殼聚糖酶及其應用研究新進展

孫亞男，張付云

（大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023）

高效、高附加值地利用豐富的可再生生物質資源對可持續生物經濟至關重要，是現代社會的主要目標[1]。幾丁質是第二大天然有機可再生資源，廣泛分布于生物體內[2]。殼聚糖是幾丁質的脫乙酰化產物[3]，具有多種生物活性，其分子量大、水溶性差，極大地限制了其應用和商業化發展[4]。相比之下，殼寡糖（Chitosanoligosaccharide/Chitooligosaccharide，COS）具有較低的分子量和黏度，以及更好的水溶性，在一些研究中，COS 表現出更好的抗真菌和抗病毒活性，以及促進植物生長的能力等[5-6]。

COS 是殼聚糖的降解產物，是唯一帶正電荷的天然低聚糖。COS 可以通過化學、物理和酶降解制備[7]。酶法與其他2 種方法相比具有反應條件溫和、產率高、選擇性好、可控性和重現性好、對環境有益等優點。具有特殊性質的酶在工業生產中受到青睞。由于聚合度（DP）直接影響COS 的生物活性，因此對殼聚糖酶的研究至關重要，對酶的來源、酶學性質及應用等方面進行概述。

1 天然殼聚糖酶來源

近年來，對細菌來源的殼聚糖酶研究頗多，包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），沙雷氏菌屬（Serratia sp.），鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.），其中Bacillus sp.的來源最多。除了這些常見的菌種，來源于新菌種的殼聚糖酶逐漸被研究者熟知。Ma Qinyuan 等人[8]從多個城市采集了土壤樣品并利用顏色指示劑和酶活的跟蹤測定進行了2 次篩選，發現R.equiF6 表現出最大活性，其菌落呈現淡粉色、圓形、光滑、不透明、發亮和黏液狀。生理、生化和16S rDNA 序列分析得出F6 菌株被歸類為紅球菌屬與幾種馬紅球菌菌株具有100%的同源性。王琦等人[9]克隆了來源于Butyrivibrio sp.MC2013 編碼的殼聚糖酶基因序列并命名為BUT，其與其他GH46 家族的殼聚糖酶相似度最高達59%且無分支出現。Qin Zhen 等人[10]從Gynuella sunshinyiiYC6258 基因組中鑒定GH46 家族假設蛋白基因并合成，BLAST 比對發現GsCsn46A 氨基酸序列與Bacillus nakamurai表達殼聚糖酶同源性最高且是具有GH46 家族催化結構域的單一模塊化蛋白。Wang Yanxin 等人[11]利用Aquabacterium sp.A7-Y 基因組克隆出新的屬于GH5 家族的內切殼聚糖酶——AqCoA，其與來自Polyangium brachysporum的GH5 家族纖維素酶具有高度的序列相似性。此外，通過挖掘或已知的方式也可獲得殼聚糖酶。Yang Guosong 等人[12]通過使用BLASTP 程序和NCBI 數據庫挖掘序列數據得到了來自Bacilus sp.MD-5 的csn-bac 基因。Luo Sa等人[13]利用已知序列的B.Amyloliquefaciens克隆出BaCsn46B 基因。Cui Dandan 等人[14]利用B.atrophaeusBSS 序列克隆出屬于GH46 家族的Csn-SH 酶。

相比于細菌，真菌來源的殼聚糖酶較少，其作用機制和結構鮮有報道，原因是真菌來源的殼聚糖酶活性低于來源于細菌的。Qu Tianle 等人[15]從曲醬油的孢子中分離出來A.oryzae并在PDB 瓊脂平板中大量培養，提取出總RNA 后獲得的cDNA 克隆出一個新的GH20 家族β-N-乙酰己糖胺酶基因-AoNagase 基因，但其折疊方式不同于GH20 家族其他成員。Gleb E.Aktuganov 等人[16]通過篩選殼聚糖降解微生物分離出真菌菌株IB-37-2A，通過BLAST 比對和構建的系統發育樹顯示出與P.janthinellum進化枝中包含的幾種青霉屬物種的最大同源性。

除了從菌株中獲得降解殼聚糖的基因，還有從基因組文庫中挖掘降解殼聚糖的基因。Guan Feifei等人[17]從海洋宏基因組中篩選出CDA20 和CHIS5，分別屬于CE4_SF 超家族和Glyco_hydro_46 家族，二者與ChbG/HPNK 家族脫乙酰基酶和來自Sphaerisporangium albumin的殼聚糖酶有高同源性且協同作用于殼聚糖。

2 殼聚糖酶酶學性質

聚糖酶的最適溫度主要在30～60 ℃。Qin Zhen等人[10]和Sun Huihui 等人[18]異源表達了嗜冷性殼聚糖酶，分別為GsCsn46A 和Csn-CAP，它們分別在15 ℃和20 ℃表現出70%和86%的最大活性。Qu Tianle等人[15]和Jiang Zhenqiang 等人[19]異源表達分別得到了嗜熱性殼聚糖酶-AoNagase 和PbCsn8，它們的最適溫度分別高達65 ℃和70 ℃。熱穩定性高的殼聚糖酶因其眾多的優勢，使得在工業生產中受到極大關注，但相關方面的報道較少。Chen X 等人[20]克隆了來源于Aspergillus fumigatus的殼聚糖酶基因并在畢赤酵母GS115 中高效表達，最終得到熱穩定性極高的新殼聚糖酶，對其特性研究發現在80，90，100 ℃的半衰期分別為2.5，1.0 h，30 min。

殼聚糖酶最適pH 值為4.0～8.0。Guo Na 等人[21]克隆Streptomyces albolongusATCC 27414 基因并異源表達得到了Csn21c，其最適pH 值為8.0，屬于堿性酶。Zheng Qiuling 等人[22]得到了新的殼聚糖酶-CsnS，其最適pH 值為5.8，為偏酸性的酶。

金屬離子會對改造后的殼聚糖酶活性產生影響。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+會促進殼聚糖酶降解殼聚糖，K+、Fe2+、Hg2+、Ni2+會抑制殼聚糖酶降解殼聚糖。Huang Zhen 等人[23]對殼聚糖酶celA1805的特性研究發現，1 mmol/L Ni2+使酶活性增加到111.2%，而Mn2+使活性受到了抑制。

3 提高酶活性方法

野生菌株表達的殼聚糖酶因其酶活性和穩定性不高而不能廣泛使用。近年來，許多文獻從不同的方向報道了不同的方法以提高酶活性和穩定性。

首先，從分子角度對野生菌株的基因進行改變。張朝正等人[24]使用常溫常壓等離子體（ARTP）誘變蠟狀芽孢桿菌并篩選殼聚糖酶活性提高的菌株，試驗結果表明此方法可以篩選到酶活性提高13.19%的突變菌株且酶活穩定性波動不大，僅在5%之內。該方法不改變菌落形態，但改變菌株的個體形態而且當誘變時間達到60 s 會造成蠟狀芽孢桿菌90%以上的致死率。程功等人[25-26]使用畢赤酵母偏好的密碼子優化了環狀芽胞桿菌株MH-K1 編碼殼聚糖酶的基因序列，以使畢赤酵母高效表達殼聚糖酶。也使用該方法優化了解淀粉芽孢桿菌株FZB42 編碼殼聚糖酶的基因序列并在畢赤酵母中高效表達，酶解殼聚糖的結果表明殼寡糖的末端結構為氨基葡萄糖。

其次，優化酶解反應條件。Li Meng 等人[27]采用過氧化氫預處理分散在去離子水中的殼聚糖粉末，以快速降低殼聚糖溶液的黏度，從而使殼聚糖溶解更多。使用此方法通過補料分批殼聚糖成功制備了高濃度（9%，W/V）的殼聚糖溶液。Nur Rokhati 等人[28]使用低濃度的吐溫80 提高了殼聚糖的水解速率且水解時間在24 h 之內。

再次，優化培養條件以提高殼聚糖酶活性。毛貴珠等人[29]對鹿皮色曲霉產殼聚糖酶條件進行了優化，確定了培養基成分：膠體殼聚糖1.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，發酵周期為96 h，該菌株產殼聚糖酶活性是優化前的2.36 倍。王俊芳等人[30]經紫外和微波誘變枯草芽孢桿菌后選取了高產酶菌株并優化了培養基成分和培養條件，研究表明培養基成分為果糖1.3%，膠體殼聚糖0.5%，酵母粉2.0%，MgSO4·7H2O 0.3%和培養條件為初始pH 值7.2，溫度28 ℃，轉速200 r/min 能得到酶活比優化前提高6.9 倍的殼聚糖酶。熊妍妍等人[31]利用冷源等離子體誘變了鹿皮曲霉ZJOU-AC1，得到了酶活力提高了50.7%的殼聚糖酶并確定了最佳發酵條件為溫度30 ℃，初始pH 值6.0，發酵時間80 h，接種量3%。

4 殼聚糖酶的應用

海產品產業的發展使得蝦、蟹等甲殼類動物大量消費，全球產生了高達幾噸的貝類廢物。貝類廢物富含幾丁質等有價值的副產物。然而使用化學方法處理會對生態系統有害，使得酶法降解發揮了重要作用。Gincy Marina Mathew 等人[32]總結了包括殼聚糖酶在內各種酶對副產物的降解。貝類廢物，如蝦（對蝦、蝦、龍蝦、南極磷蝦）殼、蟹殼，首先使用商業酶，如堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶產生者（如桿菌屬）進行脫蛋白作用產生幾丁質，幾丁質分別被幾丁質酶、甲殼素脫乙酰酶降解為殼寡糖（COS）、殼聚糖。殼聚糖和殼寡糖分別被殼聚糖酶、甲殼素低聚糖脫乙酰酶（COD）降解為部分乙酰化的低殼寡糖（paCOS）。

植物抗病研究一直是研究熱點，使用生物方法不僅可以有效提高植物對病原菌的抗性，還可以起到保護生態環境的作用。來源于Chromobacterium violaceumATCC 12472 的殼聚糖酶-CvCsn46 產生的殼聚糖寡聚體抑制擬南芥的菌絲體生長，顯著減少菌絲體延伸并誘導菌絲形態改變[33]。

5 結語

殼寡糖具有分子量小、易溶于水的特點且因其的多種生理活性，在許多領域應用廣泛，尤其在食品和醫藥領域。殼聚糖通過酶法降解為殼寡糖一直是研究熱點，而殼聚糖酶作為高效降解殼聚糖的酶備受關注。殼聚糖酶在各個領域的應用大部分決定于高活性酶的開發及成本[34]。野生菌株表達殼聚糖酶因產量低、活性低、來源有限、穩定性差而阻礙其生產及商品化應用。所以，一方面繼續尋找合適的新野生菌株以作為起點；另一方面深入研究殼聚糖酶結構與功能的關系，從宏觀和分子水平對野生菌株的殼聚糖酶進行定向化處理，從而產生高活性和穩定性的新殼聚糖酶，以符合生產生活需求。