蛋白質互作組學技術及其在植物研究中的應用進展

張文洋，張 勝，易干軍，晏石娟

（1.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.康奈爾大學生物技術研究所，美國 伊薩卡 14850；3.廣東省農業科學院，廣東 廣州 510640）

植物由于其固著的生長方式，一直暴露于自然環境的各種壓力中［1］。為了應對這些挑戰，植物已經進化出復雜的機制來感知外部脅迫并觸發生理、分子和細胞水平的多層次反應［2-3］。構建如此復雜且精細的信號調節網絡需要數千種分子的協作，在較早的研究中，人們對核酸、蛋白質、代謝物進行鑒定和量化，試圖闡明代謝調控機理［4-5］。然而單純的豐度變化信息所能提供的證據有限，僅能大致預測各種分子之前的潛在聯系，卻難以成為它們之間相互關聯的直接證據，也無法確認這種關聯是直接還是間接的，而且很多分子發揮功能并不需要體現在豐度的改變［6］。分子間的物理相互作用是一切信號轉導、代謝調控的基礎，蛋白質或代謝物可對外部刺激迅速作出反應，通過與其他代謝物和蛋白的相互作用推動細胞調節過程以維持細胞和生物體的穩態［7］。

過去10 年，受益于樣品制備技術的改進和質譜儀、譜圖檢索算法的更新迭代，基于質譜的組學技術已能勝任對各類生物的代謝物及蛋白質進行全局的定性定量分析。在這些技術的基礎上，還不斷衍生出多種用于表征分子間相互作用的組學技術。為區別于常規的定量蛋白質組學技術，這類旨在鑒定及量化蛋白質與其他分子之間相互作用的技術被定義為“蛋白質互作組學技術”［8］。根據研究對象，這類技術被分為表征蛋白質-核酸、蛋白質-代謝物、蛋白質-蛋白質相互作用幾大類別，每一個類別的技術又根據不同實施原理進行進一步細分。相比于傳統的生化方法，蛋白質互作組學技術具有全局性、高通量的優點，已在蛋白質功能研究中扮演重要角色，但在植物系統中的應用具有挑戰性，因為植物代謝途徑多種多樣，很多植物的基因組復雜且注釋嚴重不足［9］，許多互作組學分析方法依賴遺傳操作，而這在植物系統中也具有較大難度，特別是在多倍體中。同時，沒有一種方法可以評估相互作用的所有特征（定位、互作模式、親和力和周期等），通常需要組合不同的方法才能更全面地了解感興趣的代謝物或蛋白質的相互作用情況。盡管存在這些固有的挑戰，但全面了解植物復雜性狀形成的代謝調控網絡不僅是解決現代農業最緊迫問題的先決條件，也為守護糧食安全、應對全球極端氣候以及可再生材料和燃料需求提供保障。

本文重點介紹了用于發現和驗證蛋白質-代謝物相互作用（Protein-metabolite interaction,PMI）、蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein interaction,PPI）的多種前沿蛋白互作組學技術，分析它們各自的優缺點和適用的相互作用類型，并且介紹了這些技術在植物領域的研究現狀及最新進展。

1 蛋白質-代謝物相互作用（PMI）

植物是自然界中小分子的“倉庫”，目前已發現了超過20 萬種不同化學結構的代謝物［10］，次級代謝物在結構上更加多樣化，顯示出廣泛的生物活性［11］。在細胞水平上，代謝物可以作為信使（如配體）或作為代謝組分（如酶的底物、產物、輔因子或調節劑）與蛋白質相互作用，調節幾乎所有的細胞過程。了解代謝物生物活性的關鍵在于發現其蛋白質伴侶，經典的生物化學和遺傳學方法一直是研究代謝物功能的常用選擇，但受限于過長的實驗周期，無法高通量篩選代謝物-蛋白質的相互作用，導致當前對代謝物-蛋白質相互作用的探索仍嚴重不足，特別是對于植物特有的代謝物，而這些信息對于理解植物穩態和育種研發都非常關鍵。

近年來，組學技術已在多個分子領域取得巨大成功，越來越多的生化與組學相結合的蛋白質互作組學技術陸續被用于系統識別小分子-蛋白質相互作用，這些方法大多首先被用于藥物研發領域，使得相關研究的通量和效率得到跨越性提升，在植物代謝物的功能研究中也逐漸展示出應用潛力。這些方法根據研究內容分為3 類，分別為以代謝物為中心尋找靶標蛋白、以蛋白質為中心尋找互作代謝物以及全局互作組分析。

1.1 以代謝物為中心尋找靶標蛋白

根據實施的原理，以代謝物為中心尋找靶標蛋白的方法可分為化學蛋白質組學（Chemical proteomics）和生物物理蛋白質組學（Biophysical proteomics）兩大類別。

化學蛋白質組學方法需要對代謝物進行化學修飾或標記，并將其作為“誘餌”從天然細胞裂解物中對蛋白質進行“誘捕”，隨后利用質譜鑒定互作蛋白［12］，由于發展較早，這類技術的應用已非常廣泛，且不斷得到多方面的改進。最簡單的方式是將代謝物固定在固相基質表面進行富集，如利用光反應性水楊酸（SA）類似物4AzSA進行篩選，從擬南芥葉提取物中檢測到35 種4AzSA 的互作蛋白，特別是病程相關基因非表達子1（NPR1），結束了關于這種蛋白質功能的長期爭論［13］。該技術近期在植物中的另一個應用是鑒定RNA 的小分子降解產物2',3'-環磷酸腺苷（cAMP）與RNA 結合蛋白Rbp47b 之間的相互作用，繼而發現這一互作可以促進擬南芥幼苗在暗脅迫和熱脅迫下產生應激顆粒［14］。

雖然使用廣泛且方便，但固定造成的空間位阻和藥效團阻塞可能在一定程度上干擾代謝物與靶標蛋白間的相互作用。針對這一限制，基于活性的蛋白質分析（ABPP）用生物素或熒光標簽修飾天然產物，以便其與蛋白質充分接觸，從而更好地反映生理條件下的代謝物-靶標結合。雙環乙內酰脲作為紫丁香素合成中的副產物引起人們關注，用生物素將其標記后，利用親和純化結合質譜技術鑒定出甘油醛3-磷酸脫氫酶GAPC1和GAPC2 是雙環乙內酰脲的靶標［15］。BRI1 是植物中一種定位于質膜的富亮氨酸重復類受體蛋白激酶，是油菜素內酯受體復合物的關鍵成分，Kinoshita 等使用生物素標記的油菜素甾酮（BPCS，活性油菜素內酯），提供了活性油菜素內酯與BRI1 直接結合的第一個證據，并確定了最小結合域的序列［16］。

某些較大體積的生物素通常不能滲透膜，也會對內源性生物素化蛋白質產生假陽性結果，因此采用炔烴或疊氮化物標簽代替生物素，在小分子上引入用于點擊化學的生物正交基團，能盡可能保持天然產物的理化性質，并允許其進入細胞與靶蛋白進行原位結合。這種方法常用于醫學研究，在植物科學也出現了使用小型標記的E-64和乙烯基砜探針的案例，通過標記擬南芥葉、幼苗或細胞培養物來證明該方法的穩健性和多功能性，可檢測和鑒定以前通過體外標記未檢測到的靶標［17］。

一些天然產物通過非共價鍵（如氫鍵、離子鍵和疏水相互作用）與其蛋白質靶標相互作用。點擊化學探針并不適合這類小分子，因為活性分子和靶蛋白之間的非共價結合會在點擊反應和富集過程中被破壞。光親和力標記（Photo-affinity labeling,PAL）適合研究這類非共價結合的相互作用，為避免小分子和靶標蛋白之間的結合被破壞，光親和探針可在特定波長的光下共價結合目標蛋白質，隨后對靶標進行富集。例如，在探究控制合歡葉感夜運動的茉莉酸糖苷靶標中，三功能探針由感興趣的小分子茉莉酸糖苷、作為反應功能的二苯甲酮和作為富集功能的生物素組成，探針在365 nm 照射下被激活，經鏈霉親和素富集后，成功發現了一種膜蛋白是參與 茉莉酸糖苷控制感夜性的靶蛋白［18］。

對天然產物進行化學修飾難免影響其理化性質，且有些天然產物缺乏合適的修飾位點。因此，近年來涌現出一系列不對天然產物作任何修飾的生物物理蛋白質組學技術，它們利用靶標蛋白與天然產物結合后的理化性質變化來鑒定各類小分子的 互作靶標蛋白。其中，藥物親和反應目標穩定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）和有限蛋白水解質譜（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry,LiP-MS）技術，利用蛋白與小分子結合后形成不易被蛋白酶水解的穩定構象，來鑒定天然產物的蛋白質靶標，還能提供結合的界面信息［19-20］。蛋白質氧化速率穩定性分析（Stability of proteins from rates of oxidation,SPROX）利用甲硫氨酸殘基的氧化速率差異來顯示蛋白質折疊或解折疊的熱力學特性，鑒定與小分子相互作用的靶標蛋白，還能量化其結合親和力［21］。上述兩類方法有相似優勢，但要求在結合區域有特異性酶切位點或甲硫氨酸殘基，而細胞熱位移分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）利用靶蛋白與配體結合后的熱穩定性提升，能從完整細胞、細胞裂解物中識別藥物結合靶標［22］，這項技術隨后與等壓質量標簽定量技術（Tandem mass tag,TMT）結合而成的熱蛋白質組學技術（Thermal proteome profiling,TPP），能同時描繪出數千種蛋白質的熔解曲線，用于體外、原位或體內鑒定配體與靶標蛋白的結合及其蛋白的互作［23］。

DARTS/LiP-MS、SPROX 和CETSA/TPP 等生物物理蛋白質組學技術自建立后得到持續改進和完善，已廣泛應用于動物細胞和微生物研究，但直到近幾年才被陸續用于植物領域，包括用DARTS 驗證藥物endosidin2 與擬南芥外囊復合物亞基EXO70 之間的相互作用［24］，驗證藥物endosidin4 與擬南芥ADP-核糖基化因子鳥嘌呤核苷酸交換因子（ARF-GEFs）之間的關聯［25］，還有用TPP 技術對擬南芥Mg-ATP 相互作用組進行熱蛋白質組學表征以鑒定靶標蛋白［26］。雖然實例較少，但從原理而言，以上3 類技術均能勝任植物細胞研究工作，由于植物細胞與動物細胞的結構和組分存在差異，這些技術還需要經過針對性的優化及改進，但它們無以倫比的高通量、無需對小分子標記的優勢已經顯示出廣泛應用前景。

1.2 以蛋白質為中心尋找互作代謝物

在以蛋白質為中心的互作組學方法中，感興趣的蛋白被用作“誘餌”來識別與它們相互作用的代謝物。串聯親和純化（Tandem affinity purification,TAP）是第一種在體內實施的用于系統鑒定代謝物-蛋白質相互作用的方法，它將感興趣的蛋白與生物素標簽在體內融合表達，以便從天然裂解液中純化代謝物-目標蛋白復合物，隨后將結合的代謝物洗脫并使用質譜平臺進行分析［27］。TAP 與基于LC-MS/MS 的代謝組學和蛋白質組學相結合，被成功用于鑒定擬南芥中與核苷二磷酸激酶（NDPK）相互作用的多種蛋白質和小分子伴侶，包括一些極性代謝物［28］。類似的策略還被用于系統篩選與START 結構域蛋白相關的內源性小分子，該技術促進了兩種尚未確定功能的START 結構域相關蛋白質配體的發現［29］。

雖然TAP 方法的準確性較高，但由于涉及在植物體內表達融合蛋白導致通量很低。另一種技術——天然質譜法（Native MS）無需在植物體內表達融合蛋白，便可以檢測與目標蛋白質結合的配體，從復雜的化合物庫中篩選蛋白底物。其原理大致為將目標蛋白與天然粗提物一起孵育，隨后進行快速凝膠過濾以純化蛋白質-代謝物復合物，在天然質譜分析時，利用一級質譜（MS1）選取完整的蛋白質-配體復合物，通過多級碰撞誘導解離（MSn）對配體進行釋放、片段化和分析，將譜圖與代謝組數據庫比對以實現鑒定。由于多個配體在同一位點競爭結合靶標，因此更容易發現具有最高親和力或濃度的化合物，這一原理表明天然MS 不但能用于胞內PMI 的分析，還能從眾多植物天然產物中高通量地篩選先導化合物，此外，天然MS 還可以提供相互作用的組成、化學計量、熱力學和動力學常數等重要信息［30］。Nguyen 等［31］從來自紅洋蔥皮、紅三葉草、歐芹、桉樹葉和橙皮的數千種天然產物粗提物中篩選出碳酸酐酶（CA）同工酶的14 種小分子結合物，它們大部分屬于黃酮類化合物，其中有12 種曾被報道為一種CA 同工酶的抑制劑，還鑒定了一種新的CA 同工酶配體Ambocin。在蛋白與配體結合前對混合天然產物進行液相分離有助于降低天然產物庫的復雜度，而在實際應用中，由于UHPLC 流動相的酸性條件和高有機溶劑含量，不利于蛋白質與配體的非共價結合，是天然MS 應用的一大瓶頸。Daniel Petras 團隊近期對這一方法進行了改進，首先通過低pH、高有機溶劑含量的液相條件對混合的天然化合物庫進行分離，隨后增加柱后流動相的pH、值和水含量，并在ESI 源前注入待測結合蛋白，結合并行的非靶向代謝組學分析，可以對這些結合的天然代謝物進行鑒定，他們利用這一技術從海洋藍藻群落中鑒定糜蛋白酶的天然抑制劑，實現了一個高效蛋白酶抑制劑家族的靶向分離和結構闡析，并將該抑制劑家族命名為Rivulariapeptolides［32］。

1.3 全局互作組分析（Global analysis of all proteinmetabolite interactions,PROMIS）

上述兩類方法僅限于圍繞某個指定的感興趣小分子或蛋白質為中心展開分析，因此不適用于對相互作用組進行全局范疇的研究。針對這一限制，Ewelina 等提出一種名為PROMIS（Proteinmetabolite interactions using size separation）的新策略，用于擬南芥的互作組學分析發現了多種新的相互作用，且得到AP-MS（Affinity purification mass spectrometry）的驗證［33］。PROMIS 方法旨在對天然裂解物內的蛋白質-蛋白質和蛋白質-代謝物復合物進行全局分析，且無需對任何小分子或蛋白質進行修飾，其原理大致為：將蛋白質-蛋白質和蛋白質-小分子復合物通過尺寸排阻色譜法進行分餾，對各餾分分別進行代謝組學和蛋白質組學定性定量分析，以色譜共流出作為依據來推定相互作用關系。但“共流出”僅是存在相互作用的線索而非證據，通常每種代謝物會與數百種蛋白質共流出，而實際上可能只與其中一種蛋白真正地結合，因此PROMIS 應被視為一種發現工具，用于繪制相互作用組圖，但還必須結合正交方法來定義復合物的確切組成。這與基因表達研究類似，多個PROMIS 數據集的整合具有更高的可信度，如將尺寸過濾與離子交換色譜相結合，首先根據尺寸排阻色譜法分離蛋白質-代謝物復合物，取得一組PROMIS 數據集，隨后將感興趣代謝物所在的餾分經離子交換進行進一步分離，取得正交的PROMIS 數據集，二者組合可用于蛋白質配體的高可信度鑒定。

2 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）

蛋白質很少單獨發揮作用，而是與其他蛋白質組成復合物或相互作用來發揮大部分生物學功能［34］。一般來說，PPI 大致可以分為兩種類型，即構成型和調節型［35］。構成型PPI 非常牢固，主要形成永久性復合物的亞基，很容易通過體內和體外的方法檢測。而調節型PPI 作為生化級聯反應的一部分，僅發生在特定的細胞或環境狀態下，通常對調節刺激非常敏感，在大多數情況下是弱和短暫的，對這類相互作用的研究更具挑戰性［36］。

2.1 親和純化質譜（Affinity purification mass spectrometry,AP-MS）

AP-MS 是一種快速、選擇性和靈敏的工具，用于檢測近生理條件下感興趣的蛋白（誘餌）和相互作用伙伴（獵物）之間的相互作用［37］。與免疫沉淀（IP）相似，AP-MS 可以使用抗體靶向誘餌蛋白，從而在天然條件下從細胞裂解物中捕獲蛋白質復合物。然而，靶向植物蛋白的抗體有限，還存在屏蔽誘餌蛋白相互作用位點的風險，因此，基于親和力的AP-MS 技術將誘餌蛋白與親和標簽融合，利用親和富集的方法將誘餌與其相互作用的復合物一起純化，洗滌除去非特異性結合的蛋白，蛋白質復合物被洗脫進行LC-MS/MS分析［38］。最初的AP-MS 采用單步純化法，導致大量與固相支持物、親和試劑或表位標簽相互作用的假陽性獵物蛋白被鑒定，為提高準確性，需要大量統計測試和陽性對照［39-40］。針對這一問題，最新的串聯親和純化質譜（TAP-MS）技術利用2個不同的表位標簽與誘餌蛋白融合，通過在接近生理條件的兩步親和純化以更大限度地去除假陽性蛋白［37］。

AP-MS 可用于研究相關生物環境中的植物特定器官的生長發育，如花、葉和根，提供蛋白質復合物組成信息［41-43］，此外，AP-MS 可以深入了解由翻譯后修飾所調節的空間或時間依賴性相互作用［44］。一種用于擬南芥植物細胞培養系統的 TAP 技術可以在較低樣品量下對蛋白質復合物進行高通量鑒定［37］。也有TAP 技術將黃色熒光標簽與鏈霉親和素結合肽標簽相結合，除能鑒定蛋白復合物外，還可以確定蛋白在體內的亞細胞定位，擴大了雙親和標簽的用途［45］。TAP-MS可助力植物激素信號轉導的研究工作，如鑒定茉莉酸途徑中的NINJA 及RING E3 連接酶的相關蛋白［46-47］、油菜素類固醇信號傳導的轉錄因子BZR1 的相關蛋白［48］、生長素轉運調節磷酸酶2A 的相關蛋白ROTUNDA3 等［49］。最近的工作將AP-MS 與非標（Label-free）定量蛋白質組學相結合，以解析擬南芥中獨腳金內酯途徑的動態性質，證明該方法以時間分辨率表征蛋白質伙伴交換的潛力［50］。

2.2 鄰近標記法（Proximity labeling mass spectrometry,PL-MS）

植物信號通路中各組分之間的調節型PPI 往往是瞬時和動態的［51］。了解這些瞬時和動態PPI是研究植物信號網絡的主要挑戰之一。Co-IP 和AP-MS 需要在細胞裂解后捕獲PPI，這會導致一些瞬時的、弱的相互作用被破壞，另外，在全細胞裂解液中，一些處于不同亞細胞區室的蛋白會產生生理條件下不存在的相互作用，從而產生假陽性結果［52］，導致經典PPI 技術在植物脅迫響應系統研究中的進一步應用受到很大阻礙。

適用于體內PPI 分析的鄰近標記技術（PLMS）已成為一種新的替代方法，可以克服上述問題并保留有關相互作用的空間信息［52］。例如，在鄰近依賴性生物素標記（BioID）中，誘餌蛋白與非特異性生物素連接酶（如BirA）在胞內融合表達，這種酶可以在10 nm 半徑內對接近誘餌（相互作用）的蛋白質進行共價生物素化修飾，由于該反應僅發生在活細胞中，故排除了在細胞裂解后發生的生理條件下不存在的相互作用，生物素化的互作蛋白可被鏈霉親和素富集，以便免疫印跡或質譜鑒定［52］。

PL-MS 已在哺乳動物細胞和微生物的PPI 研究中有大量應用案例，但在植物中的應用較為滯后。主要難點在于鄰近標記使用的大多數酶最適溫度為37 ℃，而這一溫度不利于大部分植物的生長［53］。另一方面，雖然植物細胞能合成生物素，但其豐度不足以進行酶促的生物素化標記，因此生物素連接酶蛋白表達水平、外源生物素濃度和孵育時間等都需要優化，第1 種在植物中建立的PL-MS 技術基于BioID，被應用于水稻原生質體，鑒定與植物營養生長有關的轉錄因子OsFD2 的相互作用蛋白和鄰近蛋白［54］，以及控制籽粒大小的GS3 蛋白的互作蛋白［55］。Zhang等用新一代TurboID 識別植物免疫受體N 的相互作用子，發現一種新的泛素蛋白連接酶E3 的組件N-Recognin 7 充當調節劑，它直接與免疫受體N 相互作用，介導免疫受體導對植物病原體的免疫［56］。類似技術還被應用于識別氣孔特異性轉錄因子FAMA 的伙伴，并幫助獲得擬南芥幼苗幼小保衛細胞的核蛋白質組，為未來開展空間分辨相互作用組學研究提供關鍵的技術框架［57］。迄今，PL-MS 已成功應用于水稻、番茄、煙草和擬南芥細胞懸浮培養物的多個相互作用蛋白質組研究，還能有效捕獲膜相關蛋白的相互作用［58］。

2.3 交聯質譜法（Cross-linking mass spectrometry,XL-MS）

由于AP-MS 和PL-MS 都需要將感興趣的蛋白與標簽或酶進行融合表達，導致分析通量受限，這意味著要想實現對蛋白質組范圍PPI 網絡的剖析，需要對大量誘餌蛋白進行迭代標記，工作量非常繁重。為了在全細胞范圍表征PPI，新興技術交聯質譜（XL-MS）顯示了廣闊的應用前景，該方法利用小分子交聯劑將相互作用蛋白質的近端氨基酸（～30 ?）進行共價連接，使得質譜能同時鑒定相互作用的蛋白質和交聯位點［59］。XL-MS 代表一種在全局層面定義PPI 拓撲網絡的高通量方法，其結果除用于PPI 映射外，獲取的接觸位點信息還可用于驗證和微調現有蛋白質復合物的結構信息［60］。從問世至今，XL-MS 在多個方面得到增強。首先是MS 可裂解交聯劑及不斷革新的演算法［61-62］，允許使用多級MS（MSn）有效選擇交聯肽對，以便通過MS3可靠識別每個交聯肽，快速準確鑒定交聯肽，使其能夠應用在組學級別的PPI 映射中，且更有利于闡明蛋白質復合物的結構；其次是具有富集能力的交聯劑顯著提高了復雜混合物中低豐度交聯肽的可檢測性［63］，具有膜通透性的交聯劑使得XL-MS 被成功應用于獲得活體細胞中PPI 全局景觀［64］以及超高效交聯劑［65］等。目前最先進的交聯劑Azide-A-DSBSO 和Alkyne-A-DSBSO 兼具膜滲透性、可富集性和MS 可裂解性，均帶有一個小生物正交反應基團，允許以“點擊化學”進行生物素綴合以富集交聯肽；還具有兩個對稱的含亞砜的MS 可裂解鍵，可實現穩健的交聯分離和鑒定；此外，通過去除生物素手柄、加入酸可裂解位點，提高了交聯恢復和識別，這種方法可用于在體內外對任何生物體和樣品開展蛋白質組范圍的PPI研究［64］。另外，XL-MS 技術可以與基于TMT 的標記技術或無標記方法進行定量交聯分析，用于探測PPI 在不同生理條件下或時程中的變化。

雖然XL-MS 已廣泛應用于哺乳動物系統，但其在植物中的應用因細胞壁的存在而受到一定限制，近年來隨著交聯劑種類的增多，植物活體XL-MS 研究成為可能，如高滲透性、酸可裂解的疊氮標簽修飾二琥珀酰亞胺庚二酸酯（AMDSP）實現了擬南芥植物XL-MS 定量蛋白質組分析，識別出354 種獨特的交聯肽［66］。最近有研究將體外交聯與磷酸蛋白質組學分析相結合，以在空間上解析擬南芥TOR 途徑的244 種底物，這種XL-MS 與PTM 的結合分析將為繪制植物系統基本信號網絡提供新的強大工具［67］。

3 結語與展望

蛋白質-代謝物相互作用（PMI）、蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的發現和表征為研究特定代謝物、蛋白質的生物活性提供了非常有價值的信息，有助于我們深入了解生命活動的調節過程。組學技術和質譜儀的應用先后建立了多種表征不同類型相互作用的技術，它們在植物研究領域也展現出極大的應用潛力，本文對這些蛋白質互作組學分析技術的原理和優缺點作了介紹。在實際應用中，研究人員可根據實驗需求選擇適宜的分析技術，有以下幾個因素可供參考：首先是考慮相互作用的類型，有較穩固的結合，也有弱的、瞬態的相互作用，研究者可根據所研究的互作類型選擇合適的方法；其次，除對相互作用伙伴進行鑒定外，相互作用的其他特征（時空信息、互作模式、結合序列、親和力等）對功能研究也同樣很重要，也應根據這些信息需求選擇適宜的分析方法；最后，有些研究有預先確定的感興趣代謝物或蛋白質，有些研究旨在繪制全局性的相互作用網絡，研究者需要在鑒定的準確性、通量和規模之間做出取舍。

對于未來的植物蛋白質互作組學研究的發展，一些關鍵技術瓶頸仍有待克服：一是鑒于各類植物組織的異質性，應重視樣品制備程序，如合適的緩沖液、pH 水平、表面活性劑、輔因子、處理條件等，以確保蛋白質質量和正確構象；二是目前的活性提取方法均較為溫和，大多數膜結合蛋白被排除在外，應盡可能多地納入膜結合蛋白，這能增加相互作用組的覆蓋范圍和深度；三是迄今為止，大多數非模式植物的數據庫尚未建立或注釋嚴重不足，應積極共享各類植物的蛋白質及代謝物數據庫；四是在多種植物體系建立融合蛋白表達技術體系，這在很多相互作用分析技術中都是重要環節；五是生物體內驗證和功能評估對于排除假陽性互作至關重要，但相關實驗較為繁瑣和低通量，是隨著效率提升的一大瓶頸。

相信在不久的將來，蛋白質互作組學技術準確性、效率、通量的提升，將極大地增加PMI、PPI 的鑒定數目，越來越多地應用于植物研究中，推動新型信號轉導及代謝調控通路的解析、新型除草劑或殺蟲劑研發、分子設計育種等基礎研究的開展。