微生物合成5-羥基色氨酸的研究進展

翁可欣，張明亮，李 力

（福建師范大學 生命科學學院，福州 350117）

5-羥基色氨酸（5-Hydroxytryptophan，5-HTP）是一種色氨酸衍生物，由色氨酸羥化酶催化，使色氨酸苯環上5′位氫原子被羥基取代[1]。在哺乳動物體內，5-HTP可脫羧轉化為5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT），也稱為血清素，參與調節情緒、認知、學習、記憶、睡眠和其他生理過程[2]。5-HT可進一步轉化為褪黑素（Melatonin，MT），該激素由松果體釋放，具有調節睡眠的作用[3-4]。5-HTP是5-HT和MT的重要前體，在抗抑郁、減肥、治療失眠和頭痛等方面有重要作用。但是，攝入過量的5-HTP可能導致血清素綜合征，產生一定的副作用，例如躁動、神志不清、心動過速、出汗和血壓波動等[5]。

5-HTP主要來源是從非洲豆科植物加納（Griffonia simplicifolia）種子中提取，但是植物的生長周期長，并受季節和地域的限制，產率低，不適合工業化應用[6]。化學合成方法的周期長、耗資大，需在高溫高壓環境下合成，易造成環境污染，且色氨酸區域選擇性羥基化較難實現，同樣不適用于大規模合成[7-8]。微生物合成具有生產周期短、成本低、產量高和易于大規模生產等優點，具有巨大的應用前景。筆者著重闡述定向進化提高芳香族氨基酸羥化酶的羥化活性、輔酶因子合成和再生途徑的引入和代謝工程優化5-HTP合成效率等方面闡述了微生物合成5-HTP的進展，旨在為5-HTP的規模化生產研究提供資料。

1 5-HTP的生物合成途徑

在生物體內，5-HTP由色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）催化L-色氨酸（LTryptophan，L-Trp）和O2合成，此過程需要四氫生物蝶呤 ( Tetrahydrobiopterin，BH4)和Fe2+作為輔助因子[9]。TPH是芳香族氨基酸羥化酶（Aromatic amino acid hydroxylases，AAAH）家族的一員，它是單加氧酶，催化時將O2中一個氧原子與底物結合，并將另一個氧原子還原為H2O，還原為H2O所需的2個電子由BH4提供[10]。在這個過程中，輔助因子BH4至關重要。BH4合成從GTP開始，GTP被GTP環化水解酶Ⅰ（GTP CyclohydrolaseⅠ，GCHI）催化生成7,8-三磷酸二氫新蝶呤(7,8-Dihydroneopterin triphosphate，H2NTP)，再在6-丙酮四氫蝶呤合成酶(6-Pyruvoyl Tetrahydropterin Synthase，PTPS)的作用下生成6-丙酮-5,6,7,8-四氫蝶呤（6-Pyruvoyl-5,6,7,8-tetrahydropterin，PTP），最后由墨蝶呤還原酶(Sepiapterin Reductase，SPR)催化，轉化成終產物BH4[11]。在哺乳動物體內，BH4作為輔酶被消耗后，會轉化成蝶呤-4α-甲醇胺(BH4-4α-carbinolamine，4α-OH-BH4)，在蝶呤-4α-甲醇胺脫水酶（Pterin-4α-carbinolamine dehydratase，PCD)的作用下生成醌型雙氧蝶呤(Quinonoid Dihydrobiopterin,qBH2)，在雙氫蝶啶還原酶（Dihydropteridine Reductase，DHPR）的催化下再生成BH4，完成BH4循環（圖1）[12]。

圖1 大腸桿菌內構建5-HTP 生物合成途徑

2 大腸桿菌異源表達生產5-HTP

在大腸桿菌內構建5-HTP生物合成途徑需要3個模塊，分別為色氨酸羥化酶模塊、BH4從頭合成模塊和BH4循環模塊（圖2）。

圖2 原核生物PAH催化途徑（灰色部分為MH4循環）

2.1 芳香族氨基酸羥化酶的異源表達AAAH是非血紅素亞鐵和BH4依賴的單加氧酶，它們包括色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）、苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine hydroxylase，PAH）和酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）。這3種酶都使用BH4和O2為輔助因子，分別催化色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸轉化為5-HTP、酪氨酸和左旋多巴[13]。其中，人類TPH有2種亞型，由2個不同的基因編碼。最早被發現且研究最多的是TPH1，主要存在于松果體和腸道系統，而TPH2主要存在于神經細胞[14]。

Moran等[15]首先在大腸桿菌中表達了野生型兔源色氨酸羥化酶（TRH）以及該酶2種截短的突變蛋白，發現野生型兔源色氨酸羥化酶表達水平較低，且刪除N端調節域101個氨基酸的突變蛋白主要以包涵體的形式存在，但同時刪除N端101個氨基酸與C端28個氨基酸的蛋白質TRH102-416表達量為細胞總蛋白的30%。其結果表明，兔源TRH102-416是一種穩定、高活性的TRH形式，可在大腸桿菌中高水平表達。MCKINNEY等[16]在大腸桿菌中表達了全長的人TPH，將其與麥芽糖結合蛋白（Maltose binding protein，MBP）結合（MBP-TPH），使TPH迅速而有效地折疊成天然結構，促進TPH的可溶性表達，與6×His-TPH融合蛋白相比，MBP-TPH比酶活高出3倍。WINDAHL等[17]對雞的色氨酸羥化酶晶體結構進行了研究，發現與色氨酸結合的疏水性口袋由殘基Tyr236、Thr266、Pro269、His273、Phe314、Phe319和Ile367等組成，且其中Fe2+配位結構是非血紅素依賴的配位結構，與人類TPH1的結構相比，其整體結構更緊湊，在活性位點周圍有兩個閉合環。

由于真核生物酶的低溶解性、低穩定性以及特定的翻譯后修飾，真核生物的AAAH難以在大腸桿菌中以可溶的和穩定的形式表達[16,18]。雖然使用截短的蛋白或融合蛋白可獲得可溶性和有活性的酶，但這類AAAH在大腸桿菌中羥化活性仍然較低[18]。相反，細菌AAAH在大腸桿菌內表達更穩定，更有利于提高芳香族氨基酸的羥化活性。KINO等[19]利用紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)PAH（CviPAH）的晶體結構信息，對CviPAH的第101位亮氨酸（L101）和第180位色氨酸（W180）進行飽和突變后發現，第101位亮氨酸突變為酪氨酸（L101Y）和第180位色氨酸突變為苯丙氨酸（W180F）后，L-色氨酸羥化活性提高至5.2倍。

2.2 輔酶因子供應系統

2.2.1 BH4的合成與再生色氨酸羥化酶催化過程需要BH4作為輔助因子，但大腸桿菌不含內源性BH4，因而BH4合成與再生途徑的構建是色氨酸羥化酶途徑的重點。Yamamoto等[20]在大腸桿菌內表達GCHI、PTPS和SPR等3個酶基因，在大腸桿菌內成功構建BH4合成途徑，并進一步提高BH4產能，最大產率達到約4.0 g·L-1。Ryotaro等[19,21]在2009年研究的基礎上，在大腸桿菌內表達CviPAH的突變體（CviPAH.L101YW180F），敲除宿主內降解L-Trp和5-HTP的色氨酸酶基因（ΔtnaA），并導入BH4輔酶因子的再生系統（PCD，DHPR）和NADH再 生系 統，促進5-HTP的合成。通過添加BH4和L-Trp，并優化反應條件，最終5-HTP產率為2.5 mmol·L-1，實現了BH4再生系統的應用，提高了BH4的利用率。但該研究仍需添加BH4和L-Trp作為底物，并不是微生物合成5-HTP的最佳方法。一項專利[22]在大腸桿菌中表達截短的兔源TPH1，同時導入BH4的生物合成途徑和再生系統，實現了GTP從頭合成BH4以及再生BH4。該專利在大腸桿菌(ΔtnaA)內共表達6個酶（TPH1、GCHI、PTPS、SPR、PCD、DHPR），在不添加BH4以及L-色氨酸的培養基中生 產 了0.9 mmol·L-1(相 當 于198 mg·L-1)的5-HTP。Wang等[23]在大腸桿菌(ΔtnaA)內異源表達曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）TPH（SmTPH）以及BH4從頭合成和循環途徑，在含有2 g·L-1的L-Trp的培養基中發酵60 h生成0.93 g·L-1的5-HTP。

2.2.2 不同輔酶因子—MH4真核生物AAAH在大腸桿菌中常以包涵體的形式表達，而原核生物AAAHL-色氨酸羥化活性非常低。但據報道，當紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)PAH突變時將提高L-色氨酸羥化活性[19]。同時有實驗表明[24-25]，部分細菌PAH可利用四氫蘇式新蝶呤(Tetrahydromonapterin，MH4)代替BH4作為輔酶進行羥化反應，MH4參與反應后可轉變為4α-羥基四氫喋呤（4α-Hydroxytetrahydropterin，4α-MH4），再經PCD催化為二氫單氫蝶呤(Dihydromonapterin，MH2)，MH2可以進一步還原為MH4，完成MH4循環。大腸桿菌含有內源性MH4，但缺少MH4循環系統，MH4是大腸桿菌中蝶呤的主要存在形式（圖2）。

Lin等[26]比對5個微生物PAH后發現，野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）PAH(XcPAH)對苯丙氨酸和色氨酸的活性較高，在其預測的晶體結構中，W179位于活性口袋內，將其突變可改變XcPAH的底物偏好，結果表明，XcPAH-W179F突變體色氨酸羥化活性是野生型的17.4倍，同時突變體苯丙氨酸羥化活性降低了約20%。XcPAHW179F可以利用大腸桿菌內源MH4作為輔酶，因此，研究人員共表達XcPAH-W179F、PCD和DHMR成功構建色氨酸羥化途徑和MH4循環系統。將該系統轉入大腸桿菌內，同時添加2 g·L-1的LTrp作為底物，在30℃培養16 h可合成1.1 g·L-15-HTP，但不添加L-Trp時，僅可生成152.9 mg·L-15-HTP。由于在大腸桿菌中已實現了L-Trp的高水平生產（高達48.7 g·L-1）[27]，將該系統導入色氨酸高產菌株并對其進行優化有望獲得5-HTP高效生產菌株。

Mora-Villalobos等[28]比較了10種細菌AAAH對色氨酸的親和性，發現臺灣銅綠假單胞菌（Cupriavidus taiwanensis）AAAH（CtAAAH）對色氨酸親和性較高，通過與色氨酸偏好的酶進行比較發現CtAAAH-W192與L-Trp的吲哚環的結合有關，對該位點突變可改變其底物偏好。與野生型相比，突變體CtAAAH-W192F的色氨酸羥化活性提高了5.5倍，苯丙氨酸羥化活性降低了約10%。將該突變體轉入大腸桿菌（ΔtnaA）內，同時表達MH4循環系統，在添加5 mmol·L-1L-Trp的培養基中培養24 h后，可合成2.5 mmol·L-1的 5-HTP。

2.2.3 通過代謝工程優化5-HTP合成利用代謝工程平衡細胞代謝網絡，可進一步提高5-HTP產量。細胞內L-色氨酸的合成起始于3-脫氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸( 3-Deoxy-Darabino-heptulosonic acid 7-phosphate，DAHP)。磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)與赤蘚糖-4-磷酸（Erythrose-4-phosphate，E4P）經aroH基因編碼的DAHP合成酶（DAHP synthase）催化合成 DAHP，再經分支酸途徑合成分支酸(Chorismate，CHA），CHA在色氨酸操縱子的催化下合成L-色氨酸（圖3）[29]。這一過程中，aroH與trpE基因的表達與蛋白活性都受到色氨酸的反饋抑制。點突變與啟動子替換可以解除色氨酸對AroH 與TrpE的反饋抑制，將代謝流向有利于色氨酸合成的方向，增加色氨酸在宿主細胞內的累積量，以提高5-HTP的合成[30]。

圖3 大腸桿菌中 L-色氨酸合成途徑相關調控

大腸桿菌trpR基因編碼一種阻遏蛋白TrpR，它能夠控制色氨酸操縱子的表達，當有高濃度的L-Trp存在時，TrpR可與L-Trp形成二聚體，與色氨酸操縱子結合，阻止轉錄，L-Trp的生物合成途徑停止。當L-Trp含量低時，TrpR處于失活狀態，色氨酸操縱子可正常轉錄[31]。在大腸桿菌內敲除trpR基因可實現L-Trp的累積，有利于5-HTP的合成。

Mora-Villalobos等[32]在2017年研究的基礎上對CtAAAH再次進行優化，構建了雙突變體CtAAAH-F197L/E219C(CtAAAH-LC)，與 單 突 變體CtAAAH-W192F相比，CtAAAH-LC的Km值更 低(0.95 mmol·L-1)，反 應 速 度 更 快(Vmax=1.9 mmol·L-1·s-1）。同時，構建了菌株TrpD-Pl，該菌株以LIN等[30]人的色氨酸高產菌株S028為出發菌株，敲除了基因trpR，并含有人MH4再生系統(PCD，DHMR)。將CtAAAH-LC轉入菌株TrpDPl 中進行分批補料發酵，60 h后，色氨酸含量達（23.4±1.4）g·L-1，5-HTP產量為（962±58）mg·L-1。

Wang等[33]進一步對L-色氨酸生產模塊、色氨酸羥基酶模塊和BH4模塊進行優化。作者在大腸桿菌內表達人源TPH，將BH4的合成與再生系統同時導入大腸桿菌內，并解除色氨酸對TrpE和AroH的反饋抑制（aroHfbr和trpEfbr），在未添加LTrp和BH4的搖瓶中發酵116 h，可合成3.97 g·L-1的L-Trp和314.8 mg·L-1的5-HTP。再經代謝工程調控，對L-色氨酸模塊、色氨酸羥基酶模塊和BH4模塊優化。研究表明，截短的TPH在大腸桿菌中可溶性和穩定性將提高[34,35]，將截短的TPH145(TPH2 NΔ145/CΔ24)代替TPH進行搖瓶發酵，最終合成424.7 mg·L-1的5-HTP，產率提高34.9%。前期的實驗表明，L-Trp在宿主內大量累積卻未轉化成5-HTP，推測合成L-Trp將消耗大量的營養物質，不利于5-HTP的合成。用低拷貝質粒表達aroHfbr和trpEfbr，L-Trp產量顯著降低（207.9 mg·L-1），同時，5-HTP的產量增加至532.6 mg·L-1。再經啟動子優化，降低BH4合成和循環途徑過度表達的負擔，最終5-HTP和L-色氨酸產量顯著增加，搖瓶發酵分別為1.3 g·L-1和1.7 g·L-1。在以甘油為碳源的補料分批發酵罐中發酵，5-HTP最終產量為5.1 g·L-1。由于多質粒表達在發酵后期穩定性較差，為了增加羥化途徑的穩定性，將aroHfbr和trpEfbr整合到大腸桿菌基因組中，同時降低了色氨酸羥化質粒拷貝數和aroHfbr啟動子的強度，以重新平衡和優化代謝途徑，最終5-HTP搖瓶發酵產量為1.61 g·L-1，提高了24.8%，LTrp產量為0.20 g·L-1，降低了88%[36]。

除了大腸桿菌異源表達生產5-HTP外，Zhang等[37]首次在釀酒酵母BY4741內成功合成了5-HTP，通過異源表達原核PAH或真核色氨酸3/5-羥化酶，以MH4或BH4兩種輔助因子增強合成5-HTP。此外，釀酒酵母中天然基因DFR1與大腸桿菌中的folM基因具有相似的功能，經過基因DFR1敲除，證實在釀酒酵母中DFR1基因通過再生MH4對5-HTP的合成起著關鍵作用，為利用代謝工程促進酵母生產5-HTP奠定了基礎（表1）。

表1 微生物異源合成5-HTP

3 展 望

在微生物內合成5-HTP需要芳香族氨基酸羥化酶、輔酶因子合成系統和輔酶因子再生系統3個模塊。前期研究表明對TPH進行突變、截短或融合標簽可提高該酶在宿主內羥化活性，將BH4合成系統和再生系統導入宿主細胞與TPH共表達，可成功構建色氨酸羥化途徑[34-35]。部分細菌PAH可利用MH4代替BH4作為輔酶進行羥化反應，提高PAH色氨酸羥化活性、表達MH4循環系統，亦可構建色氨酸羥化途徑[24-25]。經代謝工程調控增加L-Trp在宿主內的積累量可進一步提高5-HTP的產率。目前，微生物發酵生產5-HTP最高產量為5.1 g·L-1，但仍無法大規模商業化生產，今后的研究重點可集中在以下幾個方面：（1）5-HTP合成與宿主細胞生長相關，高強度表達將影響細胞生長，無法高效合成5-HTP[36]。因此，代謝途徑的優化與平衡更為重要，可集中研究3個模塊和L-Trp代謝工程調控中不同表達強度對5-HTP合成的影響，提高5-HTP合成率，降低LTrp在宿主細胞內的殘留量；（2）需進一步優化培養基組成以及發酵過程中溫度、pH、溶氧等參數對宿主細胞內L-Trp轉化率和5-HTP積累量的影響，確定最優發酵工藝條件；（3）仍需研究5-HTP分離純化技術，探索發酵液固液分離和脫色等工藝流程，結合納濾膜和微濾膜等新興技術提高回收率、獲得高純度產品，實現微生物合成5-HTP商業化生產。在生物活性方面，已有研究表明過量攝入5-HTP將產生一定副作用，仍需深入探索藥理毒理機制，為臨床使用5-HTP提供數據支持。此外，釀酒酵母被認為是安全無毒的模式生物[38]，在釀酒酵母內合成5-HTP研究較少，可通過基因組挖掘進一步研究不同芳香族氨基酸羥化酶在釀酒酵母內的高活性表達以及兩種輔酶因子合成與再生途徑的構建，同時需改造釀酒酵母內L-Trp的代謝通量和協調代謝平衡，為研究釀酒酵母合成5-HTP提供新的技術支持。