浮游細菌群落結構及其與網箱養殖魚病害的關系

陳 鶴，李筱鑫，崔 婧，蒙愛云，駱大鵬，劉慶明，邱名毅，涂志剛

（1.海南省海洋與漁業科學院，海口 571126;2.新南威爾士大學，新南威爾士州 悉尼 4385）

后水灣網箱魚類養殖區位于海南島西北部，儋州市和臨高縣境內，以深水網箱養殖為主，主要養殖品種為卵形鯧鲹，年養殖產量達到5×104t，為我國最大的深水網箱養殖基地[1]。然而，由于長期開展網箱養殖以及養殖規模不斷擴大，養殖區的環境污染問題越來越突出。浮游細菌作為水體中各種有機物質的分解者和轉化者，又是物質和能量的貯存者，在水體物質循環和能量流動中具有重要的作用[2-4]。同時，有些細菌，如弧菌、鏈球菌還是近海養殖的條件致病菌[1]。每當臺風過后，養殖環境條件惡化時，這些有害細菌大量增殖，導致海水養殖魚類發病[5]。已有研究結果[6]表明，養殖區微生物分布與魚類疾病發生緊密相關。浙江舟山網箱養殖區網箱內細菌數量高于網箱外細菌數量，且細菌豐度的高峰期也是魚類發病最嚴重的時期[7]。大亞灣網箱養殖水體中網箱內的細菌數量高于網箱外和對照區，且弧菌出現的高峰期與弧菌病害的流行期一致[8]。象山港網箱養殖區浮游細菌數量和弧菌數量均高于對照區，而多樣性均低于對照區，且某些特定細菌富集較為嚴重[9-10]。因此，監測網箱養殖區域微生物群落結構和多樣性的動態變化，探究浮游細菌群落，特別是潛在病原菌的分布規律，有助于在養殖生產過程中及早采取措施預防網箱養殖魚類病害的爆發，推動深水網箱養殖產業健康可持續發展。本研究利用高通量測序技術分析臨高后水灣深水網箱養殖區浮游細菌群落結構的動態變化，并探討浮游細菌群落變化與魚類細菌性病害的關系，研究結果將有助于揭示深水網箱養殖區不同養殖期浮游菌群變化規律，了解潛在病原菌對網箱養殖魚類的危害，為深水網箱養殖的健康發展及養殖魚類疾病的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理樣品均采自海南臨高后水灣深水網箱養殖基地。采樣時間分別為2016-03-15、2016-05-16、2016-07-18、2016-09-16、2016-11-14的漲潮期。根據養殖過程，將其分為4個階段，其中3月份為休養期，5月份為養殖初期，7月份和9月份為養殖中期，11月份為養殖后期。取樣點共設置3個站位，分別為22號網箱內、網箱外以及對照區（離網箱養殖區1 km向海一側的非養殖區），編號分別為03in，03out，05in，05out，05con，07in，07out，07con，09in，09out，09con，11in，11out，11con，每個站位3個重復。將采集到的水樣低溫運回實驗室，充分搖勻后，重復組水樣等量混合，先用3μm無菌濾膜預過濾，再用0.22μm無菌濾膜過濾1L等量混合后的水樣，將過濾后的濾膜4℃保存備用。同時，統計監測月份該網箱每天病死魚數量。

1.2 基因組DNA提取利用OMEGA試劑盒（E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit）提取宏基因組DNA。采用NanoDrop微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性，用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒檢測DNA濃度。將符合實驗要求的DNA置于-20℃保存，備用。

1.3 樣品浮游細菌16S rDNA PCR擴增 DNA樣品委托上海生工生物工程有限公司測序，采用16S rDNA V3-V4通用融合引物341F(5′-CCCTA CACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTT CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGG GTATCTAATCC-3′)進行PCR擴增；擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，采用生工瓊脂回收試劑盒（Cat:SK8131）純化回收；利用Illumina Miseq測序平臺進行高通量測序。

1.4 數據分析所獲得的序列分別利用Qiime（version1.7.0）和Mothur軟件（version 1.31.2）進行過濾和去除嵌合體序列[11]，得到高質量的基因序列[12]。再運用Mothur軟件對序列進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。相似度在97%以上的OTU代表序列采用RDP classifier貝葉斯算法[13]進行分類學分析，統計每個樣品的群落組成。基于OTU聚類分析結果，對OTU進行Alpha多樣性指數等分析、群落結構的統計分析以及unifrac等分析[14-15]，最后進行群落結構和系統發育等的統計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 Illumina序列多樣性根據16S rRNA基因高通量測定結果，在采集的14份水樣中共得到758641條原始序列，處理后得到686191條高質量序列，每個樣品序列數目為28032～65019條不等，序列長度平均值為421 bp。稀釋曲線分析（圖1-A）顯示，隨著測序數量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明該測序量已經基本能反映該實驗中細菌群落多樣性。浮游細菌香農-威納指數如圖1-B所示，平均值變化范圍為2.47～4.5，不同養殖期差異較大，總體上表現為養殖后期>休養期>養殖初期和養殖中期。

圖1 各樣品的浮游細菌16S rRNA基因的α多樣性分析

2.2 主成分分析和聚類分析主成分分析（PCA）結果顯示（圖2-A），浮游細菌菌群可分為4組，分別為休養期、養殖初期、養殖中期、養殖后期。這表明養殖區水體中菌落組成與不同養殖期關系較大。基于Unifrac的聚類分析，可以分為3組，休養期、養殖后期、養殖初期和中期（圖2-B）。科水平的細菌群落Heatmap分析結果基本一致，相同養殖期能較好地聚在一起（圖2-C）。

圖2 不同月份網箱內外及對照區樣品浮游細菌群落相似性分析

2.3 浮游細菌多樣性

2.3.1 浮游細菌群落組成在采集到的14份樣品中，共檢測到36個門、56個綱、98個目、235個科、807個屬的浮游細菌。未能鑒定的序列總數為41404，占總序列數的6.21%，表明樣本中還有大量未知的類群。浮游細菌群落分布結構（圖3）相對較為穩定，以變形菌門（Proteobacteria）γ-變形菌綱為主要的優勢類群；次優勢類群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和藍細菌門（Cyanobacteria），以上5類菌門相對比例之和變化范圍為97.14%～99.63%，其他類菌門所占比例之和不足3%。

圖3 門水平浮游細菌群落組成

在科的水平上（圖4），養殖區以鹽單胞菌科（Halomonadaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、交替單胞菌科（Alteromonadaceae）等為主要的優勢類群，其中鹽單胞菌科為養殖初期和養殖中期主要優勢類群，其相對豐度最高可達61.16%；紅桿菌科為休養期的主要優勢類群；弧菌科細菌在各監測站位均有發現，以5月份和9月份網箱內豐度最高，相對豐度分別為9.91%和15.85%；藍細菌門的Family II科為養殖后期的優勢類群。

圖4 科水平浮游細菌群落組成

在屬水平上（圖5），浮游細菌群落主要優勢類群包括Cobetia屬、弧菌屬（Vibrio）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）以及藍細菌門的GpIIa屬等。其中，休養期的優勢類群為Cobetia屬、玫瑰變色菌屬（Roseovarius）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；養殖初期以Cobetia屬、假交替單胞菌屬、Kushneria屬和弧菌屬為主，其中網箱內外弧菌相對豐度分別為9.61%和1.06%；養殖中期以Cobetia屬、鹽單胞菌屬、交替單胞菌屬（Alteromonas）和弧菌屬為主，其中9月份網箱內外弧菌屬相對豐度分別為14.52%和4.11%；養殖后期優勢類群為GpIIa屬和Cobetia屬。

圖5 屬水平浮游細菌群落組成

2.3.2 網箱內外浮游細菌群落豐度差異性分析根據監測月份菌落豐度誤差線（圖6）可知，各養殖階段差異菌群不同，休養期網箱內外主要差異菌群為Cobetia屬、嗜冷桿菌以及黃桿菌屬等（圖6-A）；養殖初期主要差異菌群為Cobetia屬、Kushneria屬、假交替單胞菌屬、弧菌等（圖6-B），其中網箱內弧菌、發光桿菌和交替單胞菌相對豐度高于網箱外；養殖中期主要差異菌類群為Cobetia屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬等（圖6-C、D）；養殖后期主要差異菌類群為GpIIa屬、Cobetia屬等(圖6-E)。

圖6 各監測月份屬水平網箱內外浮游細菌菌落豐度誤差線圖

2.4 深水網箱養殖區弧菌與網箱養殖魚類病害的關系監測月份網箱內弧菌相對豐度與網箱內單日平均死魚數量關系（圖7）表明，在弧菌相對豐度含量較高的5、9月份，每天每口網箱的病死魚數量分別達到(484±241)尾和(278±110)尾；而弧菌相對豐度較低的7月份和11月份，每天每口網箱病死魚數量分別為(26±12)尾和(50±22)尾。

圖7 不同月份弧菌相對豐度與監測區域每日每口網箱平均死魚數量的關系

由此可見，養殖初期和養殖中期9月份網箱內弧菌含量最高，且均顯著高于網箱外弧菌相對豐度，而休養期、養殖中期7月份以及養殖后期網箱內外弧菌屬相對豐度較低，表明調查區域水體中弧菌出現的高峰期在養殖初期和養殖中期9月份。根據監測月份網箱內單日平均死魚數量可知，細菌性疾病引發魚類死亡的高峰期也為每年5月份和9月份，表明弧菌引起的細菌病害為引起后水灣深水網箱養殖區域魚類死亡的主要病害類型。后水灣每年從3月底至4月初開始投放卵形鯧鲹魚苗進行標粗，至5月份魚苗規格可以達到每尾10～15 cm，周長80 m的網箱放養密度每口高達40萬～60萬尾。高密度養殖會引起網箱養殖區域殘餌及糞便增多，水體中營養鹽富集，適宜弧菌等異養菌的生長。因此，5月份是養殖卵形鯧

鲹弧菌病害發生的第一個高峰期。7月份，經過標粗的卵形鯧鲹苗被分裝到其他網箱，網箱養殖密度隨之下降，養殖區水體環境得到有效改善，短期內養殖魚類病害明顯減少。8月中下旬，隨著海水平均溫度下降到28～30 ℃，網箱養殖魚類開始感染刺激隱核蟲，隨后繼發性感染細菌，引起魚類出現爛身、爛尾等病害，嚴重時魚類會出現大量死亡。因此，9月份是后水灣網箱養殖魚類弧菌病害發生的第二個高峰期。每年3月份和11月份海水溫度較低，水體中以Cobetia和GpIIa屬等細菌為主，弧菌含量較低，網箱養殖魚類病害也較少。

3 討 論

3.1 深水網箱養殖區浮游細菌群落多樣性傳統的研究方法只能探測到環境中極少部分的微生物群落信息（0.01%～10.0%），難以客觀地揭示微生物類群及多樣性[16-17]。本研究利用16S rRNA基因高通量測序技術對深水網箱養殖區浮游細菌群落結構進行分析，結果表明，所獲得測序樣品文庫的覆蓋率均在99%以上，能夠較高程度地反映水體中浮游細菌群落的多樣性。調查區域浮游細菌Shannon-Wiener多樣性指數平均值為3.65，表明浮游細菌群落比較豐富，多樣性水平均較高。究其原因可能是調查期間海水平均溫度均高于27℃，總體上適宜細菌繁殖與生長；此外，由于監測區域深水網箱養殖區位于離岸2 km，水深為15 m以上水域，水質良好，水體懸浮物濃度為0.5～7 mg·L-1，透光性好，初級生產力強，能為浮游細菌生長提供源源不斷的營養物質。不同養殖期差異較大，總體上表現為養殖后期>休養期>養殖初期和養殖中期，這可能是養殖初期和養殖中期，水體富含營養鹽，一些異氧菌，如鹽單胞菌屬、交替單胞菌屬、假交替單胞和弧菌屬等異氧菌含量較高，浮游細菌多樣性下降；而在休養期和養殖后期，營養鹽含量較低，不適宜異氧菌生長，其他菌屬，如玫瑰變色菌屬、嗜冷桿菌屬和GpIIa屬等成為優勢菌屬，浮游細菌多樣性升高。

3.2 深水網箱養殖區浮游群落組成特征不同海域浮游細菌群落組成存在差異。洋山港水域細菌主要由變形菌、擬桿菌這兩大類組成，其中γ-變形菌為優勢類群[18]；山東近海海水樣品中α-變形菌為優勢類群[19]；北黃海近海海水樣品中γ-變形菌和黃桿菌為優勢類群[20]；南海南部海域浮游細菌群落優勢類群為變形菌門γ-變形菌綱和α-變形菌綱、藍藻門藍藻菌綱和擬桿菌門黃桿菌綱[6]。臨高后水灣深水網箱養殖區主要的優勢類群為變形菌門的γ-變形菌。盡管如此，這些類群均為海水常見細菌類群，與國內外海洋細菌組成的相關研究結果一致[21-23]。

不同養殖期屬水平優勢類群差異較大，可能與溫度和營養鹽變化有關。Cobetia屬因為具有較強的適應能力，對溫度、鹽度和溶解氧的適應范圍廣[24]，成為各養殖期的主要優勢類群。弧菌等異養菌的分布受溫度、總有機碳、總磷和活性磷酸鹽等環境因子驅動[25]，在溫度以及總氮或者總磷含量較高的養殖初期和中期，弧菌等異養菌的相對豐度也較高。藍細菌豐度僅在養殖后期最高，可能的原因為養殖后期大量浮游植物繁殖，導致秋季營養鹽低于春季[26]，營養鹽降低不利于異氧菌生長，而藍細菌可以通過光合作用成為該時段的優勢類群。嗜冷桿菌為一種革蘭氏陰性菌，目前已知的嗜冷桿菌種類主要來自南極冰層、永久凍土以及海洋等環境[27]，嗜冷桿菌的分布主要與溫度有關，溫度越低，嗜冷桿菌相對豐度越高，也與本次研究結果一致。

3.3 浮游細菌群落組成與魚類疾病的關系網箱養殖卵形鯧鲹受細菌性病害和寄生蟲病害危害較大，特別是由于刺激隱核蟲病害發生后繼發性細菌感染越來越嚴重。目前已報道的卵形鯧鲹細菌性病原菌包括哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonas maltophilia）、美人魚發光桿菌殺魚亞種（Photobacterium damselaesubsp.piscicida）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolae）[5,28-31]，尤其以弧菌引起的病害最為嚴重，且哈維氏弧菌已經成為影響海南海水養殖魚類弧菌病的主要病原菌[32]。

網箱養殖初期和中期由于養殖密度較大，網箱內魚類殘餌及糞便增多，易引起水體中營養鹽富集，為弧菌快速繁殖提供了有利條件，從而引發網箱養殖魚類弧菌病害。湛江港網箱養殖海區弧菌豐度出現在營養鹽豐富、水溫較高、水體污染嚴重的夏、秋季，且優勢弧菌種類以哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌為主[10]。基于16S rDNA宏基因組構建的系統進化樹分析結果顯示，后水灣監測月份優勢弧菌屬分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、塔氏弧菌、鰻弧菌、錫那羅州弧菌等致病性弧菌聚類，進一步表明弧菌可能為引起后水灣深水網箱養殖區魚類發病的主要潛在病原菌。

4 結 論

后水灣深水網箱養殖區浮游細菌群落具有高度豐富的多樣性，變形菌門是養殖區主要優勢門類，其次為擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍細菌門；主要類群為Cobetia屬、弧菌屬（Vibrio）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）以及藍細菌門的GpIIa屬等，不同養殖期優勢類群差異較大。網箱內外主要差異類群為Cobetia屬、假交替單胞菌屬和弧菌屬等。潛在致病菌弧菌屬在養殖初期、中期含量較高，而在休養期和養殖后期含量較低，與網箱養殖卵形鯧鲹細菌性病害發病規律相吻合，表明弧菌病為該養殖區魚類的主要病害類型。