燕麥孢囊線蟲生防真菌TL16發酵條件優化

李軍平，盧智琴，羅寧，倪春輝，李惠霞

（甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

燕麥是世界各地廣泛種植的一種糧食、飼草和飼料兼用作物，屬一年生禾本科，具有很高的營養價值和一定的保健作用［1］。近年來，燕麥的產量和品質因各種病害的發生受到了嚴重的影響，其中由燕麥孢囊線蟲引起的孢囊線蟲病是新發現的一種病害。其病原為燕麥孢囊線蟲（Heterodera avenae），又名禾谷孢囊線蟲，屬于墊刃亞目（Tylenchina）異皮科（Heterode‐ridae）孢囊線蟲屬（Heterodera），主要為害小麥、燕麥、大麥、黑麥等多種禾谷類作物和牧草［2-4］，因最初在燕麥上發現而命名為燕麥孢囊線蟲。目前該線蟲已在世界5大洲40多個國家發生危害［5-7］，造成小麥產量損失23%~50%，嚴重時達73%~89%［8］。在我國16個省、自治區、直轄市的小麥田，均有燕麥孢囊線蟲為害，可造成高達35%的產量損失［9］。甘肅和寧夏燕麥發病率分別為 68.7%［10］和 47.6%［11］。近年來，該病害在連作田的發生呈逐年加重趨勢，給小麥和燕麥生產造成重大威脅。

孢囊線蟲病屬于典型的土傳病害，一旦傳入，很難防治。目前，對燕麥孢囊線蟲病的防治，主要采取利用抗病品種、輪作、化學藥劑防治和種衣劑包衣等措施。我國現有小麥品種多為中度感病品種［12］，抗性材料缺乏。在一些地區，輪作等農業防治措施實施困難，生產中仍以化學防治為主。然而長期使用化學農藥容易造成農藥殘留和環境污染，且植株易產生抗藥性等。而生物防治對自然生態環境安全、無污染，能參與生態環境的調控，有利于保持生態平衡，使農田環境保持良性循環［13-14］。因此，利用微生物及其衍生物防治小麥孢囊線蟲已成為目前的研究熱點。

木霉菌（Trichodermaspp.）作為一種具有重要開發價值的生防因子，正逐漸被挖掘和利用［15］，目前已經成功應用于多種植物真菌及線蟲病害的生物防治［16-18］。其中，張樹武等［17］報道長枝木霉（Tricho?derma longibrachiatum）對燕麥孢囊線蟲有較好的防治效果，李瑞等［19］報道長枝木霉菌株對南方根結線蟲有較好的防治效果。本研究擬對長枝木霉菌株TL16固體發酵條件進行優化，以期推動燕麥孢囊線蟲生物防治技術的應用。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：長枝木霉菌株TL16，由甘肅農業大學植物保護學院植物線蟲學實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化和孢子懸浮液的制備 菌株TL16在 PDA培養基上，25 ℃下培養 7 d，加 1滴 Tween‐80和2 mL無菌水，搖勻后制取分生孢子懸浮液，將其濃度調整為5.0×107cfu/mL。

1.2.2 固體培養 將固體發酵培養基（固水比為1∶1）裝入培養皿（d=9 mm），約15 g/皿，加入1 mL懸浮液，28 ℃黑暗培養7 d，3次重復。

1.2.3 產孢量的測定 在無菌條件下準確稱取1 g帶菌的培養基，在研缽中充分研磨，加99 mL水和一滴吐溫80。攪拌后，振蕩混勻用血球計數板統計孢子數，每處理重復3次，取其平均值。

產孢量（cfu/g）=80小方格內孢子個數/80×400×10 000×稀釋倍數

1.2.4 固體發酵基質篩選 1） 單一基質篩選 以玉米秸稈粉、玉米芯、玉米粉、麥麩、花生殼和大豆秸稈等6種為單一基質進行固體發酵。然后選擇產孢量高的3種基質，正交組合后進行下一步試驗。

2）正交試驗優化 采用正交試驗因素水平（表1），將篩選出來的3種基質根據不同質量設置3個水平，設9個處理，根據孢子產生量選擇較好的單一培養基質。

表1 正交試驗L9（33）因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test L9（33）

1.2.5 碳源、氮源和無機鹽的篩選 1） 碳源篩選在培養基質中，分別添加4%的乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖，測定菌株TL16產孢量。

2） 氮源篩選 在培養基質中，分別添加4%的尿素、蛋白胨、硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏和硫酸銨，測定菌株TL16產孢量。

3） 無機鹽篩選 在培養基質中，分別添加4%的氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、硫酸銅和硫酸錳，測定菌株TL16產孢量。

運用正交試驗，對不同添加量碳源、氮源和無機鹽進行篩選，確定適宜于菌株TL16產孢的最佳組合。

1.2.5 固體發酵條件的優化 1） 溫度 參照郭成等的方法［20］，根據 1.2.4試驗結果，將發酵溫度設 22、24、26、28、30、32、34和 36 ℃等 8個溫度梯度，黑暗培養7 d，3次重復，篩選適宜菌株TL16產孢的最佳培養溫度。

2） 含水量 上述試驗條件下，將固體培養基與水的比例設為 1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4和1∶1.6等7個處理，3次重復，其他培養及檢測方法同上，篩選適宜菌株TL16產孢的最佳培養基含水量。

3） 接種量 在上述試驗條件下，將接種量設為固料的1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%等7個處理，重復3次。其他培養及檢測方法同上，篩選適宜菌株TL16產孢的最佳接種量。

4） 發酵時間 上述試驗條件下，在接種后4、5、6、7、8、9、10和 11 d，進行測定產孢量，確定菌株最佳發酵時間。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌株TL16產孢量的影響

菌株TL16在玉米粉、玉米秸稈粉、麥麩和花生殼基質上產孢量比較高。其中在麥麩上產孢量最高，為20.07×108cfu/g，且與其它處理差異顯著（P<0.05）（圖1）。因此，玉米粉、玉米秸稈粉、麥麩和花生殼基質4種基質確定為菌株TL16固體發酵的基礎培養基。

圖1 單一基質上菌株TL16的固體發酵產孢量Fig.1 Sporulation of strain TL16 in single matrix by solidstate fermentation

菌株TL16在麥麩+玉米粉固體培養基上產孢量最多，為8.93×109cfu/g，麥麩+玉米秸稈次之，產孢量為8.44×109cfu/g，且2個組合間無顯著差異（P<0.05）。玉米秸稈+花生殼產孢量最少，與麥麩+玉米秸稈和麥麩+玉米粉組合產孢量有顯著差異（P<0.05）（圖2）。因此，培養菌株TL16的最佳組合是麥麩+玉米粉和麥麩+玉米秸稈。

圖2 組合固體基質上菌株TL16的固體發酵產孢量Fig.2 Sporulation of strain TL16 in combined matrixes by solid-state fermentation

在總物料相等的條件下，培養7 d，菌株TL16在復合基質上的產孢量較單一基質均有不同程度的提升。根據R值，菌株TL16產孢量由多到少依次為麥麩、玉米粉和玉米秸稈，最佳發酵條件為A3B1C2，各組分含量分別為麥麩3 g、玉米粉1 g和玉米秸稈2 g，此時產孢量最多，為 10.64×109cfu/g（表2）。因此，菌株L16固體發酵培養基最佳配方組合為A3B1C2，即麥麩、玉米粉、玉米秸稈配比是3∶1∶2。

表2 復合基質上菌株TL16的固體發酵產孢量Tab.2 Sporulation of TL16 in different composite sub?strates by solid-state fermentation

2.2 不同碳源、氮源和無機鹽固體發酵對產孢量的影響

菌株TL16在不同培養基上均能產孢，其中，以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源和硫酸錳為無機鹽的培養基上 產 孢 量 最 高 ，分 別 為 1.29×1010、1.58×1010和1.34×1010cfu/g，且均顯著高于其它碳源、氮源和無機鹽（表3）。因此，將乳糖、蛋白胨和硫酸錳確定為菌株TL16最適碳源、氮源和無機鹽。

表3 不同碳源、氮源以及無機鹽下的TL16固體發酵產孢量Tab.3 Sporulation of strain TL16 under carbon，nitrogen sources and inorganic salts by solid-state fermentation

當乳糖、蛋白胨和硫酸錳的添加量均為4%時，菌株產孢量最高，且與其他處理差異顯著（P<0.05）（表4）。因此，將乳糖、蛋白胨及硫酸錳的添加量均確定為4%。

表4 菌株TL16固體發酵最佳碳源、氮源和無機鹽添加量的篩選Tab.4 Screening of optimum carbon，nitrogen and inorganic salt additions for solid-state fermentation of strain TL16

正交試驗結果表明，碳源、氮源和無機鹽添對菌株TL16產孢量影響由高到低依次為：無機鹽>碳源>氮源（表5）。經配比組合，TL16菌株在處理8（A1B2C3）中的產孢量最大，為1.59×1010cfu/g，即2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸錳配比為產孢最佳的培養基組合。

表5 菌株TL16固體發酵最佳碳源、氮源以及無機鹽最優組合的篩選Tab.5 Screening of the best combination of optimal carbon source，nitrogen source and inorganic saltfor for solid-state fermentation of strain TL16

2.3 菌株TL16固體發酵條件優化

2.3.1 溫度對菌株TL16產孢量的影響 在22～36 ℃，菌株TL16均能產孢，28 ℃時產孢量最大，為1.68×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P<0.05）（圖3）。因此，將菌株TL16最佳發酵溫度確定為28 ℃。

圖3 不同溫度下菌株TL16的固體發酵產孢量Fig.3 Sporulation of strain TL16 under different tempera?tures by solid-state fermentation

2.3.2 含水量對菌株TL16產孢量的影響 菌株TL16在含水量不同的培養基上均能產孢，當固料∶水為 1∶1時，產孢量最大，為 1.60×1010cfu/g，且顯著高于其他條件下的產孢量（P<0.05）（圖4）。因此，菌株TL16最佳的固料∶水為1∶1。

圖4 不同含水量下菌株TL16的固體發酵產孢量Fig.4 Sporulation of strain TL16 in different water content matrixes by solid-state fermentation

2.3.3 接種量對菌株TL16產孢量的影響 菌株TL16在接種量為15%、20%和25%時，產孢量比其他處理大，且差異顯著（P<0.05），但三者之間不顯著（P>0.05）（圖5）。綜合分析，將菌株TL16最佳接種量確定為15%。

圖5 不同接種量下菌株TL16的固體發酵產孢量Fig.5 Sporulation of strain TL16 under different inoculum size by solid-state fermentation

2.3.4 發酵時間對菌株TL16產孢量的影響 菌株TL16第8天產孢量最佳，且與其他時段的產孢量差異顯著（P<0.05）（圖6），因此將菌株 TL16最佳發酵時間確定為8 d。

圖6 不同發酵時間下TL16的固體發酵產孢量Fig.6 Sporulation of strain TL16 under different time by solid-state fermentation

3 討論

利用生防真菌固體發酵物防治植物病害具有明顯的優越性，因其成本低廉、操作簡單、發酵產品便于運輸和儲存，因而被人們廣泛使用［21］。羅洋等［22］發現木霉FS10‐C的最佳發酵基質為桔皮麥麩混合物，最佳發酵條件桔皮∶麥麩=1∶1，固水比 1∶1.2，接種量5%，28 ℃，發酵 11 d，產孢高達 2.13×1010cfu/g。魯海菊等［23］研究表明深綠木霉P3.9生防菌株在最佳固體發酵基質和最佳培養條件下培養后產孢量最高達7.5×109cfu/g。朱海霞等［24］研究表明，在小麥粉和（NH4）2SO4作為碳源和氮源條件下固態發酵，生防菌株多孢木霉HZ‐31產孢量最多，達4.45×109cfu/mL，其產孢量是無碳、氮源的7.21倍。郝春英等［25］發現，生防鏈霉菌Men‐myco‐93‐63固體發酵基質為大米∶高粱∶米糠∶稻殼=2∶2∶3∶3（w/w），初始水料比為1.7∶1.0（v/w，不計稻殼質量），pH值6.2，固料添加量為30 g/L，接種量為7 mL，培養溫度為28 ℃，發酵10 d時產孢量最大。以上研究結果表明，不同菌株固體發酵時，對基質、碳源、氮源、無機鹽、溫度和接種量等條件有不同的需求，因此，探尋適宜菌株自身生長的培養基和固體發酵條件很有必要。

本研究對菌株TL16固體發酵基質進行了篩選，發現當添加麥麩3 g、玉米粉1 g和玉米秸稈2 g，即麥麩：玉米粉：玉米秸稈粉為3∶1∶2時產孢量最多，為1.06×1010cfu/g。同時，對該菌株營養物質添加量進行篩選，發現菌株TL16發酵所需碳源、氮源和無機鹽的配比為2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸錳，產孢量最大為1.59×1010cfu/g。另外對發酵條件優化篩選發現，TL16菌株在最適條件下產孢量達到最大2.48×1010cfu/g。與景芳［26］、盧智琴［27］和羅洋［22］、魯海菊［23］等研究結果相比較，基質配比相對復雜，但對菌株生長有利，用量少，且菌株產孢量高，所需的培養時間短。對于菌株TL16批量生產，上述發酵參數成本低且產出高，具有較大的應用潛力。目前，本試驗只探討了培養基組成，碳源、氮源、無機鹽等在實驗室小規模發酵對產孢量的影響，生產化的大規模發酵，及發酵物貯存期、貨架期和有效期等試驗尚未完成。菌株TL16進一步規模化生產和使用，除解決上述問題外，還需要評價田間施用效果、生防菌田間定殖特性和環境安全性等參數。

4 結論

菌株TL16最佳培養基基質為麥麩∶玉米粉∶玉米秸稈粉重量比為3∶1∶2，碳源、氮源和無機鹽類型及添加量分別為乳糖2%、蛋白胨4%、硫酸錳4%，初始固料∶水為1∶1，發酵溫度為28 ℃，接種量為15%，黑暗條件下發酵8 d。