NaCl脅迫對甘肅省不同地區鹽生草種子萌發特性的影響

張澤華 ，許靜玉 ，宋美妮 ，薛振宇 ，馬蕊 ，馬臻 ，王子騫 ，汪軍成 ，2，姚立蓉 ，2*

（1.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質創新實重點驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

近年來，隨著我國經濟快速發展，人類活動對生態環境的影響越來越大，在一定程度上加劇了我國的土壤鹽堿化程度，加快了土地荒漠化進程，對我國經濟的可持續增長造成了嚴重阻礙［1］。據聯合國教科文組織和糧農組織（FAO）的不完全統計，我國的鹽堿地總面積高達9 913萬hm2，主要分為現代鹽堿土、殘余鹽堿土和潛在鹽堿土3種類型，面積分別約為3 700、4 500 和 1 700 萬 hm2，約占我國土地面積的 25%［2］。它們主要分布于我國的北方地區以及長江以北的沿海地帶［3］，涵蓋了甘肅河西走廊、新疆、內蒙、柴達木盆地、黃淮海平原、汾渭河谷平原、東北平原西部以及濱海等地［3-4］，因此改良鹽堿地以及綠化鹽堿地刻不容緩。

耐鹽性鹽生草（Halogeton glomeratus）屬藜科（Chenopodiaceae）鹽生草屬（Halophyte），為一年生草本植物，主要分布于我國甘肅、新疆、青海及西藏等多個省份，具有較強的耐鹽抗旱性，適宜在含鹽量高的地區生長，是我國西北地區最常見的鹽生植物之一。目前我國鹽堿地改良措施主要有種植耐鹽、排鹽植物、添加化學改良劑、增施有機肥以及暗管排水等。其中，選用耐鹽植物改良鹽堿地受到廣泛關注。運用耐鹽植物改良鹽堿地具有投入成本低、操作簡便、適用范圍廣、成效顯著、經濟效益高的特點［5］。因此，選取鹽生草作為鹽堿地改良的材料是最經濟有效的措施之一。

種子萌發階段是植物生活史中最為關鍵的階段，這個時期植物對外界環境的變化特別敏感［6］。當NaCl濃度超過100 mmol/L時，白花草木樨、香豌豆、白蠟、杜梨等8種鹽生植物種子的萌發均受到不同程度的抑制［7］。另外有研究表明，高鹽和低鹽都會對鹽生草根系的生長產生影響［8］，選取100 mmol/L NaCl對鹽生草種子萌發期進行模擬脅迫，研究其萌發特性已有報道［9-10］。目前，有關鹽脅迫對鹽生植物種子萌發特性分析的研究中，對于單鹽脅迫下不同地區鹽生草的研究鮮有報道。鑒于此，本團隊選取我國西北地區特色耐鹽植物鹽生草作為實驗材料，對采自17個地區的鹽生草種子進行100 mmol/L NaCl處理，通過對比各地區種子萌發特性指標，篩選同期處理中生長狀況最好的鹽生草種子，從而為鹽生草種質資源多樣性的鑒定，種質創新和利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗鹽生草種子由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室麥類遺傳育種實驗室提供，2019年11月采集于甘肅省不同地區（表1）。

表1 各地區的地理位置及氣候條件Table 1 Geographic location and climatic conditions of each region

1.2 試驗試劑

試驗試劑：氯化鈉固體（NaCl），75%乙醇，次氯酸鈉溶液（NaClO，有效氯≥8%），100 mmol/L的磷酸（H3PO4）緩沖液（pH值=7），2，3，5‐三苯基四唑氯化物（2，3，5‐Triphenyte‐trazolium chloride，TTC）。

試驗儀器：培養皿、玻璃棒、濾紙、鑷子、燒杯、藥匙、電子天平、離心管、研缽、容量瓶、移液槍、烘箱、分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子消毒 選取均勻一致且飽滿的鹽生草種子放于2 mL離心管中，向其中加入75%的乙醇震蕩30 s，加入蒸餾水進行沖洗，重復3次，加入2%的NaClO溶液處理1.5 min，用蒸餾水沖洗4次，最后用濾紙將種子表面的水分吸干，待用［10］。

1.3.2 種子萌發試驗 玻璃培養皿內放置兩層濾紙，高溫滅菌，作為種子的發芽床，吸取5 mL濃度為100 mmol/L的NaCl溶液均勻滴入培養皿中，使用消過毒的鑷子分撿經過消毒的鹽生草種子，使其分布均勻。每個培養皿種植50 粒鹽生草種子，每個處理設置5個重復，以蒸餾水處理作為對照，封口膜封口。將所有的培養皿置于溫度為28 ℃的培養箱，光照條件為光照/黑暗（14 h/10 h），光強為 2000 Lx，相對濕度為48%~60%的環境下進行培養［9］。

1.3.3 發芽指標測定 以胚根突破表皮1 mm作為發芽標準，第3天測發芽勢，第7天測發芽率。計算公式如下：

發芽勢（%）=（3 d內種子發芽數/供試種子數）×100%

發芽率（%）=（7 d內種子發芽數/供試種子數）×100%

相對發芽勢（%）=（鹽處理的發芽勢/對照的發芽勢）×100%

相對發芽率（%）=（鹽處理的發芽率/對照的發芽率）×100%

1.3.4 株高測量 生長7 d后，每個培養皿隨機選取10株幼苗，用WinRHIZO圖像掃描儀測量幼苗株高，取平均值作為株高標準，計算相對株高。公式如下：

相對株高（%）=（鹽處理的株高/對照的株高）×100%

1.3.5 生物量測定 每個培養皿隨機選取生長7 d的10株幼苗，將幼苗置于蒸餾水中漂洗數秒，除去幼苗表面多余的離子，將幼苗放于干凈的定性濾紙上，吸干水分后測量鮮重，然后將幼苗裝進信封袋，放入烘箱中，60 ℃烘60 h后測量干重。用分析天平測量鮮重和干重，并計算其相對鮮和相對干重，公式如下：

相對鮮重（%）=（鹽處理的鮮重/對照的鮮重）×100%

相對干重（%）=（鹽處理的干重/對照的干重）×100%

1.3.6 離子含量（IC）測定 將烘干的材料研磨至粉末，裝入PCR管，采用原子吸收分光光度法測定Na+、K+離子含量。

1.3.7 根系活力（RA）測定 用TTC還原測定法［11］測定幼苗根系活力。

相對根系活力=（鹽處理的干重/對照的干重）×100%

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2010進行數據的處理以及圖表的繪制，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析、相關性分析、聚類分析等各種指標分析，并采用Duncan's多重比較（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對不同地區鹽生草種子萌發指標的影響

100 mmol/L NaCl處理之后，鹽生草種子發芽率和發芽勢的相對值均小于1，表明發芽勢和發芽率在鹽脅迫下較CK均降低（表2）。從相對發芽勢來看，12號（民勤縣重興鄉）、14號（張掖市甘州區）和15號（蘭州新區）地區較高，分別為77.51%、77.99%和79.16%，16號（張掖市臨澤縣）地區最低，為9.67%；從相對發芽率來看，有12個地區種子的相對發芽率大于80%，其中13號（白銀市會寧縣）、12號（民勤縣重興鄉）和15號（蘭州新區）地區較高，分別為86.54%、88.20%和91.92%，7號（白銀市景泰縣）地區最低，為63.93%（表2）。

表2 鹽脅迫下不同地區鹽生草種子的發芽指標Table 2 Seed germination indexes of H.glomeratus in differ?ent regions under salt stress

2.2 鹽脅迫對不同地區鹽生草幼苗相對株高的影響

在鹽脅迫下不同地區鹽生草幼苗的株高差異不明顯，與對照相比，有6個地區鹽生草的株高增大，分別是3號（酒泉市肅州區）、4號（金昌市金川區）、6號（金昌市永昌縣）、9號（民勤縣收成鄉）、10號（張掖市高臺縣）地區的鹽生草品種，較對照分別增大了0.19%、3.75%、1.13%、6.63%、4.56%、4.33%。株高低于對照92%的品種有4個，分別是11號（白銀市靖遠縣）、12號（民勤縣重興鄉）、15號（蘭州新區）、17號（張掖市民樂縣）地區鹽生草品種，分別降低了9.47%、9.63%、9.26%、17.65%（圖1）。表明鹽脅迫對不同地區幼苗的生長既有促進作用，又有抑制作用，其中17號（張掖市民樂縣）地區鹽生草的株高受到的抑制作用最明顯。

圖1 各地區鹽生草的相對株高Fig.1 The relative plant height of H.glomeratus in different regions

2.3 鹽脅迫對不同地區鹽生草幼苗相對鮮重和干重的影響

甘肅省不同地區鹽生草幼苗相對鮮重差異較大，其中4號（金昌市金川區）、5號（武威市涼州區）、6號（金昌市永昌縣）、7號（白銀市景泰縣）、8號（蘭州市沙井驛）、10號（張掖市高臺縣）、11號（白銀市靖遠縣）、12號（民勤縣重興鄉）、15號（蘭州新區）和16號（張掖市臨澤縣）地區的鹽生草幼苗的相對鮮重較高，分別為 204.37%、162.07%、207.93%、146.62%、116.25%、159.87%、129.18%、103.60%、103.06%和100.27%；1號（白銀市平川區）、2號（張掖市山丹縣）、3號（酒泉市蘇州區）、9號（民勤縣收成鄉）、13號（白銀市會寧縣）、14號（張掖市甘州區）、17號（張掖市民樂縣）地區的鹽生草幼苗相對鮮重無顯著性差異，17號（張掖市民樂縣）地區的鹽生草幼苗相對鮮重最低，僅為對照鮮重的58.25%。經鹽脅迫后，各地區鹽生草幼苗的相對干重均大于1、11號（白銀市靖遠縣）地區的最高，相對干重為200.48 %，9號（民勤縣收成鄉）地區最低，為112.98%；2號（張掖市山丹縣）、3號（酒泉市蘇州區）、11號（白銀市靖遠縣）地區的鹽生草幼苗的干重遠高于對照的干重，分別為186.93%、179.39%和200.48%，與其他地區幼苗的相對干重具有顯著性差異（P<0.05）。1號（白銀市平川區）、9號（民勤縣收成鄉）、14號（張掖市甘州區）、16號（張掖市臨澤縣）地區的鹽生草相對干重與對照之間差距較小 ，分 別 為 127.49%、112.98%、123.09% 和133.61%，而且這些地區品種間無顯著性差異，其他地區品種間有顯著差異（P<0.05）（圖2）。

圖2 各地區鹽生草的相對鮮干重Fig.1 Relative fresh weight and relative dry weight of H.glomeratus in different regions

2.4 鹽脅迫對不同地區鹽生草幼苗離子含量的影響

17個地區鹽生草發芽率的3組重復數據中，把發芽率相近的2組的平均值作為依據，分別篩選出2個發芽狀況最好和最差的鹽生草種子，并測定幼苗的Na+、K+離子含量，選擇發芽率最高的2個地區6號（金昌市永昌縣）和15號（蘭州新區），最低的2個地區5號（武威市涼州區）和7號（白銀市景泰縣）的鹽生草幼苗，測定其Na+、K+離子含量。經鹽處理后，各地區的鹽生草幼苗Na+含量較CK明顯增高，6號（金昌市永昌縣）、15號（蘭州新區）地區鹽生草的相對Na+含量高于5號（武威市涼州區）和7號（白銀市景泰縣）地區，15號（蘭州新區）地區的最高，5號（武威市涼州區）地區的最低（圖3‐A，圖3‐C）；除7號（白銀市景泰縣）地區的鹽生草幼苗外，經鹽處理的鹽生草幼苗K+含量都比對照的含量低，5號（武威市涼州區）地區的相對K+含量最低，6號（金昌市永昌縣）和15號（蘭州新區）地區沒有明顯差別（圖3‐B，圖3‐C）；鹽脅迫處理之后的鹽生草幼苗K+/Na+比明顯低于對照組，6號（金昌市永昌縣）地區的最高，為0.13，5號（武威市涼州區）地區的最低，為 0.88（圖3‐D）。

圖3 Na+、K+含量及 K+/Na+Fig.3 Na+、K+ content and Relation content K+/Na+ ratio

2.5 鹽脅迫對不同地區鹽生草幼苗相對根系活力的影響

各地區鹽生草幼苗在相同處理的條件下，其根系活力之間有明顯差異，經過鹽處理后幼苗的根系活力均低于對照。7號（白銀市景泰縣）地區鹽生草幼苗的根系生長受到的影響最大，根系活力僅為對照的15.4 %，而6號（金昌市永昌縣）、8號（蘭州市沙井驛）、10號（張掖市高臺縣）、11號（白銀市靖遠縣）和15號（蘭州新區）地區品種的根系生長受影響較小，分別為83.52%、77.15%、83.69%、90.50%和82.23%，其中11號（白銀市靖遠縣）地區鹽生草幼苗受到的影響最小（圖4）。

圖4 各地區鹽生草的相對根系活力Fig.4 Root activity of H.glomeratus in different regions

2.6 各地區鹽生草種子萌發期性狀方差分析

鹽脅迫對17個地區鹽生草種子萌發期各指標測定值均有顯著影響，處理間和各地區鹽生草種子之間的差異均達到顯著水平（表3、附表1）。不同地區間材料的變異系數介于0.073~0.131，說明17個地區鹽生草種子具有較好的代表性，鹽脅迫處理效果好，所選指標對鹽脅迫反應較敏感。另外，17個地區鹽生草種子萌發期各指標在對照和鹽脅迫處理下的測定值相關系數在0.36~0.733，這進一步說明17個地區鹽生草種子萌發期各指標對鹽脅迫反應的敏感性存在差異，可繼續進行耐鹽種子的篩選和 鑒定［12］。

表3 不同地區鹽生草種子發芽期性狀指標的平均值差異分析Table 3 Mean values of germination indices of H.glomeratus seeds in different areas

2.7 各地區鹽生草種子發芽期各指標相關性分析

各項指標間呈現不同程度的相關性，相對發芽勢與相對發芽率、相對根系活力分別呈極顯著正相關（P<0.01）和顯著正相關（P<0.05）；相對發芽率與相對株高、相對鮮重、相對干重、相對根系活力分別呈正相關、正相關、負相關、極顯著正相關（P<0.01）；相對株高與相對鮮重呈顯著正相關（P<0.05）；相對鮮重與相對干重、相對根系活力呈負相關、正相關關系；相對干重與相對根系活力分別呈正相關關系（表4）。

表4 不同地區鹽生草各指標相對值的相關性分析Table 4 Correlation analysis of relative value of H.glomeratus in different areas

2.8 主成分分析、綜合聚類分析及地區分布

主成分分析能夠更好地反映鹽生草的耐鹽性，對鹽生草的6個耐鹽指標進行分析，其中相對發芽勢、相對發芽率、相對株高的累計貢獻率為72.40%，說明這3個主成分足以作為本實驗對鹽生草耐鹽性指標鑒定的標準（表5）。第Ⅰ主成分的貢獻率為32.93%，第Ⅱ主成分除了相對干重外，與其他指標都呈正相關關系（表6）。對各地區鹽生草種子各萌發指標進行聚類分析，在歐式距離約為22時將在鹽處理下各地區鹽生草種子分為三個類群，其中第Ⅰ類為11號（白銀市靖遠縣）、12號（民勤縣重興鄉）、13號（白銀市會寧縣）、14號（張掖市甘州區）、15號（蘭州新區）、17號（張掖市民樂縣）地區，鹽生草耐鹽性最強，第Ⅱ類為6號（金昌市永昌縣）、8號（蘭州市沙井驛）、9號（民勤縣收成鄉）、10號（張掖市高臺縣）、16號（張掖市臨澤縣）地區，鹽生草耐鹽性較強，第Ⅲ類為1號（白銀平川區）、2號（張掖市山丹縣）、3號（酒泉市肅州區）、4號（金昌市金川區）、5號（武威市涼州區）、7號（白銀市景泰縣）地區，鹽生草耐鹽性最弱（圖5）。采取樣本材料的分布區域為甘肅省的17個地區，樣本具有代表性和普遍性，因此可用于耐鹽材料的篩選與鑒定（圖6）。

圖5 聚類分析Fig.5 Cluster analysis

圖6 不同地區鹽生草的分布及其分類Fig.6 Distribution and classification of H.glomeratus in different regions

表5 3個主成分的特征值及貢獻率Table 5 The eigenvalues and contribution rates of the 3 principal components

表6 各因子載荷矩陣Table 6 Factors load matrix

3 討論

土壤鹽堿化不僅僅只是某個地區或某個國家的問題，現在已成為全球農業發展面臨的一個主要問題。鄒凱等［13］對3種耐鹽植物進行耐鹽性評價，其中鹽生草的耐鹽能力最強；汪軍成在對鹽生草鹽分區隔化耐鹽機制研究中發現，鹽生草的根、莖、葉都具有富集鹽分的作用，其中葉片的富集能力最強［14］。本研究選取鹽生草作為材料，對采集自甘肅省17個地區的鹽生草在鹽脅迫下的種子萌發特性進行分析。研究結果表明，與對照相比，17個地區鹽生草種子在經過鹽處理后，其發芽勢以及發芽率都普遍下降，鹽脅迫對各地區鹽生草萌發的抑制程度不同，民勤縣重興鄉、蘭州新區的鹽生草的萌發受到的抑制最小，白銀市景泰縣、張掖市民樂縣的鹽生草的萌發受到抑制最大，這與李玉梅等［15］以及李詩琴等［16］的研究結果一致，鹽分會影響種子的萌發。

各地區鹽生草幼苗的株高對鹽脅迫的反應不同，與對照相比，各地區鹽生草的株高變幅為17.65%~6.63%，這表明鹽脅迫對不同地區的鹽生草的生長既表現出促進作用，又表現出抑制作用。賈新平等［18］對海濱雀稗的研究發現，NaCl的濃度為100 mmol/L時，對海濱雀稗株高的增長抑制不明顯。劉自剛等［17］在對白菜型的冬油菜研究中發現，在鹽脅迫下幼苗的生長受到抑制，原因可能是不同地區鹽生草對鹽脅迫的適應性不同，在鹽脅迫下有的地區的鹽生草生長受到促進，有的受到抑制，具體原因有待進一步研究。各地區鹽生草的干、鮮重受鹽處理的影響差異明顯，地區間具有顯著性差異（P<0.05），其中，相比于對照，各地區鹽生草的干重增高，增幅為12.98%~100.48%，其中張掖市山丹縣、白銀市靖遠縣的鹽生草積累干物質的能力最強，說明在該處理下有利于鹽生草干物質的積累。這與白健慧［19］對燕麥的研究結果一致，輕度鹽脅迫能促進燕麥干物質的積累。在鹽脅迫下，幼苗的Na+含量明顯增加，并且各地區鹽生草幼苗間的Na+含量具有顯著差異（P<0.05），除7號地區鹽生草幼苗外，其余地區鹽生草幼苗的K+含量均比對照低。王英逵等［25］對羊草的研究發現，鹽脅迫會增加羊草體內Na+含量，抑制K+的含量。這幾個地區的鹽生草幼苗的K+/Na+均比對照低，并且具有顯著性差異（P<0.05）。因此，可以把K+/Na+比作為鹽生草耐鹽性的指標［24］，這為耐鹽性鹽生草篩選提供了重要的依據。

植物在鹽處理過程中，根系最先接到脅迫信號，并作出相應的代謝反應［20］。有研究表明，鹽脅迫能夠降低植物的根系活力［21-23］，本研究結果也表明，各地區的鹽生草在鹽脅迫下其根系活力都明顯減弱，材料間具有顯著差異，其中張掖市山丹縣、白銀市景泰縣鹽生草的根系受鹽脅迫的影響最大。通過聚類分析，將不同地區鹽生草劃分為3個等級，分別為耐鹽性強、耐鹽性較好以及耐鹽性差，第Ⅰ類有白銀市靖遠縣、民勤縣重興鄉、白銀市會寧縣、張掖市甘州區、蘭州新區、張掖市民樂縣，其鹽生草耐鹽性最強；第Ⅱ類有金昌市永昌縣、蘭州沙井驛、民勤縣收成鄉、張掖市高臺縣、張掖市臨澤縣，其鹽生草耐鹽性較好；第Ⅲ類有白銀市平川區、張掖市山丹縣、酒泉市肅州區、金昌市金川區、武威市涼州區、白銀市景泰縣，其鹽生草耐鹽性最差。不同地區鹽生草種子，影響其萌發的因素是否與其原始生長環境以及鹽生草本身有關，有待進一步研究。

4 結論

鹽脅迫條件下，17個地區的鹽生草種子發芽勢和發芽率均降低；各地區鹽生草幼苗的株高、鮮重和干重對鹽脅迫的響應不同；鹽脅迫條件下，鹽生草幼苗的Na+含量增多、K+含量減少，K+/Na+顯著降低；鹽脅迫對不同地區鹽生草幼苗根系活力具有抑制作用；17個地區的鹽生草可分為耐鹽性強、耐鹽性較好以及耐鹽性差3個類群。

附表：附表1 各地區鹽生草種子發芽期各指標值Supplementary table 1 Germination indices of H.glomeratus seeds in different regions