α-芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突變體合成及其靶點活性

李浩楠，楊奕帥，長孫東亭，朱曉鵬，羅素蘭

（1.上海兒童醫學中心 三亞市婦女兒童醫院 藥學部，海南 三亞 572000;2.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海口市海洋藥物重點實驗室/生命科學與藥學院，海口 570228）

芋螺（Cone snail）是一種肉食性海洋軟體動物[1]，其分泌的芋螺毒液包含許多不同化合物的混合物，包括小分子、肽和酶。其中，含有很多種不同成分的神經活性毒素肽-芋螺毒素（Conotoxin,CTx）具有廣泛的多樣性，這些具有高活性和靶點選擇性的神經小肽大多由6～50個氨基酸殘基構成，富含二硫鍵，以特定的離子通道和受體為靶標，作為藥理學工具和探針，具有較好的開發前景[2-4]。α-芋螺毒素 (α-conotoxin,α-CTx) 是目前研究最廣泛和深入的CTxs。α-CTx分子質量較小，由12～20個氨基酸殘基連接構成，是各種乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）亞型的選擇性拮抗劑[5-6]。α-CTx一般含有4個半胱氨酸（Cys），根據二硫鍵的不同連接方式，可組成3種異構體，其中，大部分α-CTxs的活性形式為球型。另外，根據α-CTx半胱氨酸間氨基酸數量的不同將α-CTx分為：α-3/5、α-4/4、α-4/6、α-4/7等多種亞家族。α-CTx不僅作為分子探針，用以鑒別不同亞型的nAChR，在治療與nAChR相關疾病時有著至關重要的作用[7-9]，并且在成癮、鎮痛等神經生理、藥理研究方面也扮演重要角色[10]。

羅素蘭研究團隊從疣縞芋螺中分離得到了一種α-4/7型CTx LvIA，它由15個氨基酸殘基組成，能夠作用于nAChRs，對α3β2 nAChR具有較好的的活性（IC50為8.7 nmol·L-1），但是LvIA對α6/α3β2β3，α3β4和α6/α3β4 3種nAChRs亞型保持一定的高親和力[11-13]。為了提高LvIA的選擇專一性，前期實驗室基于LvIA進行了設計和改造，獲得了對應的共晶結構，同時也利用受體突變技術解析了它與α3β2 nAChR相互作用的分子機制[14-15]。研究發現，當第11位天冬氨酸（Asp,D）突變成丙氨酸（Ala,A）后對α3β2 nAChR的活性保持不變，共晶實驗表明，第11位氨基酸影響著LvIA與α3β2 nAChR的結合作用[16-19]。第11位是否是LvIA的關鍵氨基酸位點，今后能否基于該位點對LvIA進行改造，有待深入研究。

本研究基于LvIA前期研究發現的關鍵氨基酸信息[20-22]，主要是針對第11位氨基酸，對LvIA進行進一步設計改造，分別用精氨酸（Arg,R）和組氨酸（His,H）對Asp進行取代，設計了2種新型突變體，考察第11位氨基酸電性和側鏈基團對LvIA活性的影響，旨在為LvIA的設計和開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器α-CTx LvIA及其所有突變體線性肽粗品（吉爾生化上海有限公司），色譜級三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），色譜級乙腈(Acetonitrile,ACN)（ThermoFisher Scientific公司），N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碘(I2)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、甲酸等分析純試劑（廣州化學試劑廠），質粒提取試劑盒(Omega)，膠原酶(Collagenase)、乙酰膽堿(ACh)、阿托品(Atropine)（Sigma公司），DNA純化試劑盒（TaKaRa大連有限公司），體外轉錄試劑盒（Fisher Scientific公司），膠原蛋白酶A（美國Sigma-Aldrich公司），圓二色譜檢測涉及的試劑由華中科技大學分析測試中心提供；Waters 2695制備型高效液相色譜儀，Waters e2695分析型高效液相色譜儀（美國Waters公司），島津電噴霧電離質譜(Electrospray ionization-mass spectrometer，ESIMS)（美國格雷斯公司），雙電極電壓鉗系統Axon 900A和Digidata 1550B數模轉換器（美國Molecular Device公司），ELGA超純水系統（英國ELGA公司）；分光光度計(Smart SpecTM plus)（美國Bio-RAD公司），AlphaImager HP凝膠成像系統（美國Protein Simple公司）；實驗用非洲爪蟾（美國Nasco公司）。

1.2 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA的合成和氧化折疊設計2種LvIA第11位突變體序列送至上海吉爾生化有限公司，使用固相合成法（Fmoc法）進行合成（純度為80%～85%）。然后使用制備型RP-HPLC對合成好的線性肽進行純化，使產物的純度達到95%以上。純化得到的線形肽采用兩步法氧化的方法進行氧化折疊，保證形成I-III,IIIV的二硫鍵連接結構。第1步氧化，將純化后的線性肽凍干粉溶于B60(60%乙腈)，緩慢地滴加到鐵氰化鉀反應液(K3[Fe(CN)6]10 mmol·L-1,Tris 0.1 mol·L-1,pH7.5)中，室溫充分反應45 min，促使其形成第1對二硫鍵(Cys-2和Cys-8)，線性肽濃度不高于50 g·L-1。利用RP-HPLC純化反應后得到單環產物。將第1步純化后的多肽進行第2步氧化。在氮氣保護的條件下，逐滴加入到碘(I2)反應液中（7.5 mmol·L-1I2溶液；V水∶VTFA∶VACN=73∶3∶24），反應時間8～12 min,促使其 連接Cys-3和Cys-16形成第2對二硫鍵，反應完畢滴加VC飽和溶液至溶液顏色從紫黑色變成無色，終止I2氧化反應，至此，得到包含2對二硫鍵的LvIA突變體的最終產物。使用RP-HPLC對氧化折疊產物進行純化（溶劑A為0.075%TFA水溶液，溶劑 B為0.05% TFA、90% ACN,梯度洗脫條件：5%～35%），使其純度大于95%，純化得到的氧化折疊產物利用ESI-MS鑒定其分子質量，確定LvIA及其突變體是否形成正確的二硫鍵連接方式。凍干保存，用于后續電生理活性實驗。

1.3 乙酰膽堿受體模型的建立從載入了含（rat，r）α3、β2 2種亞基基因質粒的DH5α感受態細胞中提質粒，將獲取的質粒酶切成線性質粒，然后純化此線性化DNA模板，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度，并使用Nanodrop測定濃度。使用T7 RNA polymerase體外轉錄試劑盒將DNA模板轉錄，轉錄后的RNA使用純化試劑盒進行純化，純化的產物cRNA，再使用分光光度計測定濃度，并使用0.8%的瓊脂糖凝膠進行純度鑒定。選取1只腹部沒有斑點的非洲爪蟾，冰凍1 h麻醉，使用手術刀將爪蟾的腹部下側切開，用剪刀將肌肉剪開，取2片蛙卵置于OR-2溶液中，再用胰蛋白酶酶解成單個蛙卵，至大部分卵母細胞表面無膜，挑選其中個體均勻，無血絲，黑白分明的爪蟾卵母細胞。按照1∶1的比例混合成所需的亞型，保證每個細胞的注射量為50.6 nL，注射后的蛙卵置于含抗生素的ND96培養液中（96 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，pH7.1～7.7；抗生素：青霉素、10 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1慶大霉素），17 ℃培養2～3 d，表達α3β2受體亞型。

1.4 LvIA突變體活性的檢測將表達了特定受體的卵母細胞放置于細胞槽內，將雙電極電壓鉗裝好holder，再把灌注約1/23 mol·L-1KCl溶液的電極針安裝到holder上，將電極針浸入液面，調零，使其鉗制電壓為70 V,基準電流低于100 nA，將電壓膜片鉗打開到ON的模式，鉗住細胞，調節程序，每個Sweep（1 min）的第2秒的時候灌流系統給予蛙卵細胞100 μmol·L-1濃度的ACh刺激，其余時刻持續使用ND96溶液灌流。使用雙電極電壓鉗系統檢測和記錄蛙卵細胞的電流，待電流大小穩定以后，逐次加入經過梯度稀釋的待測定活性的LvIA突變體，孵育時間為5 min，再一次開啟程序，比較蛙卵細胞加藥前后2次產生電流的的大小差異，計算反應率（Response）。通過非線性擬合方程：Response=100/[1+([toxin]/IC50)nH]×100%進行擬合分析，獲取藥物作用的劑量反應曲線（IC50值），其中，nH代表Hill系數。

2 結果與分析

2.1 LvIA突變體合成純化線性肽，使其純度高于95%，用于后續的氧化折疊反應，連接2對二硫鍵，將所得產物通過HPLC和MS鑒定，具體結果見圖1-A、B。[D11H]LvIA在乙腈濃度23%時洗脫，洗脫時間為14.8 min；而[D11R]LvIA在乙腈濃度為25%時洗脫，洗脫時間是14.9 min。通過質譜確定了[D11H]LvIA和[D11R]LvIA的相對分子質量，分別為1702.95和1721.99Du，與理論值一致，且均比其線性肽的相對分子量少了4 Du，說明成功連接了2對二硫鍵并且末端酰胺化，見圖1-C、圖1-D。

圖1 LvIA突變體的HPLC和MS結果

2.2 乙酰膽堿受體模型建立提取包含鼠源α3、β2這2種亞基的質粒，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行純度檢測。從圖2-A可知，質粒條帶清晰，未發生拖尾情況，超螺旋結構大小在2500 bp左右，符合理論值大小。從圖2-B可知，條帶清晰可見，無彌散現象，超螺旋結構的大小在5000～7500 bp范圍內。使用紫外分光光度計測定線性質粒的質量濃度，質量濃度皆大于0.2 g·L-1，可以保證后續試驗的濃度要求。制備α3、β2這2種亞基的cRNA，所得RNA的凝膠電泳結果如圖2-C，圖中有1條明顯的亮帶，大小在750～1 000 bp之間，符合理論值，α3亞基的濃度為0.4 g·L-1，β2亞基的濃度為0.49 g·L-1。將2種亞基按照1∶1的比例混合，顯微注射到酶解好的爪蟾卵母細胞中(圖2-D)，表達2～3 d，使用激動劑ACh刺激，可以在細胞膜上檢測到內向電流,電流大小在200～2000 nA范圍內，如圖2-E。

圖2 α3β2 nAChR模型的建立

2.3 LvIA突變體活性檢測分別將LvIA和2種11位的LvIA突變體在表達α3β2 nAChR的非洲爪蟾卵母細胞上進行電生理活性檢測。在終濃度為10 μmol·L-1的孵育條件下，LvIA、 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA對α3β2nAChR的 阻 斷率分別為(95.8±2.8)%（n=6）、(9.8±2.5)%（n=7）和(12.4±3.1)%（n=5）（圖3），與野生型LvIA相比，2種11位突變體對α3β2 nAChR活性幾乎完全喪失。

圖3 LvIA及突變體對于α3β2 nAChR的電流軌跡圖

為了進一步確定2種LvIA 的11位突變體對于α3β2 nAChR的阻斷活性，筆者做了劑量反應曲線(圖4)，分別測定了[D11R]LvIA和[D11H]LvIA對α3β2 nAChR的IC50值，2種突變體對于α3β2 nAChR的IC50值分別為8976 nmol·L-1和6390 nmol·L-1（表1），活性與比本體的活性相比，分別降低了574.38%和408.62%。證明當第11位的Asp變化后，LvIA的活性大大降低。

圖4 LvIA及其突變體對于α3β2 nAChR的濃度反應曲線

表1 LvIA 及11位突變體在α3β2 nAChR上的IC50

3 討 論

α3β2 nAChR 是一種十分重要的受體，與疼痛、成癮等生理學作用密切相關。LvIA是一種十分重要的α-CTx，作用于α3β2 nAChR，是從疣縞芋螺中發現并且克隆得到的，對LvIA構效關系的研究將有益于獲得靶向α3β2 nAChR的相關分子探針，有助于對與α3β2 nAChR相關的藥理學研究。目前，發現能夠作用于α3β2 nAChR的α-CTx的有很多，其中，GIC、MII、OmIA和PeIA等具有較強的靶向作用，針對這些芋螺毒素的突變改造對于本實驗具有借鑒作用[23-24]。如：在對α-CTx MII的研究中發現，MII第11位的谷氨酸（Glu）與α3-β2亞基上帶正電荷的殘基如：(+) K153和(-)K163形成相互作用，促進MII與α3β2 nAChR的結合，11位對保證MII的活性至關重要[25]。利用共結晶技術對α-CTx GIC的研究發現其第7位的Ala、11位的Asn和12位的Asn對于GIC與受體的結合具有十分重要的作用，特別是11位的Asn可以通過形成氫鍵與Ac-AChBP相互作用，如果改變11位的氨基酸，會影響GIC與受體的結合，11位氨基酸對于α-4/7型CTxs與受體的結合起到至關重要的作用[26]；在PeIA的相關研究中，也發現11位氨基酸分別突變為Arg和Lys之后，對α3β2 nAChRs的IC50分別變為30.9μmol·L-1和45.4 μmol·L-1，基本喪失了活性[27]，上述結果都證明了11位氨基酸對于α-4/7型CTx活性影響顯著。

根據前期研究，發現β2亞基上的3個位點：T59K、V111I、F119Q對α-CTx LvIA的敏感性有顯著影響，受體突變加電生理結果表明受體上59、111和119的3個位置，是與LvIA結合的關鍵位點。羅素蘭研究團隊對LvIA前期研究中，獲得了LvIA與Ac-AChBP的共晶結構。借助共晶結構和分子動力學模擬發現α3亞基中的Lys-155可以與LvIA中帶負電荷的Asp-11形成鹽橋，增加相互作用，說明第11位的Asp對于LvIA與α3β2 nAChRs的相互作用影響較大，但是將第11位突變成Ala之后活性保持不變，所以本研究希望在前期基礎上進一步深入探究第11位如何影響LvIA對于α3β2 nAChRs的活性，針對11位所設計的兩個突變體[D11R]LvIA和[D11H]LvIA，當第11位氨基酸突變成堿性氨基酸Arg和His之后，2個突變體的活性都極大的降低。結合前期共晶結構和分子動力學模擬分析，當11位突變為堿性氨基酸后，與α3亞基中的Lys-155都為堿性氨基酸，同性相斥，結合力減弱，造成了LvIA活性的降低。該研究探究了11位的重要作用，為今后基于LvIA的分子設計和改造提供了基礎。