基于Box－Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化黨參抗氧化活性組分提取工藝

任海云，韓瑞，張磊

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 榆次 030619）

在遭受有害刺激時，機體內(nèi)會產(chǎn)生過多的活性氧自由基，導(dǎo)致機體組織氧化損傷，盡管機體具有抗氧化防御和修復(fù)機制，然而過度的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致機體組織損傷，引發(fā)各種疾病，如何有效抑制過度的氧化應(yīng)激至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，很多傳統(tǒng)中藥具有抗氧化作用。近年來，找尋天然抗氧化劑，并對其抗氧化活性成分及抗氧化機制進行完全的闡釋已成為藥品、食品研究領(lǐng)域的焦點。黨參屬桔梗科植物，含多種抗氧化活性成分，近幾年有關(guān)黨參的研究多集中在中藥組分的提取及其抗氧化活性的研究［1?6］，而將工藝與抗氧化活性相結(jié)合追蹤篩選工藝研究的則比較少。本研究以黨參為研究對象，采用抗氧化活性與工藝相結(jié)合的方式進行跟蹤篩選，以期得到能高度富集抗氧化有效成分的工藝，為下一步血清藥物化學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

黨參藥材產(chǎn)于山西太行，冷凍干燥后粉碎過2 號篩；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、Tris－HCl緩沖溶液、維生素C（Vc）、氫氧化鈉、過硫酸鉀購于山西吉泰生化試劑有限公司；蘆丁對照品、鄰苯三酚、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（ABTS）、2′－聯(lián)氨－雙－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸（DPPH）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用試劑皆為分析純。

1.2 儀器

冷凍干燥機（寧波新芝凍干設(shè)備有限公司）；瓦里安50 Cary紫外可見分光光度計（美國瓦里安公司）；電子天平（上海象平儀器儀表有限公司）；SG－4054型數(shù)控精密恒溫水浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

2 試驗方法

2.1 標準曲線的繪制

參考文獻中的方法測定總黃酮得率［7?11］，精密稱取蘆丁標準品（干燥至恒重）20.6 mg，加入60%的乙醇，超聲溶解并定容，即得蘆丁對照品溶液（C=0.206 mg/mL）。分別準確移取對照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL 容量瓶中，加蒸餾水至6.0 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，放置約5 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，放置約5 min，加入4% 氫氧化鈉溶液10.0 mL，最后加入蒸餾水定容，靜置20 min，在400～600 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，得λmax=505 nm。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標繪制A～C曲線。

對標準曲線進行線性擬合得回歸分析方程：y=13.670 25x－0.007 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 69，表明樣品濃度在0.008 24～0.049 44 mg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性相關(guān)性。

圖1 A～C曲線

2.2 黨參總黃酮樣品溶液及抗氧化能力測試液的制備

首先將黨參進行冷凍干燥預(yù)處理，粉碎過篩放于干燥器中待用。稱取黨參粉末2.0 g于圓底燒瓶中，加入不同體積與濃度的乙醇，設(shè)定溫度和時間后進行水浴回流提取，濾過，取上清液進行旋蒸濃縮，然后迅速轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，加入提取時同樣濃度的乙醇至刻度線即得黨參總黃酮樣品溶液及抗氧化能力測試液。

其中：x為黃酮含量（mg/mL），y為總黃酮得率。

2.3 單因素對黨參體外抗氧化能力的影響

以提取溫度85 ℃、乙醇濃度80%、提取時間60 min、提取1 次為條件考察不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）對黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、提取溫度85 ℃、提取時間60 min、提取1次為條件考察不同乙醇濃度（75%、80%、85%、90%、95%）對黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取時間60 min、提取1次為條件考察不同提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）對黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取溫度85 ℃、提取1次的條件考察不同提取時間（30、60、90、120、150 min）對黨參體外抗氧化能力影響；料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取溫度85 ℃、提取時間60 min的條件考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對黨參體外抗氧化能力影響；以黨參對ABTS自由基清除率評價其體外抗氧化能力。

2.4 ABTS自由基清除能力測定

分別量取7 mmol/L ABTS 水溶液和2.45 mmol/L K2S2O8（過硫酸鉀）水溶液各5 mL，兩者等體積混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，得ABTS儲備液。使用時將ABTS儲備液用無水乙醇稀釋30～40 倍，制備成在波長734 nm處吸光度為（0.70±0.02）的工作液。取兩組不同質(zhì)量濃度的Vc 溶液（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL）1 mL，分別與稀釋后的ABTS 溶液4 mL 及無水乙醇4 mL 混合均勻，在室溫下避光靜置30 min 后用紫外儀在517 nm 處測定吸光度A。以Vc作為陽性對照，每個質(zhì)量濃度測3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計算清除率。

ABTS自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：0.8 mL 無水乙醇與3.2 mL ABTS 稀釋溶液混合均勻作為A0；0.8 mL 樣品溶液與3.2 mL ABTS 稀釋溶液混合均勻作為A1；0.8 mL 樣品溶液與無水乙醇3.2 mL混合均勻作為A2。

2.5 DPPH自由基清除能力測定

取兩組不同質(zhì)量濃度的Vc 溶液（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL）各2 mL，分別加入0.04 g/L DPPH 溶液和無水乙醇各2 mL，經(jīng)振蕩、混合均勻后，在室溫下避光靜置30 min，再用紫外儀在517 nm 處測定吸光度A。最后以Vc 作為陽性對照，每個質(zhì)量濃度測3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計算清除率。

DPPH自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：2 mL 無水乙醇與2 mL DPPH 溶液混合均勻作為空白對照A0；2 mL 樣品溶液與2 mL DPPH 溶液混合均勻作為A1；2 mL無水乙醇與2 mL 樣品溶液混合均勻作為A2。

2.6 ·O2－自由基清除能力測定

量取兩組濃度50 mmol/LTris－HCl 緩沖液（pH=8.2）4.5 mL，在室溫放置20 min，2組均與不同質(zhì)量濃度Vc 溶液（0.08，0.16，0.24，0.32，0.40 mg/mL）1 mL 混合，一組加入2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，另一組加入蒸餾水0.4 mL混合均勻，在室溫下反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，用紫外分光光度計在波長325 nm處測定吸光度。以Vc作為陽性對照，每個質(zhì)量濃度測3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計算清除率。

·O2－自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：4.5 mL Tris－HCl 緩沖液與1 mL 無水乙醇+0.4 mL鄰苯三酚和1 mL HCl溶液作為A0；4.5 mL Tris－HCl 緩沖液與樣品溶液1 mL+鄰苯三酚0.4 mL 和HCl溶液1 mL混合作為A1；4.5 mL Tris－HCl緩沖液+1 mL樣品溶液+0.4 mL水+1 mL HCl溶液混合作為A2。

2.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box－Behnken 設(shè)計原理，采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化黨參抗氧化活性工藝。利用Design－Expert 10.0 軟件以黨參ABTS 自由基清除率為響應(yīng)值設(shè)計4因素3水平的實驗方案進行分析，響應(yīng)面因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對黨參體外抗氧化能力的影響

3.1.1 不同料液比對ABTS自由基清除率的影響

考察不同料液比對黨參提取液ABTS 自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著料液比從1∶20 到1∶40 變化時，黨參提取液對ABTS 自由基清除率伴隨乙醇體積的增加先增加至89.56%，后又下降至84.98%。同時追蹤總黃酮得率變化，其變化趨勢與黨參對ABTS 自由基清除率變化趨勢相似，隨著溶劑乙醇量增多，總黃酮很快溶解析出，但繼續(xù)增加溶劑其得率有所下降。這可能是由于在后續(xù)濃縮過程中損失增大所致，由此可見黨參所含抗氧化成分其得率與黨參提取液清除ABTS 自由基能力正相關(guān)。綜合分析，最終選擇1∶25與1∶35為最低和最高水平進行響應(yīng)面分析實驗。見表2。

表2 料液比對ABTS自由基清除率的影響

3.1.2 不同醇濃度對ABTS自由基清除率的影響

考察不同乙醇濃度對黨參提取液ABTS 自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的增加，黨參提取液ABTS 自由基清除率在乙醇濃度為85%時達到最高，為90.33%，同時總黃酮得率也達到最高，為6.79%，這是由于隨著乙醇濃度增大，總黃酮較易溶解析出。繼續(xù)增加乙醇濃度則導(dǎo)致其ABTS 自由基清除率下降，同時總黃酮得率也顯示明顯下降趨勢，降至5.31%。見表3。既往研究發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度過大則導(dǎo)致體系極性太低，不利于總黃酮的溶解析出［12?13］。醇濃度為85%時ABTS 自由基清除率數(shù)據(jù)最佳，以此為依據(jù)選擇醇濃度80%～90%進行下一步的實驗優(yōu)化。

表3 乙醇濃度對ABTS自由基清除率的影響

3.1.3 不同提取溫度對ABTS自由基清除率的影響

考察不同溫度對黨參提取液ABTS清除效果的影響發(fā)現(xiàn)，在溫度為75～95 ℃范圍內(nèi)隨著溫度上升，黨參提取液ABTS清除率先在85 ℃時達到95.98%，總黃酮得率也增至6.48%，這說明溫度升高有利于總黃酮的溶解析出。然而當溫度繼續(xù)升高時其清除率則呈現(xiàn)下降趨勢，降至91.10%。同時追蹤總黃酮發(fā)現(xiàn)其得率也呈降低趨勢，這可能是由于溫度過高則會使總黃酮結(jié)構(gòu)中易被氧化的部分發(fā)生氧化而失去還原能力所導(dǎo)致。整體總黃酮得率與其抗氧化能力正相關(guān)。最終選擇溫度80 ℃與90 ℃作最低和最高水平進行實驗優(yōu)化。見表4。

表4 提取溫度對ABTS自由基清除率的影響

3.1.4 不同提取時間對ABTS自由基清除率的影響

考察不同提取時間對黨參提取液清除ABTS 自由基的影響發(fā)現(xiàn)，在30～150 min 范圍內(nèi)隨提取時間增加，ABTS自由基清除率先上升至93.27%，后又下降至87.81%。同時追蹤總黃酮得率變化發(fā)現(xiàn)，其與溫度變化趨勢相似，先增至6.48%后又下降至3.72%。由此可見時間過長，會導(dǎo)致總黃酮部分結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化，從而使其失去抗氧化能力，黨參提取液抗氧化能力與總黃酮得率正相關(guān)。綜合分析選擇提取時間在60、90、120 min進行下一步優(yōu)化。見表5。

表5 提取時間對ABTS自由基清除率的影響

3.1.5 不同提取次數(shù)對ABTS自由基清除率的影響

考察提取次數(shù)對黨參提取液ABTS 自由基清除效果的影響發(fā)現(xiàn)，隨著提取次數(shù)的增加清除率隨之上升并趨于平緩，提取次數(shù)1次與2次之間的清除率差值較大，3～5 次的清除率變化減小，均在89%左右，見表6。可明顯看出提取次數(shù)的增加對總黃酮得率影響不大。從試劑消耗、抗氧化能力與富集以總黃酮為代表的抗氧化成分多少綜合分析，選擇2 次為最佳條件進行優(yōu)化。

表6 提取次數(shù)對ABTS自由基清除率的影響

3.2 實驗優(yōu)化結(jié)果

黨參抗氧化活性優(yōu)化工藝回歸模型的建立及其顯著性檢驗見表7和表8。

表7 實驗優(yōu)化方案

表8 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果，采用軟件Design－Expert 10.0 對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到自變量料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇濃度（D）與ABTS 自由基清除率（Y）的多元二次回歸方程為：

對響應(yīng)面回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表8。該回歸模型F值為3.15，P=0.026 8<0.05，表示該試驗所得的回歸方程達到極顯著水平，該模型具有較高的可信度，回歸方程可以很好地預(yù)測黨參抗氧化活性。該模型中一次項D，二次項D2數(shù)據(jù)均<0.05，說明因素D對結(jié)果影響顯著，而一次項A，B，C，和二次項A2，B2，C2的P值均>0.05，可見其交互作用相對較弱，對結(jié)果影響不顯著。

3.3 響應(yīng)面分析

由交互作用圖可知，AC即料液比與提取溫度交互作用曲面最陡，其交互作用最為顯著，AC 交互作用P值0.073 9 與顯著水平相當，這說明黨參抗氧化能力對料液比與提取溫度的改變較為敏感，與方差分析結(jié)果一致。見圖2。

圖2 影響因素交互作用響應(yīng)面圖

為了得到響應(yīng)面最大值及實驗最優(yōu)方案，對所得結(jié)果進行分析，可得各變量因素的最大值料液比為1∶30.923，乙醇濃度為83.521%，提取溫度為89.336 ℃，提取時間為68.727 min，最終得到的清除率為99.942%，考慮到實驗的可實行性將因素水平進行改善，最終料液比、乙醇濃度、提取溫度與提取時間分別為1∶30、85%、90 ℃、70 min，清除率為（99.93 ±0.03）%，與預(yù)測值接近，相對誤差較小。

3.4 與Vc的抗氧化活性比較

在最佳工藝條件下對黨參提取液與陽性對照組Vc抗氧化活性進行比較，結(jié)果在0.08～0.40 mg/mL的濃度范圍內(nèi)黨參提取液對ABTS 自由基的清除率明顯高于Vc，清除·O2－自由基與DPPH 自由基的能力則與Vc 相當，這說明通過工藝優(yōu)化有效提高了黨參抗氧化能力。見表9。

表9 黨參與Vc對DPPH、ABTS以及·O2?自由基清除率的比較（%）

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，能高度富集抗氧化活性的工藝條件為：料液比1∶30、乙醇濃度85%、提取溫度90 ℃與提取時間70 min。在最優(yōu)工藝條件下黨參提取液對DPPH自由基、ABTS自由基以及·O2－自由基均展現(xiàn)出了優(yōu)良的清除能力，且與維生素C 相當，甚至在清除ABTS 自由基時展現(xiàn)出了優(yōu)于維生素C的抗氧化能力。追蹤其抗氧化成分之一——總黃酮的含量也得到很大的提高，進一步表明該工藝能高度富集黨參抗氧化活性成分，可以為下一步的血清藥物化學(xué)提供技術(shù)支持。