蜂蜜中甘油殘留量測定及限度標準建議

李櫻紅 周 萍 李加芬 吳曉群 郇敏 李珊珊 胡福良

（1 浙江省食品藥品檢驗研究院 NMPA微生物檢測與預警重點實驗室 浙江省藥品接觸材料質量控制研究重點實驗室，杭州 310052；2 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；3 安徽蜜之源食品集團有限公司，蕪湖 241000；4 桐廬縣市場監管局，桐廬 3 115005；5 桐廬縣農業農村局，桐廬 311500；6 浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

1 引言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]。蜂蜜在生產過程中，由于追求產量和操作不規范等因素，導致市場上會有一些非成熟蜜的出現。非成熟蜂蜜的特點是水分含量較高，約24%～36%，如果保存和生產方式不當，這種蜂蜜極易發酵，從而影響蜂蜜品質[2]。而成熟蜂蜜則是蜜蜂采集花蜜后在蜂房內自然釀造而成，水分含量在15%～20%之間，成熟蜂蜜貯存在蜂房中，蜜蜂在其上方泌蠟封蓋，其質量穩定，不易發酵，市場上常見的巢蜜是成熟蜂蜜的一種商品形式[3]。當蜂蜜被微生物特別是嗜滲酵母等污染時，在高糖環境脅迫下，會分泌出甘油[4]。劉功良等[5]從蜂蜜中獲得1 株可耐受700g/L 葡萄糖濃度的蜂蜜接合酵母LGL-1，這種酵母在高糖培養基中72h 后，甘油含量可達2.6g/L。Huidobro 等研究表明，在甘油含量超過200mg/kg 時，超過79%的蜂蜜中含有微生物和孢子[6]。由于非成熟蜜極易受微生物污染發酵，檢測表明，其中的甘油含量明顯高于成熟蜂蜜[4]。可見，甘油殘留量可作為蜂蜜微生物污染時的標志性成分之一。

德國《食品化工》雜志在1998 年報道了我國蜂蜜含有大量的酵母菌和甘油，水分在20%～28%之間，8 種蜂蜜的甘油含量在500 mg/kg 以上[7]。自此甘油含量成為出口蜂蜜的必檢指標。現行蜂蜜食品安全國家標準《蜂蜜》（GB 14963-2011）[1]中規定糖類和微生物等指標，受到微生物污染的蜂蜜可通過滅菌、濃縮等手段達到國家標準的要求。我國蜂蜜的行標《蜂蜜》（GH/T 18796-2012）[8]和國際食品法典委員會的蜂蜜標準《蜂蜜》（CXS 12-1981，2019 版）[9]，規定淀粉酶值和羥甲基糠醛指標，用來反映蜂蜜新鮮度，而成熟蜂蜜與非成熟蜂蜜均能達到標準要求。但是，蜂蜜因微生物污染而形成的甘油極難從蜂蜜中去除，甘油含量的高低可以真實反映蜂蜜曾受微生物污染的程度，是衡量蜂蜜品質的極為關鍵指標，也可以作為判定蜂蜜是否成熟的重要指標。

本文就蜂蜜中的甘油殘留量進行測定，比較蜂蜜原料、不同加工方式的蜂蜜半成品和成品，以及市售商品化蜂蜜中甘油殘留量，同時檢測果葡糖漿中甘油殘留量，根據蜂蜜及果葡糖漿中甘油殘留量，提出蜂蜜中殘留量限度標準的建議，進而為蜂蜜的質量控制提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-10A 型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、二元泵、手動進樣器、柱溫箱、示差折光檢測器）；Sartorius BS224S 分析天平；甘油（純度大于99%，中國食品藥品檢定研究院）；醫藥級微粉硅膠（純度大于99%）；赤蘚糖醇內標（純度大于99%）；95%乙醇為分析純；乙腈為HPLC 級；蒸餾水（符合GB/T 6682 一級水）。

蜂蜜原料、半成品及成品由安徽蜜之源食品集團有限公司提供，24 個商品化蜂蜜為市場采購，涉及11 家生產企業。詳情見表1。

表1 市場采購商品化蜂蜜信息表

2.2 高效液相色譜法檢測甘油含量

蜂蜜樣品中的甘油含量檢測參照《蜂蜜中甘油含量測定——高效液相色譜法》（GH/T 1313-2020）[10]。

2.2.1 樣品處理

稱取蜂蜜樣品5.0 g，精確至0.05g，于90mm蒸發皿中，分別加入100mg/mL 赤蘚糖醇內標溶液200μL，水1mL，乙醇5mL，攪拌均勻至完全溶解，加入2.5g 微粉硅膠，攪拌充分分散，150℃電熱板上緩緩邊攪拌邊蒸干，轉入50 mL 玻璃離心瓶中，加入20mL 乙腈，混勻，超聲20min，每隔5min 取出搖勻，4000rpm 離心3min，吸取上清液于50mL 茄形瓶中，殘渣中再加入20mL 乙腈重復提取1 次，合并上清液，70℃下旋轉蒸發至干，加1mL 乙腈水溶液（9+1），超聲溶解殘渣，吸取溶解后的樣液經0.22μm 濾膜過濾，得試樣溶液。

2.2.2 空白基質標準曲線制備

稱取5 份空白樣品各5.0g，精確至0.05g，于90mm 蒸發皿中，各加入100mg/mL 赤蘚糖醇內標溶液200μL，各加入2mg/mL 甘油工作標準液Ⅱ125μL、250μL、500μL，和20mg/mL 甘油工作標準液Ⅰ 125μL、250μL，從2.2.1“水1mL”起依此操作，得到空白基質標準曲線工作溶液。相當于標準溶液系列濃度為250mg/L、500mg/ L、1000mg/L、2500mg/L、5000mg/L。

2.2.3 液相條件

色譜柱：聚合物氨基填料色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；或等效色譜柱；流動相：乙腈+水=87+13；流動相流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測池溫度：35℃；進樣量：40μL。

2.2.4 測定

用空白基質標準曲線工作溶液（2.2.2）、試樣溶液（2.2.1）分別進樣，以標準工作溶液濃度為橫坐標，以甘油與內標峰面積比值為縱坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量。標準工作溶液及試樣溶液中甘油與人標的響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。

2.3 數據統計

采用Microsoft Excel 2010 對數據進行處理。

3 結果與討論

3.1 標準曲線繪制

按GH/T 1313-2020 的要求，繪制標準工作曲線，線性方程：y=0.000810x+0.00768，相關系數r2=0.9995。空白樣品及陽性樣品色譜圖見圖1。如圖1 所示，甘油和內標色譜峰分離度良好，甘油的參考保留時間為6.5 min，內標的參考保留時間為9.2 min。

圖1 蜂蜜空白樣品及陽性樣品色譜圖

3.2 蜂蜜原料中甘油殘留量分析

花蜜被蜜蜂采回并貯存在蜂房中，由于蜂房環境相對潔凈，蜂蜜中含有抗菌成分，水分不斷蒸發，則蜂房中的蜂蜜不宜發酵。當蜂蜜被蜂農采收，蜂蜜被置于較差的衛生環境中，受到水、空氣、包裝桶等的污染，在常溫條件下，蜂蜜產生發酵現象。作為發酵產物的乙醇、甘油、二氧化碳，在蜂蜜加工的真空濃縮工序中，除甘油以外均可被蒸發去除，因此，用甘油來指證蜂蜜的發酵事實是一種行之有效的方法[4]。通過對常見的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴樹蜂蜜、荊條蜂蜜、棗花蜂蜜、荔枝蜂蜜等原料以及封蓋的成熟蜜（巢蜜）進行甘油殘留量分析，結果見表2。

表2 蜂蜜原料中甘油含量

從表2 可知，蜂蜜原料樣品中的水分含量范圍為16.3%～29.2%，蜂蜜原料均檢出了甘油，含量范圍為28.2～478mg/kg。研究發現蜂蜜原料的水分含量在18%以下時，相應的甘油殘留量在50 mg/kg 以下。水分含量在18%～23%時，甘油含量在28～100mg/kg 之間。當水分含量超過23%時，甘油含量在103～478mg/kg之間。表明蜂蜜原料中水分含量越高，甘油含量也越高。這與前人研究結果[11,12]一致：蜂蜜含水量在17.1%～18%時，每克含1000 個以下菌體的蜂蜜，一般條件下貯存1 年之內不會發酵，蜂蜜水分超過20%時，發酵很容易發生。這同樣說明了蜂蜜采收時，應充分保證衛生規范的重要性。

3.3 蜂蜜半成品中甘油殘留量分析

對常見的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴樹蜂蜜、荊條蜂蜜、棗花蜂蜜、荔枝蜂蜜等蜂蜜半成品進行甘油含量的分析，結果見表3。

從表3 可知，蜂蜜原料貯存近1 個月后，濃縮加工成的半成品蜂蜜中，水分含量范圍為18.2%～19.3%，而甘油含量明顯升高，最高達到895mg/kg。值得注意的是，有2 批來自我國西北的洋槐蜂蜜的甘油含量提升不明顯（收購日期20210505和20210512），仍然在100mg/kg 以下，可能是由于西北地區干燥多風，洋槐蜂蜜容易脫水，且環境微生物污染程度低，不易產生發酵。蜂蜜原料到工廠后，等待抽樣檢測的時間較長，等到全部檢測結果出來做出品質判定時，至少需要半個月的時間，加上時值春季，氣溫升高，微生物很易繁殖。李亮等報道[13]，蜂蜜在室溫下貯存第4 周時，蜂蜜中甘油含量明顯增加，從649mg/kg 增加到1101mg/kg。因此，為了保證產品質量，到工廠的蜂蜜應該盡快進行濃縮。建議工廠可對高風險且關鍵的質量安全項目進行檢測，符合要求即可進行濃縮。

表3 蜂蜜半成品中甘油含量

3.4 蜂蜜成品中甘油殘留量分析

對3.3 的半成品蜂蜜進行成品加工，取樣分析甘油殘留量，結果見表4。

從表4 可知，經過濃縮后，蜂蜜的水分范圍降到16.3%～19.5%，甘油含量范圍為 30.8～890mg/kg。表明蜂蜜處于品質穩定的狀態，不容易產生發酵現象，其甘油含量變化幅度不大，達到相對穩定的狀態。

表4 蜂蜜成品中甘油含量

3.5 商品蜂蜜中甘油殘留量分析

從原料、半成品、成品的檢測情況看，甘油含量在水分低于19.5%以下時穩定，當水分高于24%時，蜂蜜處于發酵活躍狀態，甘油含量處于快速增加期。在生產過程中，工廠對蜂蜜進行了滅菌處理，水分也降到19.5%以下的水平，此時，蜂蜜中甘油含量變化率在-9.43%～8.81%之間，處于相對穩定期。

對市售的24 個商品化蜂蜜進行甘油檢測，結果見表5。

表5 商品蜂蜜中甘油含量

從表5 可知，市售商品化蜂蜜均檢測出甘油殘留。4 個蜂蜜樣品甘油殘留量小于100mg/kg，3 個蜂蜜樣品甘油殘留量為100～199mg/kg，6 個蜂蜜樣品甘油殘留量為200～399mg/kg，2 個蜂蜜樣品甘油殘留量為400～800mg/kg，3 個蜂蜜樣品甘油殘留量為800～999mg/kg，6 個蜂蜜樣品甘油殘留量大于1000mg/kg，占比25%。甘油含量小于400mg/kg 的蜂蜜占比54.2%，表明由于我國蜂蜜國家或者行業標準未規定甘油出限量質量指標，生產企業未對蜂蜜中甘油含量進行監控，原料未及時采取冷藏或者及時加工等防止微生物發酵的措施，導致市場上不同品牌不同花種蜂蜜中甘油含量差異較大的現象發生。

3.6 蜂蜜中甘油含量的限量標準現狀分析

甘油被認為是區別成熟與非成熟蜂蜜的主要指標，常常出現在出口蜂蜜的質量指標中。一些國內企業對蜂蜜中甘油的限量做出了規定，我國現行蜂蜜質量標準如下表6，作為蜂蜜發酵程度及蜂蜜成熟度的指標，甘油是蜂蜜質量指標的關鍵項目。某企業對甘油限量給出小于100mg/kg 的要求，從我們抽查的商品蜂蜜情況看，只占到總數的17%，按團體標準300mg/kg 的限量要求，只占到總數的29.2%。我國市場上蜂蜜中甘油的含量處于一個較高水平，大部分不能達到團體標準特等品的要求。消費者報道欄目對市場上的8 款蜂蜜進行了甘油含量檢測[14]，僅1 款小于300mg/kg，500mg/kg 以下的有4 款，占50%。甘油含量大于1000mg/kg 的有2 款蜂蜜，或已變酸。

表6 現行不同蜂蜜質量標準質量指標比較

3.7 蜂蜜中甘油含量的限度標準建議

蜂蜜中的甘油含量與酵母菌發酵直接相關，發酵程度又與蜂蜜污染微生物的程度以及含水量有關。從原料情況看，蜂蜜送到工廠時，就可能有甘油的存在，當蜂蜜中水分低于24%時，甘油含量處于一個較低水平，蜂蜜含水量在20%以下時，蜂蜜中的甘油含量處于穩定。

本文檢測了24 個商品化蜂蜜樣品，結果300mg/kg以下占比29.2%，500mg/kg 以下占比54.2%。前期研究報道表明，316 個蜂蜜樣品中，300mg/kg 以下占比67%，500mg/kg 以下占比87%[6]。在8 個蜂蜜樣品中，300mg/kg 以下占比12.5%，500mg/kg 以下占比50%[13]。

綜合上述情況，建議甘油殘留量300mg/kg 以下的蜂蜜為特等品，甘油殘留量在300～500mg/kg 的蜂蜜為合格品（按蜂蜜團體標準的分級方法）。成熟蜂蜜甘油含量應控制在200mg/kg 以下。

4 結論

通過前期研究，起草發布了行業標準《蜂蜜中甘油含量測定——高效液相色譜法》（GH/T 1313-2020）[10]，將甘油列為蜂蜜品質指標，可以監控蜂蜜的微生物污染狀況，促使蜂農生產成熟蜂蜜，提升蜂農采收蜂蜜的衛生意識，從而提升我國蜂蜜的整體質量水平[15]。本研究進一步檢測了原料、半成品、成品蜂蜜、商品化蜂蜜中的甘油殘留量，查閱了相關文獻，建議甘油含量300mg/kg 以下的蜂蜜為特等品，甘油含量在300～500mg/kg 的蜂蜜為合格品（按蜂蜜團體標準的分級方法）。成熟蜂蜜甘油含量應控制在200mg/kg 以下。根據蜂蜜中甘油形成的原理，建議蜂農在取蜜時，應注意衛生，防止微生物的污染，提倡生產成熟蜂蜜。蜂蜜原料到工廠后，應將蜂蜜置于陰涼、通風、干燥處，并盡快將蜂蜜濃縮至水分20% 以下。蜂蜜加工應注意控制微生物指標，對于微生物超過國家標準的蜂蜜，應做好滅菌工作。