穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊自噬相關蛋白Atg5和LC3B的影響

李思琦，趙兵，張磊，肖福龍，宮麗鴻?

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致缺血性卒中、心肌梗死等動脈粥樣硬化性心腦血管病的重要病理學基礎［1］，它的主要病理特點是在動脈血管內壁沉積一種類似粥樣的脂類物質，引起血管腔狹窄，甚至阻塞，發生供血障礙。AS 不穩定斑塊具有脂質核較大、表面纖維帽薄，大量巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤等病理特征。細胞利用溶酶體途徑降解過多的或已受損的細胞器和損傷蛋白的生命現象被稱作自噬［2］。已有研究證明，自噬與多種心血管病緊密相關，尤其是AS 的發生和發展［3－5］。在形態學上，自噬一般分為自噬體的誘導、形成、運輸、裂解等4 個階段。起初，在缺血、缺氧或者饑餓等狀態時，自噬在復雜的分子調控下被誘導；然后，自噬相關蛋白Beclin1 基因12/Atg5 和Atg8 泛素化系統參與進來，將LC3 轉化為LC3Ⅱ，并與Atg12－Atg5－Atg16L 復合物結合成自噬體［6］；接著，將自噬體運送至溶酶體；最后，自噬體與溶酶體融合降解其內的廢物，分解的脂肪酸、氨基酸等有用物質供機體回收再利用［7］，為細胞修復再生、某些細胞器的更新提供必需的原料，以維持細胞穩態。Atg5和LC3是自噬體形成至關重要的基因，二者都參與了對自噬活性的調控。自噬泡形成之初，由ATG12－ATG5－ATG16L形成的復合物與自噬泡外膜相結合，這種結合促進自噬泡伸展擴張［8］，同時還促使LC3向自噬泡募集。LC3是自噬體標志性基因，可作為診斷指標［9］，LC3B是LC3的亞型之一。適度自噬能抑制AS的形成與發展［10］。前期動物實驗證實，搜風祛痰中藥穩斑湯具有抗AS及穩定易損斑塊的作用［11－12］，因此，現通過給予ApoE基因敲除小鼠穩斑湯的方法，觀察Atg5 和LC3B 的蛋白表達水平，從而探討穩斑湯影響AS斑塊穩定性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只6周齡雄性ApoE 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2020－0004。20 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2020－0001。本實驗符合遼寧中醫藥大學動物倫理委員會標準（實驗動物倫理審查編號：21000042020038）。

1.2 實驗藥物

穩斑湯組成：全蝎5 g，蜈蚣1 條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術15 g 和水蛭15 g。上述藥物均購自遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局。首先將藥物浸入常溫水中0.5 h，先武火后文火煎1 h，倒出藥液，煎煮3 次，將藥液合并，紗布過濾，100 ℃水浴濃縮至100 mL，4 ℃冰箱儲存，加工制成含生藥2 g/mL 的中藥濃縮液備用；阿托伐他汀片（規格：10 mg/片，輝瑞制藥有限公司，批準文號：EG6187）。

1.3 實驗試劑和儀器

兔抗鼠Atg5（批號：49050）、LC3B（批號：30848），Signalway Antibody公司；辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG（批號：K1223），ApexBio 公司；SDS－PAGE 電泳液（批號：P0014B）、SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒（批號：P0012A）、SDS－PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）（批號：P0015L）、Western 轉膜液（批號：P0021B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012）、RIPA 裂解液（強）（批號：P0013B）、超敏ECL 發光試劑盒（批號：P0018S），碧云天生物技術研究所。

SIS透射電鏡數字攝像頭（TEM CCD Camera），德國EMSIS，型號：MORADA；電泳儀（EPS200型）、凝膠成像分析系統（Tanon－4200SF型），上海天能科技有限公司。

1.4 AS模型的制備

適應性普食喂養60只ApoE基因敲除小鼠1周，然后進行高脂喂養，飼料由沈陽于洪區盛旺牧業飼料廠提供。13周后，依據隨機數字表取4只處死，取腹主動脈血管，HE染色判斷造模是否成功。

1.5 分組與干預方法

隨機取50只造模成功的ApoE基因敲除小鼠，隨機分為模型組，穩斑湯低、中、高劑量組，阿托伐他汀組，每組10 只，繼續高脂飲食。隨機選擇10 只C57 BL/6J 小鼠為空白對照組，普食喂養。空白對照組和模型組給予生理鹽水0.3 mL/d。按照成人每日臨床推薦用藥劑量，按成人與小鼠體表面積折算系數0.002 6 折算小鼠用量，穩斑湯各劑量組分別予穩斑湯6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），阿托伐他汀組予阿托伐他汀片25.4 mg/（kg·d）；高劑量組為中劑量組兩倍，中劑量組為低劑量組兩倍。每日灌胃1次，共13周。

1.6 標本采集和處理

處死全部小鼠，剪開小鼠胸腔和腹腔，取出整條腹主動脈，清除主動脈外部脂肪，將主動脈?80 ℃冷凍保存于冰箱。

1.7 觀察指標與方法

1.7.1 超微透射電鏡觀察自噬體

取主動脈弓，用移液槍抽取2.5%戊二醛進行固定，將組織切成長寬均為1 mm 的小塊，放入盛有1 mL 4 ℃戊二醛固定液的EP 管中待用；脫水、包埋、超薄切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.7.2 Western blot 法檢測Atg5 和LC3B 蛋白表達水平

取冰箱中主動脈組織融化，按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用高速電動勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10 000 r/min離心15 min，分離上清液，即為總蛋白備用。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，制備凝膠，加入等量上樣緩沖液，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移到PVDF 膜，封閉40 min，4 ℃孵育一抗（Atg5 稀釋比例1∶1 000，LC3B稀釋比例1∶500）過夜，室溫孵育二抗（稀釋比例1∶5 000）1 h，洗膜，ECL 發光，凝膠系統成像，使用Image J 軟件計算蛋白灰度值，并用目的蛋白灰度值和內參灰度值的比值表示相應目的蛋白表達量，進行統計分析。

1.8 統計學方法

使用SPSS 21.0 版軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腹主動脈組織透射電鏡觀察結果

空白對照組可見少量自噬體，自噬體呈雙層膜囊泡狀結構，其中有內容物；模型組無明顯自噬體；穩斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均觀察到有較多自噬體，其數量均高于模型組；其中阿托伐他汀組自噬體最多。見圖1。

圖1 各組小鼠腹主動脈組織透射電鏡下結構（×5 000）

2.2 各組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達水平比較

各組小鼠腹主動脈組織Atg5和LC3B蛋白電泳圖見圖2。與空白對照組相比，模型組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達水平均降低（P<0.05）；與模型組相比，穩斑湯各劑量組和阿托伐他汀組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達水平均升高（P <0.05）。見表1。

圖2 各組小鼠腹主動脈組織中Atg5、LC3B蛋白表達電泳圖

表1 各組小鼠腹主動脈組織Atg5、LC3B蛋白表達水平比較（xˉ±s）

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化作為心肌梗死、冠心病的主要病理基礎，其本質是慢性炎癥［13］。由于斑塊的不穩定性，AS 斑塊破裂會導致急性心血管事件發生。因此，深入研究不穩定斑塊易損性的機制，促使不穩定斑塊向穩定趨勢發展，是減少急性心血管事件發生的根本。

自噬是為保持細胞穩態、細胞器完整性的一種自我防御保護機制［14］。相關研究發現，自噬在AS中有著不容忽視的作用，自噬與AS 斑塊脆弱性密切相關［15］，提高自噬水平可以抑制AS［16］，降低AS 斑塊脆弱性［17］。自噬這一進程受自噬相關基因（Atg）的嚴格調控，其中Atg5 是自噬體形成進程的重要基因之一，哺乳動物去除Atg5 能夠阻止自噬發生［18］。周仕霞等［19］研究發現，干擾Atg5 基因后，細胞自噬活性明顯降低。LC3 作為真核細胞Atg8 的同源基因，存在于自噬泡前體和自噬體膜的表面，它參與了自噬體形成，是確認自噬發生的最直接證據［20］，其含量與自噬體數量呈正相關，檢測亞型LC3B 的蛋白可反映自噬程度［21］。目前認為，適度自噬對AS斑塊具有保護作用。

他汀類藥物具有明確的穩定斑塊、抗炎、抗氧化應激、改善內皮功能及抑制血栓形成等作用。阿托伐他汀片是目前臨床上應用最廣泛的新型他汀類藥物，是調節血脂、預防AS、穩定AS 斑塊的首選藥物。研究顯示，阿托伐他汀可通過AMPK 信號通路激活自噬抑制凋亡［22］，還可通過提高自噬，抑制巨噬細胞炎性反應，減少脂質沉積，使AS 斑塊更穩定［23－24］。因此，本實驗選用阿托伐他汀片為西藥對照藥。

本研究結果表明，在透射電鏡下發現，空白對照組有少量自噬體，說明在正常生理條件下，自噬處于一個基礎水平；與空白對照組比較，模型組無明顯自噬體，說明自噬處于很低水平。穩斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均有較多自噬體出現，且數量均高于模型組，說明穩斑湯和阿托伐他汀組具有提高自噬水平的效果。此外，與空白對照組相比，模型組小鼠腹主動脈組織中Atg5、LC3B 蛋白表達水平明顯降低，說明AS 發生時，可導致Atg5、LC3B 蛋白表達水平的降低；而穩斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均不同程度地提高Atg5、LC3B蛋白表達水平，說明穩斑湯和阿托伐他汀都提高了自噬相關蛋白活性。以上這些證據均說明穩斑湯可通過上調Atg5、LC3B蛋白表達水平來提高自噬活性。

AS是現代醫學病名，中醫典籍未對此病名進行記載，據其臨床表現可將其歸屬于“胸痹”等范疇。老年人恣食膏粱厚味，又年老體虛，久則易損脾胃之氣，使脾胃運化輸布無權而釀生痰濁。痰濁日久浸漬在脈道中，或情志內傷導致氣機不暢，可使血行失暢，脈絡不利，內生瘀血，阻滯于心脈之中。隨著病程進展，久病則損人體正氣，氣虛無法推動血液運行，瘀血阻滯更甚，痰濁與瘀血互結，不能排出，積聚日久致內生毒熱，熱極生內風。風為百病之長，且善行數變，百病皆由痰作祟，風痰內動。運用取類比象的方法，“風”之“善行數變”之性，恰恰類似AS斑塊的不穩定之性。宮麗鴻教授根據多年臨床經驗提出“風痰”是導致AS的主要病因［25］，故以“風痰理論”為基礎，創新性地化裁《醫學衷中參西錄》中的逐風湯，創搜風祛痰中藥穩斑湯治療以動脈粥樣硬化為基礎的心血管疾病，療效顯著。方中蜈蚣、全蝎、地龍三藥相須，兼具搜風止痙、通絡止痛之效，共為君藥；陳皮、法半夏、白術三藥共用為臣藥，兼具燥濕健脾、理氣化痰之效；水蛭為佐藥，破血行瘀。縱觀全方，共奏搜風祛痰、活血化瘀之功。現代藥理研究顯示，蜈蚣不僅具有溶栓作用，還能抑制血管內動脈血栓形成，改善心肌缺血［26］；全蝎具有抗凝、抗血栓、促纖溶的功效，并改善血液循環［27］，其所含的飽和脂肪酸具有抑制靜脈血栓形成、延緩AS 進程的作用［28］；地龍具備抗凝、抗血栓的效用［29］，還能改善微循環，其所含蚓激酶有纖溶酶的活性；陳皮具有降低血脂、抗AS、保護心肌、抗炎及抗氧化的作用［30］；半夏具有抗炎、抗氧化的作用［31］，還能降低血黏度、提高紅細胞變形能力；白術具有調節脂代謝、抗動脈粥樣硬化的作用［32］；水蛭所含的水蛭素作為天然的凝血酶抑制劑，能抑制凝血酶與血小板結合，也具備抗凝［33］、抗血栓［34］的效用，還能調節脂代謝［35］。以上研究結果奠定了穩斑湯干預AS的現代藥理學理論基礎。穩斑湯基于整體觀，多途徑、多靶點地干預AS，為防治AS提供了新思路、新方法，具有臨床推廣價值。

綜上所述，本研究發現穩斑湯具有提高細胞自噬活性、抗AS的作用。干預Atg5、LC3B 蛋白表達或將成為防治AS新靶點。提高Atg5、LC3B 蛋白表達水平，這可能是其增強AS斑塊穩定性的分子機制之一，為更加明確穩斑湯的作用靶點，仍需繼續在分子生物學、基因層面對其進行深入研究。