橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜特征及其在聚類分析中的應用

徐鑫澤，施澤坤，紀曉貝，李志剛，李 瀟，劉文波，林春花，繆衛國

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228）

炭疽菌（Colletotrichumspp.）是一類分布范圍廣泛的植物病原真菌[1]。橡膠樹炭疽病在橡膠種植園區普遍發生，是橡膠樹的葉部“兩病”之一，可造成葉片脫落、嫩梢回枯、果實腐爛等一系列癥狀，導致割膠時間推遲，產膠量下降[2]。在多數植膠園中，橡膠樹主要受膠孢炭疽菌復合群（Collectotrichum gloeosporioidesspecies complex）侵染，部分報道受尖孢炭疽菌復合群（Collectotrichum acutatumspecies complex）侵染[3]。在我國，橡膠樹炭疽菌主要由膠孢炭疽菌復合群下的暹羅炭疽菌（Collectotrichum. siamense）和果生炭疽菌（Collectotrichum fructicola）所引起[4]。

鑒于炭疽菌危害的嚴重性，其分類問題一直是植物病理學與菌物學研究的熱點。炭疽菌繁多的種類，豐富的遺傳多態性，復雜的復合種群為在種水平上的鑒定帶來了諸多困難。目前，針對炭疽菌的有效分類手段還是以形態學與分子生物學為基礎[5]。在形態學分類中，菌落特征、分生孢子、分生孢子梗、產孢細胞形態、附著孢形態以及其他結構為主要鑒定依據，并結合培養特征和寄主范圍作為輔助手段[6]，但炭疽菌的特征往往隨不同的環境條件的變化而改變，即使在純培養的條件下，分生孢子與分生孢子梗、附著孢和菌絲的形態與大小也未必是完全相同的。不穩定的因素、種水平上相似的結構特征與繁瑣的實驗流程影響了炭疽菌的快速識別與鑒定。基因序列分析滿足了快速、準確、靈敏的分類要求，例如核糖體DNA內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer,ITS）序列是炭疽菌分子手段鑒定中使用最廣泛的片段[7-10]，但基于ITS的序列分析依然存在不準確性，對于復合群間或復合群內的近緣相似種，單基因序列的分析并不能準確反應其親緣關系，因此無法在種水平上準確識別。多基因系統分析研究物種分離、群體構成以及群體的系統進化親緣關系已經成為流行趨勢。結合形態學基礎與利用多基因序列分析可以更精準地將炭疽菌鑒定至屬以下水平，因此多基因譜系分析被越來越廣泛地在炭疽菌分類研究中使用[11-12]。但多基因序列分析需要依靠龐大的DNA條形碼數據庫來運作，需要一定生物信息學基礎，整個流程也需要不少的人力與時間成本。

拉曼散射是一種與入射光頻率不同的非彈性散射，通過拉曼散射可以準確地獲取樣品的分子結構信息，對于構成樣品體內的基本生化物質的檢測非常靈敏，因此拉曼光譜被稱作“指紋”圖譜[13-15]。拉曼光譜儀與共聚焦顯微技術的有機結合被稱為共聚焦顯微拉曼技術，其為物種區分與鑒定帶來了新的途徑。共聚焦顯微拉曼技術利用代謝物的拉曼散射以快速、免處理、無損、寬譜帶的方式提供樣本所含的拉曼特征信號，例如碳水化合物、脂質、蛋白質以及核酸等均可生成特定的拉曼光譜，進而可了解生物體內的物質成分與結構信息。共聚焦顯微拉曼技術僅采集物鏡焦點區域的拉曼信號，通過拉曼光譜和共聚焦顯微鏡的結合，將焦點以外的背景信號拒之門外，更有利于小體積樣本的掃描分析，例如細胞或孢子；此外，生物體內的水分是在其他光譜測量中重要的干擾因素，而水的拉曼峰是很弱的，幾乎不會對檢測結果造成干擾，這對含水的微生物樣本的檢測具有一定的優勢，因此共聚焦顯微拉曼技術已經被用于真菌與細菌的分類鑒定中[16-18]。例如，甘琴華等[19]使用共焦拉曼顯微技術在變種水平上進行細菌的免培養檢測，鑒定的效率與準確性不亞于16s rDNA。Evelin等[20-21]使用拉曼光譜技術在屬和種水平上實現了人類皮膚癬菌以及建筑物損壞相關真菌的檢測和鑒定。然而，基于共聚焦拉曼顯微技術的檢測和鑒定在植物病原真菌孢子的研究上，尤其在炭疽菌分類研究中鮮有報道。在本研究中，筆者利用共聚焦顯微拉曼光譜儀對造成橡膠樹炭疽病的3種炭疽菌孢子的拉曼光譜進行了掃描，并以一種非橡膠樹炭疽菌孢子作為對照，分析了其拉曼光譜特征，并結合主成分分析（PCA）實現了3種炭疽菌在種水平上的區分，表明了占據主要區分主要權重所依靠的3個主要峰值。本研究旨在為病原真菌孢子的鑒別與分類提供高效、可靠、靈敏的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 樣品處理熱帶炭疽菌（Colletotrichum tropicale）菌株HN15、暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）菌株HN08、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）菌株HN02，這3種橡膠樹炭疽菌均為本實驗室保存菌種。將這3種橡膠樹炭疽菌與對照即非橡膠樹炭疽菌（Colletotrichum alatae）接種在PDA培養基上，放置于28 ℃下培養。接種3 d后，刮去表面菌絲破壞菌落結構，在光照條件下進行誘導產孢。3 d后使用ddH2O洗下孢子并通過Miracloth濾 布(Merck KgaA,孔 徑22～25μm,Germany)過濾去除雜質。繼而收集孢子懸浮液，孢子懸浮液在10000 r·min-1下離心3 min并去除上清，ddH2O洗滌2次，稀釋至105CFU·mL-1。取孢子懸浮液20μL(≈2×103個孢子) 滴在拋光一面的單晶硅基底上(1 cm×1 cm)，吹干備用。

1.2 拉曼光譜測量使用共聚焦顯微拉曼光譜儀(inVia Reflex of Renishaw,England)對炭疽菌孢子進行拉曼光譜測量，配備了可產生514 nm激發光的50 mW激光光源。在測量前使用單晶硅位于520 cm-1的拉曼峰校準儀器，使用50倍物鏡采集單個孢子的拉曼光譜，光譜采集范圍為600～2000 cm-1，作用在樣品上的最終激光功率約為5 mW，光斑直徑為1μm，采集時間為10 s，依靠2 400 cm-1光柵可實現光譜分辨率為1 cm-1。

每種炭疽菌的測量包含3個生物學重復，每個生物學重復實驗取視野中隨機的10個孢子來測量拉曼光譜，為了避免激光照射損傷，每個孢子只采集1次光譜。最后使用每種真菌收集到的30張光譜進行數據分析。此外，隨機選取30個空白處作為基底的背景光譜。

1.3 數據處理由于背景噪聲、孢子本身的差異、實驗設備的影響，同種炭疽菌孢子的拉曼光譜可能會略微有所不同。同時，孢子本身的熒光背景、隨機和非相關因素也可能會影響收集到的光譜，例如產生基線升高和雜峰。因此，需對光譜數據進行統一的前處理。其中包括減去單晶硅基底光譜，使用Labspec 5(HORIBA Scientific,Orsay,France) 進行曲線平滑、基線校正（5階，Polymon）。使用EXCEL (Microsoft,USA)計算實驗采集范圍內每個波數對應拉曼強度的標準偏差以評估光譜的精確性和可重復性，并以陰影部分表示。使用Origin 2021b（教育版，OriginLab，USA）進行作圖和PCA分析。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜特征分析在測量的4種炭疽菌中，熱帶炭疽菌（C.tropicale）和暹羅炭疽菌（C. siamense）同屬于膠孢炭疽菌復合群（C. gloeosporioidesspecies complex），而尖孢炭疽菌（C. acutatum）屬于尖孢炭疽復合群（C. acutatumspecies complex），作為不同寄主對照的非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）也同屬于膠孢炭疽菌復合群（C. gloeosporioidesspecies complex）。對熱帶炭疽菌（C. tropicale）、暹羅炭疽菌（C.siamense）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）以及非橡膠樹炭疽菌（C.alatae）孢子的光譜掃描的結果（圖1）顯示，4種炭疽菌的孢子幾乎具有相同的光譜模式和峰位。不同的是，非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）孢子產生了極強的拉曼信號，為了避免由不同發育階段或生長狀態所帶來的測量誤差，對其不同階段均進行了測量，結果與之前一致，說明其具有極強的拉曼信號，這或許是由不同寄主或種間差異所導致。相同的光譜模式表明它們產生拉曼峰的內源性物質組成是幾乎一致的，區別在于含量高低與組成比例的不同，導致產生的拉曼信號強度與峰值比例不同。其最重要的特征在于，4種炭疽菌孢子的拉曼光譜均在3個相同的波數處共有3個主要的特征峰，分別位于1005、1155、1515 cm-1。同時，筆者推測相同的拉曼光譜模式與特征峰位置可能是眾多炭疽菌所共有的，而不僅限于實驗中所測量的復合群與種類。根據以往的報道，1005 cm-1處的峰值被認為由細胞質蛋白中的苯丙氨酸的分子環呼吸振動的貢獻[22-24]；1155 cm-1處的峰值代表著細胞壁中C-C和C-N拉伸[18-25]；1515 cm-1處峰值則由N-H鍵、C-H鍵和C=C雙鍵伸縮所導致[26]。

除此以外，根據它們的平均拉曼光譜還觀察到了位于960、1194、1290、1446 cm-1的幾處共有的小峰。960 cm-1處峰值由C-N鍵伸縮與C=C鍵變形所產生；1194 cm-1處的峰值由芳香族氨基酸產生；1290 cm-1處的峰值由酰胺III和胸腺嘧啶產生；1446 cm-1處峰值由脂肪鏈的C-H鍵彎曲產生[22-24,27]。雖然4種炭疽菌孢子顯示出了相同的光譜趨勢和幾乎相同的峰值位置，但3個主要波數1005、1155和1515 cm-1處的峰值強度明顯不同。同時，即使受孢子本身狀態與儀器光電噪聲的影響，它們的平均拉曼光譜依然顯示出了較小的標準誤差范圍（以陰影部分表示）。此外，不僅僅是3個主要峰值的強度不同，其峰值之間的比例也不同。例如，尖孢炭疽菌（C.acutatum）、熱帶炭疽菌（C. tropicale）和暹羅炭疽菌（C. siamense）孢子的拉曼光譜在1155和1515 cm-1這2個波數處的峰值強度比也是不同的，分別為0.69、0.86和0.95，這也導致了同一張平均光譜中不同峰位對應的峰面積占總體峰面積的比例不同，比如尖孢炭疽菌（C. acutatum）在1155 cm-1處對應峰面積所占總體峰面積的比例明顯小于其他3種。3個主要峰值的信號強度差異、峰值比例與光譜趨勢成為了區分它們的良好依據。

2.2 PCA聚類分析使用PCA對3種橡膠樹炭疽菌孢子預處理后的拉曼光譜進行聚類分析，而鑒于非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）的拉曼光譜具有肉眼可辨的極強的峰值特征，因此未將其包含在PCA聚類分析中。依靠每張孢子拉曼光譜的PC1、PC2和PC3得分，將散點圖投影到三維空間中，位置和大小反映了孢子的分類關系。該投影分析（圖2）顯示了在種水平上較高的靈敏度，3種橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜可以準確地劃分為3個簇。它們的95%置信區間有一定程度的重疊，這是由于一些不穩定的樣本因素所導致的，整體來看并不影響聚類效果。圖3所示，前3個主成分共同占據了99.70%的解釋度，其中，依靠1005 cm-1，1155 cm-1和 1 515 cm-13個主要峰值的差異，PC1占據了97.76%的分辨能力。位于963，1195，1291，1446 cm-1處的幾個小的峰值也在PC1中占據了一定的權重，但不如3個主要峰值明顯。同時，PC2與PC3這兩個主成分也能在一定程度上有效解釋區分度，例如，998、1152和1507 cm-1在PC2與PC3的負軸上也占據了一定的權重。但是，在PCA特征提取的過程中，更傾向于自動選擇降維后較大的特征值與特征向量。總體而言，3種橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜很容易聚類為3個簇，表明使用拉曼光譜技術在種水平上區分炭疽菌孢子種類是可行的。

圖2 3種橡膠樹炭疽菌孢子的PCA得分圖橢圓陰影區域表示每種孢子的95%置信區間。

圖3 3種橡膠樹炭疽菌孢子的PC1、PC2、PC3主成分荷載圖

3 討 論

本研究依靠共聚焦顯微拉曼技術對3種橡膠樹炭疽菌孢子以及1種非橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜進行了特征分析，找出了共有的1005、1155和1515 cm-1波數處3個主要拉曼峰，以及位于960、1194、1290、1446 cm-1處的次級拉曼峰，繼而對峰值貢獻的歸屬進行了初步判斷。結合PCA聚類分析在三維空間得分圖中快速有效地將3種橡膠樹炭疽菌孢子聚類為3個簇，在荷載圖中展示了區分它們在PC1、PC2以及PC3中主要依靠的拉曼峰。結果表明，1005、1155和1515 cm-1波數處3個拉曼峰不僅是炭疽菌所共有的，更是利用拉曼光譜結合PCA在種水平上區分它們的主要依據。

本研究提供了一種鑒別炭疽菌孢子的全新的方法，與基于形態學和分子生物學的鑒定方法相比，共聚焦顯微拉曼技術具有靈敏與微量樣品需求的優勢，且樣品是無需預富集和預處理的，有望達到單孢子水平的檢測與鑒定。本研究為病害防控，快速鑒別，真菌分類提供有力的技術支撐。當然，為了提高診斷的可靠性和可選擇性，更多的種類炭疽菌孢子樣本應在的實驗中進一步引入，以便建立完整的孢子光譜數據庫。