脂質分析技術及其在植物種子脂質代謝調控研究中的應用進展

殷志斌，陳旭峰，江 彪，晏石娟

（1.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

脂質是一類具有疏水結構特性的兩親性物質，根據其結構特性，主要分為以下8 類：（1）脂肪酰類（Fatty acyl,FA），如亞油酸、花生酸等；（2）中性甘油脂類（Glycerolipid，GL），如甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）和甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）等；（3）甘油磷脂類（Glycerophospholipid,GP），如磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）等；（4）鞘脂類（Sphingolipid，SP），如神經酰胺（Ceramide，Cer）和鞘磷脂（Sphingomyelin，SM）等；（5）甾醇脂類（Sterol lipid，ST），如固醇酯（Cholesterol ester）等；（6）糖脂類（Saccharolipid，SL），如單半乳糖甘油二酯（Monogalactosyl diacylglycerol，MGDG）和硫代異鼠李糖甘油二酯（Sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG）等；（7）異戊烯醇類（Prenol lipid，PR），如CoA 等；（8）聚酮類（Polyketides，PK），如抗生素等。

脂質作為細胞膜的一部分，不僅為其提供支撐作用，還影響并調控許多植物的代謝過程。脂質在動/植物生命體中扮演重要角色，對維持生理動態平衡至關重要。其功能主要歸納為以下幾類：（1）自組裝成磷脂雙分子層作為每個活細胞中細胞膜的基本骨架，維持細胞的相對獨立性和完整性；（2）以脂肪酸的形式存在，作為維持多種細胞基本活動和功能的能量來源；（3）作為一些膜磷脂的特定成分，如酯化花生四烯酸酯、溶血磷脂、大麻素等可以被酶釋放到游離酸中，并轉化為具有多種生物效應的二級信號傳遞分子，參與細胞信號傳導等［1］。此外，脂質還參與機體的炎癥反應，調控細胞代謝及凋亡等過程［2-4］，引起脂質代謝紊亂及異常，常被認為與疾病的發生密切相關［5］。前人研究表明，脂質在植物應答脅迫過程中起重要作用，一方面作物中膜脂的流動特性能在遭遇逆境時起到一定的緩沖作用；另一方面，脂質作為信號分子或能量物質參與（非）生物脅迫的信號轉導，調控植物生長發育和逆境響應。Yang 等［6］通過水稻代謝組和基因表達譜的聯合分析定位到一個轉錄因子OsDREB2A，能正向調控水稻種子的甘油磷脂代謝，過表達該轉錄因子可顯著提高水稻抗旱性和耐鹽性［6］。植物細胞膜本質是磷脂雙分子層，磷脂不僅是膜的成分，磷脂信號也在植物生長、應激過程中具有重要作用。膜磷脂被磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）催化后產生的磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）在植物響應作物脅迫時起重要作用。水解磷脂的磷脂酶分為三大類，其中磷脂酶C 可分為非特異性磷脂酶C（Nonspecific phospholipase C，NPC）、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（Phosphatidylinositol specific phospholipase C，PI-PLC）［7］。NPC 已被證明在調節植物對各種脅迫的反應中起重要作用，如水稻中的非特異性磷脂酶6（Nonspecific phospholipase 6，NPC6）參與水稻中赤霉素（Gibberellic acid，GA）介導的中胚層伸長［8］。NPC3 或NPC4 的突變通過油菜素內酯（Brassinolide，BL）反應影響根系結構［9］。在植物生長發育過程中，PI-PLC在包括根、莖、葉、花和果實等營養器官和生殖器官中都會表達［10］。PI-PLCs 可在多種脅迫源下誘導產生，前人研究指出，油菜籽、玉米、小麥、水稻等作物遭受脫落酸（Abscisic acid，ABA）、鹽、低溫、水楊酸（Salicylic acid，SA）和干旱等脅迫時能誘導產生PI-PLCs［11-13］。不同水稻的PLC 成員在非生物脅迫觸發的信號傳導和植物發育中具有重要作用，這也得到其啟動子中存在相關順式調控元件的支持［14］。前人研究還表明，植物種子中脂質代謝調控與種子的活力與壽命等復雜性狀息息相關［15-19］，直接影響種子萌發、種子應答脅迫等生理過程。本文總結了基于質譜策略的脂質組學技術的發展歷程和研究現狀，綜述了脂質分析技術特別是質譜成像技術，在植物種子脂質代謝調控研究中的應用和最新進展。

1 脂質組學技術

1.1 脂質組學發展歷程

2003 年，Han 等［20-22］首次提出“脂質組學（Lipidomics）”的概念，自此“脂質組學”迅速發展成對脂質整體系統分析的一門新興學科，既作為代謝組學的一大分支，也是全代謝組研究的拓展和延伸。通過脂質組學技術系統、深入地研究植物種子中整體脂質分子的含量、結構、組成及其空間定位的變化，對于闡明脂質分子在種子生命活動中的代謝方式和調控機制至關重要［23］。隨著質譜儀器和技術的不斷推陳出新，脂質組學研究方法也不斷取得突破性進展。長期以來，脂質組學研究大多集中在動物組織及醫學領域，近年來也在植物種子研究中大放異彩。傳統的脂質組學技術主要包括脂質的提取、富集、分離及檢測鑒定，其中生物質譜技術是當前脂質組學研究中的核心工具。此外，質譜成像技術作為一種新興的無標記、可視化檢測手段，可以補充傳統脂質組學缺少的空間分辨信息，實現不同功能和種類的脂質分子在植物中的精準空間定位，為傳統的脂質組學研究提供多維的信息深度和全新視角。

1.2 脂質提取和富集

常用的脂質提取方法主要有固相萃取（Solid phase extraction，SPE）和液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）等［24］。SPE 過程經歷分離和富集步驟，可大幅降低非目標物質的背景干擾，有利于一類或幾類靶向物質的高靈敏度檢測，因此常被用于針對脂質分子的靶向代謝組學分析；與之相比，LLE 可以提取出范圍更廣的脂質分子，常被用于非靶向脂質組學分析。與簡單的單一溶劑萃取不同，LLE 主要利用代謝物在兩種互不相溶溶劑中分配系數不同來進行分離的，也是脂質組學中最常用的萃取策略。LLE 方法主要包括Folch 法［25］、Bligh-Dyer 法［26］和Matyash 法［27］。Folch 法是利用氯仿-甲醇-水混合溶劑體系（體積比為8∶4∶3）進行生物樣品的全脂質提取。Bligh-Dyer 法則是對Folch 法進行改進，采用相同溶劑體系，但體積比優化為2∶2∶1.8，不僅降低溶劑（特別是有毒溶劑氯仿）的使用量，還大幅縮短提取時間。值得一提的是，甲醇-氯仿的混合有機相可以非特異性地提取多種脂質分子，且水相的引入可以增強相分離能力、提高萃取效率。Matyash 方法則是采用低密度的甲醇-甲基叔丁基醚（Methanol-methyl tert-butyl ether，MTBE）與甲醇/水組成混合萃取溶劑，通過使用MTBE 取代原來的氯仿溶劑，降低操作過程中的高毒性，簡化相分離步驟，從而獲得更高的回收率［27］。

與LLE 不同，SPE 方法的原理主要是利用不同組分在固-液相中的相互作用差異來進行分離提取的。首先，將被分析物吸附到固定相中，隨后通過不同洗脫能力的流動相進行逐級洗脫，實現脂質分析物的分離和富集。由于SPE 可以很好地去除萃取體系中的干擾物質，因此非常適合靶向富集某一類或多類脂質，用于靶向脂質組學檢測。近年來，固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）因具有溶劑使用量少、分析速度快、易于自動化等優點，逐漸成為一種強有力的脂質提取和分析策略，適用于微量樣品或大批次樣品的快速分析。相比于SPE 方法，SPME 通常采用一根帶有特定涂層的纖維，并基于疏水相互作用、靜電作用等原理提取待測物質，還可與氣相色譜（Gas chromatography，GC）或氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）結合，通過頂空采樣的方式對固體、液體和氣體樣品進行萃取吸附，實現快速解/吸附進樣分析。此外，近年還陸續出現微波輔助萃取法（Microwave-assisted extraction，MAE）、超臨界流體萃取法（Supercritical fluid extraction，SFE）、超聲輔助萃取法（Ultrasoundassisted extraction，UAE）等方法，極大提升了脂質組學的鑒定數量和數據深度［28］。

1.3 脂質分離和檢測

氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）和液相-質譜聯用技術（LC-MS）已成為當前脂質組學研究的主流方法［29-30］。通過利用不同性質的脂質分子在色譜柱中保留時間不同的特性，大幅提高它們在質譜分析中的檢出數量和動態范圍。其中，GC-MS 主要適用于易揮發性的小分子脂質檢測，對于不易揮發的脂質分子則需通過衍生化處理提高其揮發性，從而實現分離檢測。因此，該方法在脂質組學分析中不具有普適性，更適用于靶向脂質組學分析。相比于GC-MS，LC-MS 無需繁瑣的衍生化前處理，可以快速分離復雜的脂類物質，兼具優異的分離能力和鑒定能力，因此常被用于非靶向脂質組學分析。LC 還包括正相液相色譜（Normal phase LC，NPLC）、反相液相色譜（Reversed phase LC，RPLC）、親水相互作用液相色譜（Hydrophilic-interaction LC，HILIC）、親和色譜（Affinity LC）等。其中RPLC 是目前應用最廣泛的一類分離方法，主要通過非極性固定相（如C18 柱等）和極性流動相進行脂質洗脫，可以獲得較高的分離效率。NPLC 雖然也可用于脂質分離，但由于非極性流動相對一些極性脂質的溶解性較差，限制其廣泛使用。相比之下，HILIC主要采用極性固定相和混合溶劑（如水-有機溶劑等）作為流動相，非常適合極性脂質（如磷脂等）的分離。針對一些脂質組成復雜的樣品，還可采用在線/離線二維色譜方法進行分離，提高脂類物質的分離能力［31］。對于質譜檢測，目前脂質組學主要采用電噴霧電離質譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和大氣壓化學電離質譜（Atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，APCI-MS），前者可普適于電離各類脂質分子，而后者更適合于分析脂肪酸類物質和弱極性脂質等［32］。可選擇的質量分析器有四極桿、三重四極桿、飛行時間、高分辨率軌道阱等，可根據不同的分析需求（如質量分辨率、靈敏度、分析通量等）進行合理選擇。盡管當前脂質組學的分離和檢測方法眾多，但在實際分析中仍然面臨諸多挑戰，如脂質分子種類繁多、質譜電離效率存在較大差異；實際樣品中脂質含量動態范圍寬、信號過飽和及檢測靈敏度不足時常發生；缺少合適的脂質內標分子，導致定量能力有限；脂質分子存在大量的同分異構體，導致結構鑒定存在困難等。因此，除開發更高靈敏度和普適性的質譜離子源外，還可開發合適的衍生化策略［33-34］、紫外光照裂解方法［35-36］、離子淌度數據庫［37-39］等，用以提高脂質分子的電離效率、同分異構體的鑒別能力等。

1.4 脂質的質譜成像方法

脂類的空間定位常可結合熒光染料或化學染色和顯微鏡技術進行可視化，然而顯微鏡只能提供脂質定位的定性信息，不能提供脂質確切的化學組成。雖然核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）可以用來對植物組織中整體的脂質分子進行成像，提供無損且細致的代謝物三維成像［40］，但該技術常常受限于樣品性質，同時無法原位分辨脂質代謝物的不同脂質類型和分子種類。因此，除傳統的基于勻漿制樣方式的脂質組學策略外，近年來質譜成像（Mass spectrometry imaging，MSI）技術因其具有無標記、可視化等優勢而被逐漸引入研究并形成空間分辨脂質組學（Spatially resolved lipidomics）。該技術不僅具有一定程度的脂質鑒定能力，還可非靶向提供多種脂質分子在動物、植物甚至單細胞水平的空間分布，為傳統的脂質組學研究提供全新視角。此外，MSI 的另一優勢在于可將具有前體/產物關系或參與某些相互關聯代謝途徑的代謝物進行空間上的關聯定位。通過將動/植物組織層面的PCs 與TAGs 的前體/產物等目標脂質可能存在的共定位進行可視化分析，有助于在組織水平上揭示TAG生物合成的空間位置和活性。

根據離子源不同，目前可將MSI 技術分為基質輔助激光解吸/電離質譜成像（Matrix-assisted laser desorption/ionization MSI，MALDI-MSI）、二次離子質譜成像（Secondary ion mass spectrometry imaging，SIMS imaging）和解吸電噴霧電離質譜成像（Desorption electrospray ionization MSI，DESIMSI）等［41］。其中，MALDI-MSI 是當前在動/植物脂質成像應用最廣泛的一類技術。Woodfield等［42］利用MALDI-MSI 技術揭示了油菜（Brassica napus）中甘油三酯和部分磷脂前體在子葉和胚軸中的組織特異性分布；Horn 等［19］通過MALDIMSI 技術，發現TAGs 和PCs 等脂質分子主要貯存于陸地棉（Gossypium hirsutum）種子的胚中。然而，受限于光學衍射極限，MALDI-MSI技術的空間分辨率一般為20～100 μm，較難實現細胞甚至亞細胞器尺度的成像分析。最近，Yin等［43-44］為突破光學衍射極限以實現單細胞質譜成像分析，研制了基于納米有孔光纖的近場激光解吸后電離飛行時間質譜儀，成功實現小分子藥物、代謝物及部分脂質碎片在HeLa 細胞中的可視化定位；基于此，Li 等［45］和Meng 等［46］還成功實現了單細胞的三維質譜成像，并對靶向抗癌藥物從進入細胞質到細胞核，并誘導癌細胞凋亡這一動態過程實現可視化檢測。SIMS 技術是目前空間分辨率最高的一類MSI 技術，一般可根據離子束類別和束流大小分為動態SIMS 和靜態SIMS。前者可獲得低至50 nm 的成像分辨率，但由于束流過大，所有分子結構都會被打碎和電離為原子離子，因此主要適用于元素成像或同位素標記成像；而靜態SIMS 兼具高空間分辨率和保留部分完整分子信息等優點，可以獲得少量的脂質分子或特征碎片離子，在脂質成像應用中有待進一步發展。與MALDI 和SIMS 技術不同，DESI-MSI 技術是在大氣壓下進行采樣電離，制樣簡單且更接近于原位檢測。通過將萃取溶劑在霧化氣和電壓的雙重作用下形成電噴霧，并以一定角度掃描樣品表面，從而快速萃取組織中的代謝物和脂質分子，并形成帶電液滴以合適的角度進入質譜進樣口，從而被質譜檢測。例如，Morse等［47］通過DESI-MSI 技術對前列腺癌組織進行成像分析，獲得25 個差異脂質，并發現癌變組織中的脂肪酸和腦磷脂會顯著上調；Sun 等［48］進一步開發了空氣動力輔助解吸電噴霧電離（Airflow-assisted desorption electrospray ionization，AFADESI）技術，以256 例人鱗片狀食管癌組織樣品為研究對象，成功實現篩選出與癌細胞代謝相關的差異代謝物和脂質，并揭示包括脯氨酸合成、谷氨酸代謝和多胺生物合成等6 個代謝通路的含量及空間分布變化，為深入探究腫瘤的代謝過程提供全新視角。然而，DESI-MSI 技術由于空間分辨率（一般為幾百微米）較低，較難進行一些微觀結構的成像分析，且其在植物組織原位成像中容易受到樣品表面起伏和不平整等影響。

2 脂質分析技術在植物種子脂質代謝調控應用研究

2.1 油菜（Brassica napus）種子

糧油作物的種子中含有大量的脂質、淀粉和氨基酸，均為種子營養的來源。對糧油作物種子中與脂質相關的潛在基因進行探索，有利于種子的營養改良。甘藍型油菜是僅次于油棕和大豆的第三大植物油來源，產量約占全球食用油的15%［49］；且其與擬南芥中大部分基因序列高度一致，擁有約81%的保守序列［50］。因此，甘藍型油菜被認為是一種理想的油料作物，可以將模式物種擬南芥的基礎知識直接進行應用轉化。在大多數植物中，油主要是以甘油三酯（TAG）形式儲存在種子組織中，主要聚集在胚和/或胚乳組織。最近，Woodfield 等［42］對甘藍型油菜籽粒進行質譜成像分析，揭示了油菜籽中主要儲存油脂的組織是子葉，但相當一部分油脂可以在下胚軸、胚根和外周胚乳/糊粉層組織中積累。這些成像結果也表明種子中脂質代謝可能在基因轉錄組和酶水平上存在差異調控機制［51-52］。同時，將MALDI-MSI 與轉錄組數據相結合的新策略，也有望揭示與脂質組成和油脂含量相關的代謝產物和轉錄物的組織特異性差異原因［53］。Bhandari等［54］對萌發階段和成熟階段的油菜種子進行質譜成像分析，發現在種子萌發過程中，環亞精胺從種子的胚軸胚根區轉移到了正在萌發的幼根上，且三咖啡酰亞精胺表現出同樣的分布規律，表明亞精胺類物質與胚軸胚根的發育息息相關，為揭示植物的生長發育提供了強有力的可視化研究工具。

最近，Lu 等［17］利用質譜成像技術和轉錄組學技術，深入探討影響油菜油脂代謝產物空間分布 的因素。以甘藍型油菜兩個具有高、低油脂積累特性的基因型（ZS11、WH5557）材料為研究對象，探究其油脂合成代謝產物和轉錄組的組織特異性差異。結果表明，兩種植物的PCs 和TAGs 代謝物均以組織特異性分布在整個胚中，其中C16∶0 酰基部分相對于子葉來說會在胚軸（Embryonic axis，EA）富集。此外，高油脂積累特性的ZS11 基因型會使胚各部位的甘油三酯含量顯著升高，而磷脂酸（PA）含量顯著降低。單個種子組織的轉錄組學分析為脂質的組織特異性分布以及油脂含量超過碳水化合物和脂肪酸（Fatty acid）代謝差異水平等提供了可能的解釋。基于此，上述研究結果為深入剖析油菜種子中脂質代謝、轉運和油脂積累的潛在機制提供了重要見解。

2.2 陸地棉（Gossypium hirsutum L.）種子

陸地棉是一種具有重要經濟價值的多用途作物，如可以用于生產紡織品、食物配料籽油及飼養動物的高蛋白飼料。除纖維或絨毛外，棉籽也是食用油的來源，同時油脂分離后的殘渣也可被用作反芻牲畜的飼料或有機肥料。一般來說，棉籽含有大致相同含量的蛋白質（20%～25%）和油脂（20%～25%）［55］。棉籽油組成約為26%棕櫚酸（C16∶0）、2% 硬脂酸（C18∶0）、15%油酸（C18∶1）和55%亞油酸（C18∶2）。此外，棉籽油還含有總含量約為1 000 mg/L 的生育酚，其中α 型和γ 型分別占生育酚含量的41%和58%。生育酚不僅具有重要的新陳代謝作用，還是一種強抗氧化劑，有助于延長棉籽油的保質期，并保持油炸產品的新鮮度。Salimath 等［56］通過核特異性表達了HvHGGT基因，開發了轉基因棉系（HGGT1、HGGT2），實現棉籽營養價值的顯著增強。他們利用MALDI-MSI 技術驗證了HGGT基因的種子特異性表達會導致生育三烯醇在棉花胚胎中合成和積累的假說。成像結果表明，α-生育酚主要集中在棉籽的子葉組織中，而γ-生育酚在Coker 312 和轉基因HGGT 胚系中相對富集在胚軸組織中，揭示了兩種生育酚差異性的空間分布。與之相比，新生成的γ-生育三烯酚相對均勻地分布在所有轉基因胚組織中，且HvHGGT在轉基因型胚中的表達量并不影響α-生育酚和γ-生育酚的分布［56］。同時，該研究探究了轉基因對棉種生長發育、棉籽成分的總體影響，并評價轉基因種子的抗氧化特性，選育了一個抗氧化特性增強和高生育三烯酚提取量的新型棉籽油品種［56］。

Liu 等［15］綜合利用代謝組學、脂質組學和MALDI-MSI 技術，探究兩個耐旱、耐鹽棉籽品種中差異代謝物和脂質的空間分布規律。利用LC-MS/MS 鑒定得到17 種差異代謝物和125 種差異脂質分子，并結合MALDI-MSI 技術對棉籽組織中9 個脂質和4 個代謝物的含量及分布進行了可視化分析。在負離子檢測模式下，成像結果表明PE（16∶0/18∶1）、PE（18∶2/18∶2）、PE（18∶1/18∶2）、PE（18∶1/18∶1）和PE（18∶0/18∶1）等脂質在棉籽組織全身均有分布；而在正離子檢測模式下，顯著下調的DG（16∶0/14∶0）、TG（8∶0/10∶1/18∶2）和MePC（34∶1）以及上調的TG（19∶1/18∶2/18∶2）則主要積累在子葉位置。Liu 等推測這些中性甘油酯分子的組織特異性分布可能與干旱和鹽脅迫下其生物合成主要發生在子葉部位有關，這也進一步證實子葉具有營養儲存的生理功能。綜上，通過整合LC-MS/MS 和MSI 技術，Liu 等揭示了差異性脂質分子的代謝調控和空間分布特征，為后續進一步研究棉花種子的耐旱和耐鹽機理提供了新的見解和理論依據。

2.3 擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子

擬南芥是甘藍型油菜和亞麻薺（Camelina sativa）的近緣種，是一種廣泛應用于探索種子中脂質代謝生物化學及其調控機制的模式植物。20世紀90 年代開始，擬南芥便被用于鑒定和表征許多與甘油脂合成和酰基鏈去飽和和延伸有關的基因［57-58］。擬南芥資源豐富，且可在相對小的空間內快速繁殖，有利于遺傳研究。擬南芥單個種子尺寸較小（約為500 μm×300 μm），如何在組織層面（如胚芽、胚軸、胚根或子葉）進行空間特異性生物化學研究有待進一步探究。為此，Sturt evant 等［53,59］基于質譜成像技術繪制了擬南芥種子中PC 和PI 兩類重要磷脂物質的三維空間分布，空間分辨率為15 μm×15 μm×20 μm，并揭示了調控脂質代謝的基因發生變化會對種子細胞膜上脂質分布產生不可預料的變化，且無法完全通過轉錄機制解析。質譜成像結果表明，PC（34∶2）在貫穿胚胎的所有連續切片中富集于胚軸組織，而PC（34∶3）富集于外周胚乳層，PC（38∶3）在子葉組織的所有連續切片中均有富集。與PC 不同的是，PI（34∶2）富集于胚胎軸組織中，PI（36∶3）則富集在子葉組織中。由于PI 的酰基基團通常不被認為是TAGs 的合成中間體［59］，因此PIs 的特異性分布很可能與一些重要功能或者脂質代謝物儲存（如信號、膜穩定性）相關。

此外，Sturtevant 等［53，59］還比較了fad2-1基因型和野生型種子的脂質含量及分布差異，結果表明對于不同碳數的PC 物質（如C34、C36 和C38 等），它們在fad2-1基因型和野生型中分布差異最為顯著。其中，fad2-1基因型的脂質變化大部分是由于脂肪酸組成的改變，如C18∶2和C18∶3 脂肪酸減少，而C18∶1 脂肪酸增加，從而產生占主導地位的含C18∶1 脂肪酸的PC 分子〔PC（34∶1）、PC（38∶2）和PC（36∶2）〕。同時，在fad2-1基因型的擬南芥種子中，PC（34∶1）、PC（38∶2）和PC（36∶2）也表現出不同程度的異質性，如PC（38∶2）優先定位于子葉組織，而PC（34∶1）和PC（36∶2）相對均勻分布在整個子葉和胚胎軸組織。由于FAD2 會影響含C18∶1 脂肪酸的PC 分子含量，且在fad2-1突變體中仍可觀測到外周胚乳組織中PC（34∶3）的空間分布，表明可能存在其他去飽和酶導致這些細胞類型中多不飽和脂肪酸的形成。同樣地，在fad2-1突變體種子中也形成少量PC（34∶2）、PC（36∶4）和PC（36∶3）等脂質，但這主要局限于胚芽外周胚芽和胚根尖端組織，表明這些組織中C18∶2 和C18∶3 脂肪酸的合成可能有另一種途徑。PC（34∶3）在子葉和胚軸中含量降低、但在外周胚乳中仍存在，這與fad2-1突變體中多不飽和PC 分子主要在外周胚乳定位相似，表明可能存在相似的去飽和途徑。此外，在fad3-2突變體中，PC（36∶5）幾乎完全缺失，僅在外周胚乳中微量存在，這可能是由于C18∶3 脂肪酸含量減少。

除PC 磷脂分子外，Sturtevant 等在負離子檢測模式下，對PI 分子在野生型和突變體中的空間分布進行了可視化檢測。結果表明，FAD2 突變在PI 中產生了包含C18:1 脂肪酸鏈的新脂質種類，PI（34∶1）相對均勻地分布在子葉和軸之間，而PI（36∶2）相對于軸則更優先分布在子葉中。同時，成像結果表明在fad2-1種子的外周胚乳和軸組織中仍然可以檢測到PI（34∶2），表明這些組織中可能存在C18∶1 和C18∶2 脂肪酸的其他去飽和方式［59］。這些分子種類組成和空間定位的差異與PC 可能用于PI 合成的二酰基甘油部分一致。總體來說，通過MALDI-MSI 獲得的PI 脂質相對含量與通過液質聯用技術獲得的定量結果大體一致。通過質譜分析確定各PI 分子的酰基鏈組成，為PI 分子的鑒定提供理論依據。

2.4 玉米（Zea mays L.）種子

玉米油主要由59%多不飽和脂肪酸、24%單不飽和脂肪酸和13%飽和脂肪酸組成［60］。玉米含油量與其經濟價值息息相關，而基因工程在提高玉米含油量方面功不可沒［61］。例如，玉米粒為玉米提供許多養分，包括脂肪、淀粉、蛋白質，對玉米籽粒已鑒定脂質的潛在基因資源進行表達分析發現［62］，編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的GPC1、GPC2、GPC3 和GPC4 在授粉后的不同時間點和不同內核區室中在核細胞中高度表達。結合脂質相關基因表達譜能夠為豐富玉米分子育種策略提供重要信息；Zheng 等［63］發現一個影響玉米籽粒油分以及油酸含量的高油QTL（qHO6）編碼二酰甘油酰基轉移酶（DGTA1-2），該基因的過表達能增加將近一倍的油酸含量，具有降低人體內有害膽固醇、保留有益膽固醇以及軟化心腦血管的優點。

種子萌發是一個高度復雜的過程，種子在相對干燥的狀態下進行休眠，能夠長時間存活，并通過水的吸脹來觸發種子萌發過程。許多代謝物在種子萌發過程中都發生顯著變化，其中大多數與種子貯藏物質（如蛋白質、多糖和脂類）的分解代謝相關。為此，Feenstra 等［18］利用質譜成像技術對玉米籽粒萌發過程中的小分子代謝物進行時空可視化分析。例如，脂質會以TAG 分子形式儲存在一種特殊的玉米組織——盾片（Scutellum）以及通過β-氧化分解代謝脂肪酸的含量以提供拉長胚軸的一個能源來源，脂肪酸中的碳可以用來組裝新碳，支持胚生長的代謝中間體。同時隨著萌發開始，胚軸的胚根開始伸長，TAGs 開始非均勻性分布，與其他脂肪酸和磷脂分子分布一致［64］。在吸脹后36 h，Feenstra 等比較了4 種不同類型的脂質分子（如PE、PA、PI 和PC）在萌發種子中的空間定位，為評估不同脂酰鏈組合產生的磷脂分子種類的分布提供了理論依據［64］。隨著胚的擴張，胚乳被消耗，會產生新的細胞，而4 種磷脂在胚中是最豐富的。在兩個自交系中，不飽和酰基鏈最多的磷脂（36∶4）在胚根和其他胚組織中分布均勻。對于PI、PC 和PA 來說，不飽和磷脂較多（如36∶3 和36∶2）在胚根中的濃度低于其他胚組織。相比之下，PE 具有獨特的定位模式，雙鍵數量為偶數的分子（如36∶4 和36∶2）在整個胚胎中均勻分布，包括胚根；但雙鍵數量為奇數的分子（如36∶3 和36∶1）在發育中的胚根中較少。在種子萌發過程中的所有時間點存在不同脂質具有獨特的空間積累模式［64］。

2.5 其他物種的種子

Dalisay 等［65］利用基因組學、轉錄組學、代謝組學、質譜成像和生物信息學等技術手段，研究亞麻（Linum usitatissimum）蒴果和種子組織中聚合木酚素和植物防御物質氰基糖苷在不同生長發育階段的時空分布規律。油籽的工程成分變化通常通過引入新的酶促步驟和/或通過種子特異性的方式阻斷或增強現有的酶促步驟實現。而在實際生產中，種子中積累脂質種類的數量往往與人們從酶表達水平預測的不同，這些不一致可能源于對細胞/組織水平上脂質代謝調節的不完全理解。為此，Horn 等［66］通過質譜成像方法發現三酰甘油及其磷脂前體在油料作物亞麻芥（Camelina sativa）胚胎的子葉和下胚軸/胚根軸內分布不同，表明甘油三酯代謝物具有組織特異性分布。富含亞油酸18∶2 脂肪鏈的PCs和TAGs 優先定位于軸狀組織，而富含甘碳烯酸C20∶1 的脂類代謝物優先定位于子葉。通過異源過表達酰基-酰基載體蛋白硫酯酶（Acyl-acyl carrier protein thioesterase），或通過抑制脂肪酸去飽和酶和延長酶來控制種子脂質組成，導致新的種子存儲脂質時磷脂和TAGs 在轉基因胚中的分布模式發生改變。該研究結果揭示了亞麻芥胚中先前未知的酰基脂質分布差異規律，并暗示這種脂質的空間異質性能否在轉基因種子中得到有效改變，主要取決于種子的靶向酶（Targeted enzyme）或代謝途徑。

3 結語

高通量基因組、轉錄組、代謝組技術的相繼興起預示多組學時代的到來。脂質組學作為代謝組學中的重要組成部分之一，在過去10 年已得到長足發展，脂質提取、富集效率、鑒定數量上均得到極大提升。植物種子中含有大量的脂質、淀粉和氨基酸，這些都是種子營養的來源。利用脂質組學技術挖掘這些植物種子，特別是糧油作物種子中脂質相關的潛在基因，有助于植物種子的營養品質改良［67-68］。此外，植物中的脂質在逆境脅迫應答過程中同樣扮演重要角色，不僅可以幫助植物抵御逆境脅迫，還可作為信號分子參與非生物脅迫過程中的信號傳導。今后研究可多關注植物在抗逆響應過程中的脂質合成、空間定位和信號傳導等，有望更加系統地揭示植物脂質應答逆境脅迫的機理。

隨著質譜儀器的空間分辨率和檢測靈敏度的快速發展，基于質譜成像的脂質組學新方法得以興起，并為其拓展到植物領域研究帶來新契機。目前，質譜成像技術已被廣泛應用到植物種子中代謝物和脂質分子的可視化成像中，為揭示植物種子生長發育過程中脂質代謝調控機制提供了技術支撐和理論依據。然而，鑒于脂質分類繁多且結構多樣化，基于質譜成像的脂質組學策略仍然存在一些局限性，如無法同時獲得關鍵的轉錄（mRNA）和翻譯（蛋白質）信息；針對種類繁多且豐度差異的不同脂質，MSI 技術仍然面臨基質不相容和檢測靈敏度不足等問題；受限于光學衍射極限，MSI 技術在單細胞層面的脂質分布成像方法仍有待進一步開發；由于在組織層面存在異質性，導致目前定量質譜成像分析仍然具有較大挑戰，通過開發新型衍生化試劑或內標物質的均勻引入將有助于提高MSI 定量能力。相信在不久的將來，隨著高空間分辨MSI 技術的不斷發展和新型基質的不斷開發，該技術將會在植物細胞的脂質代謝調控研究中展現更廣闊的應用前景。同時，多組學技術（如基因組、轉錄組、代謝組、蛋白組等）本身已經提供了豐富的生物學信息，通過進一步在高空間分辨率上對這些脂質進行空間定位，將有助于在組織甚至單細胞層面對脂質代謝產生全新的認識。