大鼠海馬細胞凋亡及自噬

蘇曉英 周飛仁 都躍

(綿陽市第三人民醫院 四川省精神衛生中心麻醉科，四川 綿陽 621000)

全身麻醉性藥物(如七氟烷、異氟烷、咪達唑侖等)使用較長時間時，會影響神經系統的發育，使發育期大腦出現神經細胞變性，影響后期的學習記憶能力〔1,2〕。動物實驗也表明，全身麻醉性藥物可破壞神經元，導致認知功能障礙〔3〕。異丙酚是臨床應用廣泛的全身麻醉藥，近年來的研究表明，高濃度的異丙酚可破壞神經元結構，誘導海馬神經元凋亡〔4〕；而有的研究卻發現異丙酚可通過誘導自噬保護氧化應激誘導的細胞凋亡〔5,6〕。異丙酚如何破壞發育期大腦的神經元，通過何種途徑誘導海馬神經元凋亡和自噬，目前尚無定論。本研究通過重復異丙酚麻醉新生大鼠，探究其對新生大鼠海馬神經細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康SD大鼠72只，體重8～15 g，由北京維通利華動物中心提供，許可證號為SCXK(京)2016-0011，所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，溫度為24℃，濕度為50%，自由飲水和攝食。

1.2主要試劑 腹腔注射異丙酚(意大利Astra Zeneca公司，P017269)；雷帕霉素(北京索萊寶公司，IR0010)；注射脂肪乳劑(力能，江蘇華瑞制藥有限公司，H20030609)；兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體(ab32028)、兔抗磷酸化(p)-mTOR抗體(ab137133)、兔抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體(ab194583)、兔抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(ab182734)、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體(ab13847)、兔抗Beclin-1抗體(ab210498)、兔抗微管相關蛋白輕鏈(LC)3B抗體(ab63817)、兔抗p62抗體(ab91526)、兔抗β-Actin抗體(ab8227)、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP，ab205718)均購自英國abcam公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S)；丹麥雷度血氣分析儀(ABL90 FLEX，丹麥Radiometer)、多功能酶標儀(iMark680，美國Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)。

1.3分組與處理 將72只大鼠隨機分為4組，每組18只。溶劑對照組(A組)：腹腔注射脂肪乳劑7.5 ml/kg，1次/d，連續7 d；單次注射異丙酚組(B組)：腹腔注射脂肪乳劑7.5 ml/kg，1次/d，連續6 d，第7天注射異丙酚75 mg/kg。重復注射異丙酚組〔7〕(C組)：腹腔注射異丙酚75 mg/kg，1次/d，連續7 d；異丙酚+雷帕霉素組〔8〕(D組)：腹腔注射雷帕霉素2.0 mg/kg和異丙酚75 mg/kg，1次/d，連續7 d。雷帕霉素注射液的配制：將雷帕霉素以20 mg/ml的濃度溶解在乙醇中，-20℃下保存備用。在注射之前，將雷帕霉素乙醇溶液用含有5%Tween-80的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成2.0 mg/ml〔9〕。每次給藥后將大鼠放入保溫箱中，麻醉過程中觀察大鼠呼吸頻率和皮膚顏色變化。

1.4動脈血氣分析 第7天給藥結束后，每組隨機選取12只大鼠0.3%戊巴比妥鈉1 ml/100 g腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，取動脈血1 ml，采用血氣分析儀監測動脈血pH值、血氣血氧飽和度相關參數、乳酸、血糖水平。

1.5HE染色觀察海馬神經細胞病理學變化 每組取12只大鼠取血完成后在冰上迅速剝離腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗，放入1%鹽酸酒精30 s，伊紅染色5 min，自來水流水洗3次，至無色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察海馬神經元病理學變化。

1.6原位末端標記技術(Tunel)法檢測海馬神經細胞凋亡 將1.5制備的腦組織石蠟切塊，冠狀切4 μm切片。細胞凋亡檢測按TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，細胞核固縮、染色體凝集呈棕褐色者為凋亡細胞。在400倍光鏡下觀察海馬CA1區、CA3區、齒狀回(DG)的凋亡神經細胞，每組隨機選擇5個視野計數正常神經細胞和凋亡神經細胞，取平均值，計算細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+正常細胞數)×100%。

1.7Western印跡法檢測海馬組織mTOR、p-mTOR、自噬和凋亡相關蛋白的表達 每組剩余6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織。按照試劑盒說明書的操作提取海馬組織中的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后取等量蛋白質樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62，按1∶1 000的比例稀釋；β-actin按1∶2 000的比例稀釋)，4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學發光(ECL)顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1異丙酚對動脈血pH、血氧飽和度、血糖水平的影響 所有大鼠在實驗過程中無死亡，各組動脈血pH值、氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)、乳酸、血糖水平均在正常范圍內，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血氣分析結果比較

2.2異丙酚對海馬神經元病理損傷的影響 A組、B組海馬組織形態及結構正常，細胞排列規整，著色均勻，胞核及核仁大小正常，未出現明顯的病理損傷；與A組、B組相比，C組可見海馬各區神經元腫脹呈空泡樣，胞質胞核著色不均勻，細胞結構紊亂，形態改變；與C組相比，D組細胞形態和結構有所恢復，神經元細胞核著色較均勻。見圖1。

圖1 異丙酚對各組海馬神經元病理損傷的影響(HE染色，×100，方框內×400)

2.3異丙酚對海馬神經元凋亡的影響 A組有少量的神經凋亡細胞，與A組相比，B組海馬各區神經細胞凋亡情況無顯著性差異(P>0.05)，C組、D組海馬各區神經細胞凋亡數量明顯升高(P<0.05)；與C組相比，D組凋亡細胞數量明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 異丙酚對海馬神經元凋亡的影響個/HP，n=12)

圖2 異丙酚對大鼠海馬神經元凋亡的影響(Tunel染色)

2.4異丙酚對海馬神經元凋亡相關蛋白表達的影響 A組和B組海馬組織Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與A組、B組相比，C組海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達顯著降低，Caspase-3表達顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達明顯升高，Caspase-3表達顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組海馬組織凋亡相關蛋白表達

2.5異丙酚對海馬組織mTOR、p-mTOR和自噬相關蛋白表達的影響 A組和B組海馬組織p-mTOR/mTOR、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與A組、B組相比，C組海馬組織p-mTOR/mTOR蛋白表達顯著升高，自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達顯著降低，p62表達顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組大鼠海馬組織p-mTOR/mTOR蛋白表達顯著降低、自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-II/LC3-Ⅰ表達顯著升高、p62表達明顯降低(P<0.05)。見表3、圖4。

表3 異丙酚對海馬組織mTOR和凋亡及自噬相關蛋白表達的影響

圖4 各組海馬組織mTOR、p-mTOR和自噬相關蛋白表達

3 討 論

異丙酚是臨床常用的全身麻醉藥，現已有多項研究表明異丙酚可對腦組織細胞自噬和凋亡產生影響〔10～13〕；對處于發育期動物的大腦具有遠期毒性，可導致動物成年后的學習記憶和認知能力下降，顯著誘導神經元細胞的凋亡〔14〕。王玉潔等〔7〕研究發現重復異丙酚麻醉可增加海馬內細胞凋亡，降低新生大鼠的遠期學習記憶能力；Li等〔15〕研究發現異丙酚可通過誘導H9c2心臟細胞自噬來促進細胞存活；而孫穎等〔16〕、Lu等〔17〕研究卻發現異丙酚能夠減輕星形膠質細胞氧糖剝奪損傷引起的過度自噬，從而減輕星形膠質細胞氧糖剝奪傷害。

嚙齒類動物的大腦在出生后快速發育，在7 d左右達到高峰；海馬是大腦最容易受到傷害的區域，神經損傷的主要原因之一就是海馬神經元的凋亡〔18〕；因此，本研究選擇出生后7 d的大鼠海馬組織為主要研究對象。麻醉中發生的低氧血癥和酸中毒也是導致神經元損傷的原因之一〔19〕，故本研究采用動脈血氣分析儀對麻醉中大鼠的pH值、血氧飽和度、血糖等指標進行監測，排除酸堿失衡和低氧血癥等內環境紊亂對實驗結果的干擾。本研究結果表明，異丙酚麻醉后大鼠未出現低氧血癥、酸中毒等內環境紊亂的現象，因此，異丙酚麻醉大鼠出現的一系列改變是麻醉藥對大腦的直接損害作用。本研究HE染色結果說明，異丙酚重復麻醉可誘導海馬神經元損傷。采用Tunel檢查異丙酚對大鼠海馬神經元細胞凋亡的影響，結果發現異丙酚重復麻醉可誘導海馬神經元細胞凋亡。

細胞凋亡和自噬是程序性細胞死亡的兩種方式。Bcl-2、Bax是目前已知的細胞凋亡中最重要的兩個調控基因，Caspase-3是所有細胞凋亡途徑的最后效應子，其激活是細胞凋亡的特征性標志之一。自噬具有雙重功能，一方面它可降解異常蛋白質，防止其在神經元內蓄積，拮抗細胞的凋亡效應；另一方面自噬過度活躍會損傷細胞器，如造成線粒體功能障礙，參與神經退行性疾病的致病過程〔20〕。Beclin-1是自噬開始所必需的蛋白，當自噬受到抑制時Beclin-1表達降低，而p62表達則會升高〔21,22〕；同時LC3-Ⅰ與自噬體膜結合轉變為LC3-Ⅱ的過程受阻，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低〔23,24〕。mTOR是細胞生長，自噬，翻譯和存活的關鍵調節劑，mTOR激活后，可通過調節不同的下游通路蛋白(如LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1)調節細胞的自噬和凋亡。Chiara等〔25〕研究發現mTOR的過度活化會降低Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值，使自噬受損，自噬減少會抑制錯誤折疊的蛋白質的清除，形成神經毒性聚集體，促進神經元死亡；而Abhishek等〔26〕研究表明在阿爾茨海默病(AD)大鼠模型中給予mTOR信號通路抑制劑(雷帕霉素)可降低p-mTOR、p62蛋白表達，升高Beclin-1、LC3-Ⅱ表達，誘導自噬激活，逆轉β淀粉樣蛋白1～42誘導的氧化還原穩態受損，保護海馬神經元，提高大鼠的認知能力。本研究結果提示，異丙酚重復麻醉可誘導海馬神經元凋亡增強，海馬神經元自噬受到抑制；而mTOR抑制劑組可見大鼠海馬組織自噬被激活，神經細胞凋亡減少；重復異丙酚麻醉可能通過激活mTOR通路抑制新生大鼠海馬神經細胞自噬，誘導神經細胞凋亡。

綜上所述，重復異丙酚麻醉可能通過激活mTOR通路抑制新生大鼠海馬神經細胞自噬，誘導神經細胞凋亡。但本研究尚存在一定不足，未研究其對學習記憶的長遠影響；關于重復異丙酚麻醉通過mTOR抑制自噬，誘導凋亡的mTOR上游的影響因素未進行探討，今后會繼續進行深入研究。