MAM在哺乳動物細胞中的研究進展

徐 妲，馮 鑫，李亞秋，劉思彤，潘曉燕

（吉林醫藥學院生殖醫學中心，吉林吉林 132013）

線粒體相關內質網膜（MAM）具有獨特的生化特性，顯微結構表現為與線粒體緊密相連的內質網（ER）小管。MAM的功能范圍從脂質代謝和鈣信號傳導到炎癥小體形成。與這些功能一致，MAM富含脂質代謝酶和鈣處理蛋白（Dimmer等，2017）。在細胞應激情況下，MAM會改變其調節蛋白組，如細胞氧化還原狀態的改變，從而改變MAM的功能。在哺乳動物細胞中，MAM和線粒體之間接觸位點的形成是細胞存活所必需的，包括鈣從ER轉運到線粒體、將磷脂酰絲氨酸從ER導入線粒體以脫羧為磷脂酰乙醇胺、形成自噬體，線粒體的形態、動力學功能以及細胞存活的調節。

1 MAM參與脂質代謝

在哺乳動物中，大多數磷脂合成起源于ER，這些脂質必須分布在整個細胞中才能組裝新的細胞器（Chauhan等，2016）。ER中合成的五種最突出的磷脂（按豐度降序排列）是磷脂酰膽（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和磷脂酸。PS可以作為PE和PC的前體，它們是主要的細胞磷脂。磷脂必須被運送到缺乏合成機制的膜上，以產生其完整脂質庫。

PS在ER中由MAM酶PS合成酶1和PS合成酶2（PSS1和PSS2）合成。易位至線粒體后，PS被轉運到哺乳動物細胞和酵母中的線粒體，并被磷脂酰絲氨酸脫羧酶（PSD）脫羧形成PE。最后，PE返回ER，磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶2（PEMT2）將其甲基化以合成PC。PSS1和PSS2這兩種酶都催化絲氨酸交換活性，而PSS1促進膽堿交換（Fernandez等，2016）。PE生成中的限速步驟是將PS通過MAM轉移到線粒體中。此外，MAM含有膽固醇（CHOL）和神經酰胺（CER）生物合成所必需的酶，可以促進磷脂、CHOL和CER的運輸（Issop等，2015）。在基礎或靜止狀態下，位于MAM中的酰基輔酶A-膽固醇酰基轉移酶1（ACAT1）催化游離膽固醇形成膽固醇酯，從而控制膜結合和細胞質脂滴儲存的膽固醇之間的平衡（Vance等，2014）。在應激反應下，膽固醇向線粒體的輸入是持續的，細胞色素P450隨后啟動類固醇的生成（Fujimoto等，2012）。在急性壓力或激素刺激下，MAM相關的類固醇生成急性調節蛋白（StAR）通過與VDAC2蛋白的相互作用促進膽固醇進入線粒體，從而啟動線粒體類固醇生成（Prasad等，2015）。此外，還有三磷酸腺苷酶家族蛋白3（ATAD3）在MA-10細胞的MAM中富集，其通過MAM來調節類固醇生成，從而在ER和線粒體之間引導膽固醇（Issop等，2015）。MAM脂筏微結構域中的高濃度膽固醇可以為線粒體中的類固醇生成提供游離膽固醇 （Hayashi等，2010）。此外，降低MAM中的膽固醇可顯著促進MAM和線粒體之間的關聯，并導致PS從頭合成的同時改善PE合成（Fujimoto等，2012）。MAM中似乎產生了一定的神經酰胺庫，因為它們在蛋白質組中含有鞘磷脂磷酸二酯酶（SMASE）、神經酰胺成酶（CerS）和二氫神經酰胺去飽和酶（DES）（Wu等，2010）。可見MAM的結構與功能完整性的維護需要脂質運輸。

2 鈣信號穩態

鈣離子 （Ca2+）是一種多功能的細胞內信號分子，可調節哺乳動物的細胞和生理功能（Rodriguez等，2022）。在MAM中發現了多種形式的Ca2+通道和調節劑之間的相互作用，其調節Ca2+依賴的細胞功能以及維持Ca2+穩態。Ca2+通道的功能是通過從細胞外空間流入的Ca2+或從細胞內Ca2+儲存中釋放Ca2+來提高細胞質Ca2+濃度。Ca2+通過與含有Ca2+結合域的蛋白質結合來傳遞信息，并通過Ca2+傳感器蛋白（如鈣調蛋白）直接或間接調節其構象和活性。細胞器間通信通常采用Ca2+信號的形式，這些Ca2+信號源自ER，其能調節不同的細胞過程，如代謝、受精、遷移和細胞轉運等（Carafol等，2016）。Ca2+信號的主要目標是線粒體，ER到線粒體Ca2+轉移通過線粒體相關的MAM，即位于線粒體附近的ER結構。MAM中Ca2+的濃度比細胞溶膠中的高多倍，從而能使線粒體快速攝取Ca2+。ER到線粒體界面的不同蛋白質維持兩個細胞器之間的Ca2+轉移。肌醇三磷酸（IP3R）是位于ER膜上的依賴性鈣通道，其能控制Ca2+從ER到胞質溶膠的流出，IP3R在細胞分化、存活和凋亡中發揮作用。當ER和線粒體被特定的錨定蛋白束縛時，ER膜上的IP3R可以在OMM處與VDAC1組裝，這要歸功于Grp75、TOM70和MCU蛋白質。這種復合物有利于ER通過IP3Rs釋放的Ca2+直接隧穿到線粒體，從而刺激線粒體代謝。由于能量產生和細胞死亡可以由不同水平的Ca2+觸發，因此MAM在線粒體中Ca2+水平的精細化中起著關鍵作用。生理條件下線粒體Ca2+的上調會激活線粒體酶，從而促進TCA循環和氧化磷酸化。可見ER到線粒體功能性的缺陷降低了線粒體Ca2+攝取的效率，從而抑制了線粒體代謝。

在線粒體中，Ca2+信號取決于其功能特性。雖然Ca2+振蕩刺激新陳代謝并構成促生存信號，但線粒體Ca2+超載導致細胞凋亡。許多化療藥物依賴于有效的內質網線粒體Ca2+信號來發揮其功能。 Ca2+信號的特異性是通過控制Ca2+增加的幅度和時空特性來實現的。因此在空間上，Ca2+增加可能發生在Ca2+通道附近的受限微區或整個細胞質中，蛋白激酶磷酸酶和轉錄因子的Ca2+瞬變可以以不同頻率重復并由下游效應分子來解碼。這種復雜Ca2+信號模式的機制，其包括Ca2+結合蛋白限制游離Ca2+的擴散以及Ca2+本身和Ca2+傳感器對Ca2+運輸系統的正負反饋調節的蛋白質（Islam等，2020）。此外Ca2+對調節癌癥的增殖、轉移、血管生成、線粒體能量產生和對細胞死亡的敏感性起著一定的作用。因此MAM可以調動內質網鈣信號的傳導來調節線粒體的活性。

3 線粒體形態功能調控

線粒體是動態的細胞器，不斷地進行融合和裂變并沿細胞骨架移動。根據細胞類型和對細胞生理學的反應，線粒體表現出多種結構，從分布在整個細胞中的高度連接的管狀結構到聚集在某些細胞中的碎片、聚集結構。線粒體形態通過連續動態變化裂變和融合形成相互連接的線粒體網絡，這種動態形態對于正常的線粒體和細胞功能至關重要（Benard等，2009），它們與細胞凋亡也有著密切聯系。細胞凋亡刺激引發的線粒體裂變，伴隨著嵴解體、線粒體外膜的透化和細胞凋亡調節蛋白的釋放（Labbe等，2014），高分子質量的GTP酶是這些形態動力學的關鍵調節劑。線粒體的兩個膜，即外膜和內膜，有兩種不同的動力蛋白相關GTP酶介導膜融合。大量的調節蛋白存在于線粒體相關的MAM上，以保持細胞器之間的最佳距離并協調ER和線粒體的功能。哺乳動物外膜的融合由絲裂融合蛋白（Mfn1和Mfn2）和內膜蛋白Opa1和Mgm1介導，它們對于線粒體融合至關重要（Tilokani等，2018）。哺乳動物線粒體分裂是由發動蛋白相關GTP酶Drp1介導的，而酵母中線粒體分裂是由Dnm1蛋白介導（Lee等，2016）。在哺乳動物中，Mfn2和Opa1分別是神經退行性疾病Charcot-Marie牙齒病和常染色體顯性遺傳性視神經萎縮疾病的致病基因產物 （Pipis等，2020）。

ER與線粒體接觸并在Drp1和Mff蛋白募集之前介導線粒體收縮，這表明ER在線粒體分裂中也有著重要的作用。之后發現ER結合肌動蛋白聚合蛋白INF2進行肌動蛋白絲聚合，導致線粒體收縮（Sheffer等，2016）。肌動蛋白與Drp1融合會刺激Drp1蛋白GTP酶的活性，導致線粒體裂變（Ji等，2015）。除了INF2外，在線粒體上的肌動蛋白的組裝和分解都是瞬時發生的，這些過程是由肌動蛋白成核、結合蛋白和解聚蛋白介導（Moore等，2016）。除了驅動收縮外，肌動蛋白絲可以調節線粒體裂變所需的寡聚化蛋白Drp1（Hatch等，2016）。除了肌動蛋白之外，Syntaxin 17也是可以調節Drp1活性的蛋白質（Arasaki等，2015）。Syntaxin 17是一種最初與ER到高爾基體細胞內運輸有關的SNARE（SNAP受體）蛋白，它定位于MAM和線粒體，與Drp1在MAM的定位和活性中起到作用。可見，為了維持線粒體裂變和融合之間的平衡，需要ER、MAM和線粒體之間的緊密結合。

4 MAM相關蛋白的調控功能

MAM許多生理作用歸因于ER和線粒體元素之間的接觸位點的形成，因此，識別在MAM和線粒體之間起作用的蛋白質已成為一個活躍的研究領域。這些接觸部位的ER和線粒體之間的距離為10～30 nm（Csordas等，2006），因此連接ER、MAM和線粒體的蛋白質橋可以容納在這個空間內。研究表明，鈣連接蛋白和氧化還原酶TMX的棕櫚酰化使MAM中起作用的蛋白質富集。此外，棕櫚酰化位點的突變阻止了這些蛋白質在MAM中的積累，這表明蛋白質棕櫚酰化可能提供一種將某些蛋白質靶向MAM的機制（Lynes等，2012）。從哺乳動物細胞和組織（Poston等，2013）以及酵母中分離出來的MAM中的蛋白質，進行蛋白質組學篩選鑒定出的大多數蛋白質，它們不太可能直接參與將MAM束縛到線粒體。大多數富含MAM的脂質生物合成酶，它們不直接連接相鄰的膜，例如肌醇-1，4，5-三磷酸受體、σ因子-1、動力蛋白樣蛋白DRP1、氧化還原酶Ero1和MAM中參與鈣信號調節與轉運的蛋白質VDAC。而Akt介導的多功能磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白PACS2，是用于穩定MAM結構與功能的蛋白（Betz等，2013）。

大鼠肝線粒體的輕度蛋白水解表明，線粒體外膜含有PS輸入線粒體所需的蛋白質。這表明線粒體蛋白質參與了MAM和線粒體之間的關聯（Vance等，2015），PS進入線粒體脫羧成PE不需要可溶性胞質蛋白。然而，在牛腦中一種細胞溶質的鈣結合蛋白S100B，透化中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中PS向線粒體的輸入顯著增強，這表明S100B可能促進MAM和線粒體之間的相互作用（Seguella等，2020）。在其他研究中，產生了一種突變CHO細胞系R41（Shiino等，2021），其中PS的熒光類似物從線粒體外膜的外葉輸入到線粒體內膜外側的PSD位點被抑制。哺乳動物細胞中線粒體泛素連接酶MITOL調節ER到線粒體接觸的形成（Sugiura等，2013），這表明哺乳動物細胞的泛素化也可能促進MAM到線粒體接觸位點的形成。

5 MAM參與細胞凋亡

哺乳動物細胞線粒體動力學和形態（即融合和裂變）受MAM到線粒體接觸點形成的調節（Hoppins等，2012）。在細胞凋亡過程中，由于分裂蛋白DRP1募集到線粒體外膜，線粒體碎片增加。相反，當線粒體融合增加時，細胞凋亡會減弱（Wasiak等，2007），在MAM的多功能分選蛋白PACS2耗盡后也誘導細胞凋亡。PACS2的消耗使ER與線粒體解離并誘導線粒體斷裂（Simmen等，2005）。而Drp1與線粒體的結合在細胞凋亡過程中增加（Wang等，2015），并且線粒體斷裂位點的Drp1與細胞凋亡期間線粒體上的促凋亡蛋白Bax共定位（Wu等，2011）。雖然線粒體斷裂本身并不一定會導致細胞凋亡，但線粒體裂變融合機制的組成部分可以正負調節細胞凋亡。可見，線粒體裂變和融合的速度可能與細胞程序性死亡過程直接相關。因此，MAM與線粒體接觸位點的破壞以及線粒體裂變的相應增加與細胞凋亡的誘導有關，細胞凋亡也與線粒體的鈣狀態密切相關。電子斷層掃描研究表明，ER和線粒體的接觸部位可以增加細胞凋亡（Csordas等，2006）。例如，當過量的鈣通過高度集中在MAM中的1，4，5-三磷酸肌醇受體，它從ER流出進入線粒體時，就會發生細胞凋亡。相反，在部分耗盡肌醇-1，4，5-三磷酸受體的細胞中，細胞凋亡減弱 （Liang等，2017）。鈣從ER流入線粒體，促進了促凋亡線粒體外膜蛋白Bax的寡聚化，并導致線粒體外膜的透化。因此，細胞色素C被釋放到細胞質中，在此處激活半胱天冬酶級聯反應，最終誘導細胞凋亡（Deng等，2021）。Ca2+介導的線粒體分裂蛋白DRP1的激活也刺激Bax寡聚化并增加細胞凋亡（Hoppins等，2012）。綜上所述，MAM和線粒體之間接觸位點的形成，在功能上與線粒體Ca2+以及細胞凋亡有關。

6 MAM參與自噬

MAM自噬是一種細胞內降解過程，是一種重要的機制，其需要不斷降解功能失常或不需要細胞的結構，其中細胞質成分被稱為自噬體的隔離雙膜結構（Lamb等，2013）。自噬體與溶酶體融合成為自噬溶酶體，成分被溶酶體內的蛋白酶和水解酶降解。基礎自噬發生在條件正常的情況下，但營養缺乏和其他壓力會刺激自噬。自噬的執行是由自噬相關蛋白質Atg與參與膜運輸的蛋白質共同介導。自噬始于隔離膜即細胞自我吞噬的一個過程，隔離膜在ER富含磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的亞區中形成。隔離膜的擴增可能是由于從起始開始合成脂質，這是由兩種復合物ULK和PI3-激酶復合物的循環激活驅動的（Ktistakis等，2016），以及來自ER、高爾基體中間隔室、高爾基體、內體和質膜（Lamb等，2013）的膜供應。新生的隔離膜吞噬細胞質成分和隨著膜的閉合，它們最終從內質網分離以形成自噬體。通過MAM導入的PS在線粒體中合成的PE熒光類似物被遞送至自噬體。此外，自噬體的形成在細胞中受到嚴重損害，其中ER與線粒體接觸已因線粒體融合蛋白的消耗而中斷（Hamasaki等，2013）。因此，這些研究表明，自噬體的形成和自噬需要MAM與線粒體接觸。PE代謝和自噬體之間是自噬體標記蛋白LC3與PE共價的連接（Magalhaes等，2021），增加了與LC3結合的PE在線粒體中由PS合成的可能性，即通過MAM輸入線粒體。

自噬體形成發生在MAM和線粒體接觸部位，自噬體標記蛋白ATG5和ATG14在饑餓誘導的自噬過程中僅定位于ER與線粒體接觸位點，而在進食狀態下，在MAM（Hong等，2019）中未檢測到ATG14。此外，ER線粒體接觸位點的破壞阻止了ATG14與MAM的關聯，并排除了自噬體形成。這表明饑餓誘導的自噬體的產生發生在MAM與線粒體接觸部位，并且可能需要線粒體衍生的PE的參與。可見MAM參與并調控細胞的自噬。

7 小結

細胞穩態的維持涉及多個細胞器的參與。作為ER與線粒體之間最直接的連接媒介，MAM直接位于這兩個細胞器之間，并緊密參與從ER到線粒體的應激信號的轉導；在某些情況下，它們會將凋亡信號傳遞回ER。這不僅保證了兩個細胞器之間功能的互補性，而且放大了兩個細胞器之間的凋亡信號，從而促進了協調的功能反應。MAM富含脂質代謝酶和鈣處理蛋白。在細胞應激情況下，如細胞氧化還原狀態的改變，MAM會改變其調節蛋白組，從而改變MAM的功能。此外，MAM和線粒體接觸的缺陷可以導致心肌病、肥胖、癌癥和神經退行性疾病等（Islam等，2020），有些疾病表現出線粒體形態和鈣穩態的改變，增加的線粒體碎片可以通過氧化磷酸化減少ATP的產生，這都嚴重影響了線粒體的功能。這些表明MAM的功能改變可能是這些常見疾病發病機制的基礎，這為后續的研究提供了理論依據。盡管近年來對MAM的研究取得了一些進展，但MAM的潛在機制仍有一些不確定性，仍需要解決。因此對MAM需要更加深入的研究，期許MAM更進一步的研究會使生殖醫學及生物工程技術產生新突破。