探索性醫學細胞生物學實驗設計與實踐

高芙蓉，李 姣，許 潔，賈 松，徐 磊，呂立夏

（同濟大學醫學院，上海 200092）

0 引言

細胞生物學是一門以實驗為基礎的技術性和實踐性很強的學科。細胞生物學實驗課的開展不僅有助于學生更好地理解和把握細胞生物學理論知識、掌握研究細胞的基本方法和實驗技能、培養學生的科研能力，而且有助于高素質、創新能力強的生命科學人才的培養，為其將來從事工作奠定良好的理論和技術基礎［1-2］。

隨著學科前沿研究工作的突飛猛進以及國家創新型人才培養質量要求，細胞生物學實驗內容需要從經典的驗證性實驗轉向學科研究所需要的實驗技能及科研素養的綜合性、探索性實驗轉變。因此，如何將科研思維、細胞生物學技術與細胞生物學知識全面融合，提高學生的實驗積極性和對知識的綜合應用能力，培養學生的科研創新能力，是各大高校在教學中不斷進行探索的問題［3-7］。

針對我校目前細胞生物學實驗的現狀，教學團隊對實驗教學內容進行了更新、優化，刪除驗證性的光學顯微鏡的使用、細胞融合等實驗，保持原有干細胞培養及誘導分化［8］的優勢，引入2020 全球臨床醫學領域TOP10 研究熱點中之一——腫瘤，以臨床現實問題為出發點，設計綜合性、探究性的腫瘤細胞生物學實驗，體現分子-細胞器-細胞3 個層面的研究，引導學生將理論知識融會貫通，并應用于對實際問題解決的探索和研究中，充分發揮學生的主觀能動性，提高教學效果。在教學模式上，采用臨床問題導入法和線上線下混合式教學的形式，督促學生深入理解實驗技術的原理，并掌握不同實驗技術的應用范圍，以及科學研究與人類健康、臨床疾病治療的關系，鼓勵學生探究、模擬科研過程以推動學生綜合運用知識和科研創新思維的培養。

1 實驗的設計與實施

1.1 實驗設計

癌癥是世界上導致人類死亡的主要原因之一，并產生嚴重的經濟負擔。隨著人口老齡化加劇、環境惡化以及其他不良習慣的出現，癌癥越來越常見。世界衛生組織發布的GLOBOCAN2018 報告顯示，2018 年全球有1 810萬新發癌癥病例，960 萬癌癥死亡病例，其中我國有428.5 萬新發病例和286.5 萬癌癥死亡病例［9-10］。盡管科技不斷進步提高了癌癥患者的生存率，但晚期癌癥依然是非常難治的疾病［11］。針對腫瘤細胞特有的生物學特征，比如無限增殖、具有遷移和侵襲能力等的實驗設計可以激發學生的學習興趣和積極性，建立基礎醫學與臨床醫學之間的聯系。宮頸癌是女性第4 大常見癌癥，高危人類乳頭狀瘤病毒（HPV）的持續性感染是子宮頸癌的主要危險因素，其中HPV16 和HPV18 約占所有宮頸癌病例的90%。感染這兩種高危型的女性比感染低風險HPV 型的女性更有可能發展為侵襲性癌癥［12］。不管低危還是高危型，所有HPV均感染上皮細胞并使其永生［13］。上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是細胞失去其上皮特征（細胞連接）而獲得間充質特性（運動性增強等）的過程。EMT 賦予癌細胞轉移（遷移、侵襲）特性，而轉移是宮頸癌患者的最常見的死亡原因［14］。鑒于EMT在腫瘤進展、轉移和耐藥性中的重要作用，EMT 可作為一些癌癥的預后指標和治療靶點［15］。因此本教學團隊以不同HPV感染的子宮頸癌細胞系SiHa（HPV16）、Hela（HPV18）、C33A（HPV 陰性）、Ca Ski（HPV16，18 共感染）和對照細胞系人宮頸永生化鱗狀細胞Ect1／E6E7 為實驗材料，提供多種與EMT 相關的小分子抑制劑如TGF-b 通路抑制劑RepSox等，以細胞培養為基礎，開展細胞增殖、細胞周期、細胞運動等實驗技術的訓練和科學創新思維和能力的培養（見圖1）。實驗內容包括細胞復蘇、傳代培養、細胞鋪板、細胞增殖檢測（Edu 染色法）、細胞周期檢測（PI染色法+流式）、細胞遷移實驗（劃痕法）、細胞侵襲實驗（transwell 小室法）和免疫熒光共8 個實驗。其中前3 個實驗必做，保證學生學會細胞培養基本操作，后5 個實驗由學生自主選做。學生根據課前文獻查閱和小組討論選擇想要研究的細胞模型、抑制劑，設計實驗方案，研究不同抑制劑對不同HPV 感染的子宮頸癌細胞增殖、遷移的影響。實驗授課分小組開展，每組4 人，由1 位老師帶教，授課2 次，每次6學時。

圖1 腫瘤細胞生物學實驗設計

1.2 實驗實施過程

本研究于2020 年秋季學期在口腔專業二年級56名學生的生命科學綜合實驗中進行。開課前告知學生實驗改革目的、驗證性實驗和探索性實驗的異同，以及后續實驗數據的收集和分析，獲得了學生的知情同意。本著以學生為本的原則，通過問卷星平臺由學生自主選擇參加對照班（原有的光學顯微鏡的使用和細胞融合實驗）或實驗班（腫瘤細胞生物學實驗，其余實驗與對照班相同）。

（1）課前。①分組：選擇實驗班的學生自由組合，4人1組。②線上資源學習：提前1周將實驗所涉及技術的講解及操作視頻（無菌操作、細胞復蘇、傳代、凍存、細胞增殖檢測、腫瘤細胞遷移和侵襲功能檢測、免疫熒光染色等）以及課程提供的細胞系名稱和小分子發布在學銀在線網絡教學平臺。同時，在線上討論區提出臨床現實問題（腫瘤的發生率、死亡率；腫瘤的類型；不同基因突變造成的腫瘤（比如宮頸癌）的治療方案的選擇；腫瘤發生及轉移背后的細胞分子機制等；腫瘤（如子宮頸癌）的預防和治療），由學生查閱文獻、在討論區互相討論，根據視頻所學設計實驗，并以小組寫出實驗原理、實驗材料和實驗步驟，老師確認實驗方案。

（2）課中。以腫瘤細胞增殖和遷移檢測為例的實驗具體安排如表1 所示。①第1 次課：腫瘤細胞生物學I。實驗內容包括細胞復蘇、傳代、鋪板（用于第2次課增殖和遷移實驗），或細胞爬片（用于第2 次課細胞骨架分布檢測）等。實驗室為學生準備5 種細胞系，1 株人宮頸對照細胞系，4 株人宮頸癌細胞系。每組學生根據課前文獻查閱和小組討論選擇適當細胞系進行復蘇。用不同的細胞系可以提高學生的興趣，增加學生的主觀能動性。第2 天中午換液；第4 天進行細胞消化、計數、鋪板、傳代；第5 天確定對照組和實驗組，在實驗組中加入小分子。②第2 次課：腫瘤細胞生物學II。以學生檢測腫瘤細胞的增殖和遷移為例。課前1 天：在自己小組鋪好的細胞板上利用槍頭劃出十字型痕跡（用于第2 天遷移實驗檢測），用PBS（磷酸緩沖鹽溶液）清洗兩次，加入無血清培養基及小分子藥物，拍照記錄。課程當天，顯微鏡觀察不同細胞劃痕邊緣相對距離（即遷移能力）；在另一塊細胞板上加入5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（Edu），2 h 后，熒光顯微鏡觀察對照組和實驗組中細胞的增殖。

表1 腫瘤細胞生物學實驗安排（以腫瘤細胞增殖和遷移檢測為例）

在每次課之間的時間，實驗室開放供學生前來進行細胞觀察、換液等操作。

（3）課后。①結果分析與討論，每組學生對實驗結果、實驗過程中遇到的問題進行分析討論，找出實驗成功或失敗的原因。②每組學生撰寫實驗報告，內容包括實驗原理、實驗結果，對實驗結果進行合理的分析并得出結論，對實驗中遇到的難點、疑點進行歸納、整理、分析和總結。

2 實驗效果評價的指標

采用3 個指標——學生實驗結果；實驗前后學生對實驗的主觀感受；期末考試成績來評價實驗改革的效果。

2.1 學生實驗結果

獲得陽性實驗結果、達成教學目標是本實驗項目重要判斷原則。本實驗的教學目的是要求學生通過實驗掌握基本的細胞培養技術包括細胞復蘇、細胞計數和細胞傳代培養，同時能熟悉腫瘤研究常用的實驗技術原理及操作，包括細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、免疫熒光染色等實驗，并能融會貫通所學理論知識（細胞骨架、細胞運動、細胞連接、細胞增殖與周期），分析實驗結果，獲得實驗結論。

2.2 學生主觀感受評價

通過問卷星向學生發布兩份調查問卷，1 份在課前課后針對所有學生發放，問卷問題針對實驗效果、實驗內容和實驗方式。第2 份調查問卷僅向實驗班同學發放，問題針對腫瘤細胞生物學實驗，包括13 個封閉性問題，從三個維度進行評估：學習效果（8 個問題，如“實驗具有挑戰性”“提高相關知識點的理解”）；實驗滿意度（3 個問題，如“實驗內容及信息量合適”）；團隊表現（2 個問題，如“所有團隊成員都努力參與實驗相關事宜”）以及1 個開放性問題，要求學生列出2 個最能描述他們對實驗的形容詞。所有封閉式問題的回答都使用Likert scale5 分量表（從非常同意＝5 到非常不同意＝1）。問卷的設計參考Thompson 及其同事設計的一份經過驗證的用于衡量醫學教育團隊質量的問卷［16］。

2.3 期末考試成績

比較了所有學生的期末考試成績。考慮到學生學習能力和習慣等不同，同一種教學方式對不同學生的教學效果可能不同，因此，對平均績點（Grade Point Average，GPA）大于等于4.5，大于等于4 且小于4.5，小于4 的學生的期末考試成績進行單獨的對照組和實驗組比較（見表2）。期末考試試卷由50 道客觀試題（A1 和A2 試題各占一半）和5 道案例分析題組成。A2 和案例分析題側重考試學生對知識的綜合應用能力。

2.4 統計學分析

所有統計分析均采用GraphPad Prism 6 進行。對分類資料進行卡方檢驗。數據用“Mean ±SEM”表示，實驗組和對照組之間的統計比較采用方差分析（ANOVA）或學生t檢驗。P＜0.05 為有統計學差異。

3 實驗效果評價的結果

3.1 學生分組結果

根據學生自主選擇，本實驗分為對照組和實驗組。對照組有28 人，上一年度GPA 為4.257 ±0.067 72；實驗組28 人，上一年度GPA為4.021 ±0.099 94。兩組間GPA成績差異及分布無統計學意義（P＞0.05）。表2 顯示了56 名參與者的GPA情況。

表2 對照組與實驗組學生的GPA分布情況

3.2 學生實驗結果

所有學生都能成功復蘇細胞、進行細胞傳代，沒有發生細菌等污染，獲得了相應的實驗結果。在遷移實驗中，學生發現和對照組相比，RepSox 可抑制細胞的遷移（見圖2）。通過Edu 摻入實驗，發現與對照組相比，癌細胞系C33A細胞增殖更多（見圖3）。

圖2 細胞遷移實驗

圖3 細胞增殖實驗

3.3 學生評價

針對所有學生的問卷調查結果顯示，實驗課程完成后，所有學生對所有問題的評分都較課前更為積極（見表3）。在學習效果方面，對照組和實驗組在課程完成后，對腫瘤知識的了解程度都比課前有顯著性提高，且實驗組比對照組更高。在實驗內容和實驗教學方式方面，盡管對照組在課程后的評分更高，但差異均無統計學意義；而在實驗組中，課后在對探索性實驗、科研聯系的實驗內容、臨床聯系的實驗內容和半自主性實驗設計方面的評分顯著增高，而在傳統驗證性實驗、傳統授課方式方面則沒有顯著差異。

表3 實驗完成前后對照組和實驗組的問卷調查結果比較

實驗組學生有關“腫瘤細胞生物學”實驗的封閉性問題的評價如圖4 所示。整體而言，學生對本次教學改革是認可的，100%的學生非常同意或同意“實驗內容及信息量合適”“能夠激發學習興趣”；88%的學生非常同意或同意“實驗具有挑戰性”；90%以上的學生認為本實驗項目能促進其思考、提高其對相關知識點的理解、提升其綜合運用知識的能力，實現知識內化，培養了其科學素養。在團隊合作評價方面，88%的學生同意“所有團隊成員都努力參與實驗”，96%的學生同意“團隊成員互相鼓勵，表達自己的觀點和想法”。如圖5 所示，在開放性問題描述對實驗直觀感受時，最常用的詞是“有趣”“實用”和“挑戰性”等。

圖4 實驗組學生對有關腫瘤細胞生物學實驗的評價（n ＝25）

圖5 學生在回答開放性問題時的詞云圖

3.4 期末考試成績分析

對照組和實驗組學生的期末考試平均成績（分別為61.85 ±2.074 和57.05 ±3.411）差異無統計學意義（P＝0.216 3）。然而，在先前課程的GPA大于等于4.5 的實驗組學生的期末考試平均成績（79.50 ±3.182）顯著高于對照組學生（66.43 ± 2.240，P＝0.007 5）。但是在GPA 小于4.5 的學生中，期末考試平均成績在兩組中沒有顯著差異（見圖6）。

圖6 不同績點學生的期末考試成績比較（**P ＜0.01）

4 討論

通過腫瘤細胞生物學探索性實驗，使學生可以掌握多種實驗技術，并提高理論課堂的教學質量。通過一個實驗使學生能夠掌握并將孤立的實驗技術有機地整合，將多個知識點相聯系，引導深度學習（deep learning），提高理論知識的學習效果。比如在改革后的腫瘤細胞生物學實驗中，細胞傳代涉及細胞膜、細胞粘附分子、細胞連接；細胞遷移實驗涉及細胞骨架、細胞運動；細胞增殖涉及細胞核、細胞周期，通過實驗可以讓學生將這些知識點應用起來，實現知識內化；同時也掌握了當今科研中常用的技術與設備使用，包括細胞培養、細胞增殖檢測、流式細胞儀檢測細胞周期、熒光染色等實驗技術和流式細胞儀、熒光顯微鏡的原理和使用等。此外，通過該實驗也強化了大健康理念。

學生實驗結果顯示100%的學生培養出了無污染的細胞，說明學生掌握了無菌操作技術；同時，學生設置對照組研究小分子對腫瘤細胞遷移的影響、不同細胞增殖能力等，通過對實驗結果的分析，得出小分子抑制腫瘤細胞遷移的結論，相對于對照細胞系，腫瘤細胞具有更強的增殖能力等，初步培養了學生的科研能力。

腫瘤細胞生物學探索性實驗是以臨床實際問題出發，建立基礎醫學與臨床醫學之間的聯系，增加學生的學習興趣，使學生學有所用，增加其醫生的職業使命感，提高學生利用基礎醫學知識解決臨床問題的能力。通過小組形式由學生半自主設計實施實驗，充分發揮主觀能動性，提高學生對實驗課的學習興趣；小組成員之間相互討論、合作、學習、監督完成整個實驗活動，增進學生之間的交流與合作，有助于學生深刻理解實驗原理和操作步驟，發現新問題，解決新問題，提高學生實驗積極性，培養他們的探索精神，進而培養學生的創新思維及科研能力，為開展后續的科研項目和畢業論文設計奠定基礎。與對照組學生相比，實驗班學生對實驗評價更為積極。學生問卷調查結果顯示，整體而言，學生對腫瘤細胞生物學探索性實驗是認可的，認為該實驗項目能激發其學習興趣，促進思考，提高對相關知識點的理解。詞云圖也顯示，實驗組學生認為該實驗有趣、具有探索性。然而，客觀的期末考試成績，兩組學生并無顯著性差別，進一步分析發現，績點大于4.5 的學生中，實驗組成績顯著高于對照組，而小于4.5 的學生之間沒有差異，提示探索性實驗對學習成績較好的學生益處更大，可能與優秀學生本身更多的參與實驗的設計和思考有關。

與大多數研究采用隨機分組的研究方式不同，本研究希望能真正發揮學生的主動性去進行學習，因此采用學生自主選擇是否參與的方式決定了實驗組和對照組。結果顯示，只有一半人想參加探索性實驗，提示對今后的教學是否應該多提供一些實驗條件，供學生選擇？盡管兩組學生績點沒有統計學上的顯著性差異，且實驗組平均績點略低于對照組，是否意味著成績好的學生相對更保守？有意思的是，期末考試平均成績提示本探索性實驗特別有利于學習成績較好的學生，這可能是因為優秀學生更容易成為小組指揮者，更多的探索性實驗也許可以讓小組學生輪流成為指揮者，充分發揮探索性實驗對學生的能力培養。

5 結語

本探索性實驗以臨床現實問題出發，將腫瘤細胞生物學特性納入實驗教學中，使學生產生研究興趣；設計半自主性探索性實驗，與理論課內容匹配，體現出分子-細胞器-細胞3 個層面的研究，引導學生對所學知識進行融會貫通，理論與實踐相結合，提高學生的科研創新思維和綜合實驗能力。學生實驗結果和主觀評價表明，該實驗設計是可行的、有吸引力的、創新性的實驗，對于培養學生的科研思維、促進知識內化、提高學生的實驗能力具有顯著的作用。