小清河河口鄰近海域口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)COI序列特征及遺傳多樣性分析

劉 英, 王全超, 李海匯, 紀瑩璐, 陳琳琳, 李寶泉

小清河河口鄰近海域口蝦蛄()序列特征及遺傳多樣性分析

劉 英1, 2, 王全超1, 李海匯3, 紀瑩璐4, 陳琳琳1, 李寶泉1, 2

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 壽光市漁業發展中心, 山東 壽光 262700; 4. 國家海洋局北海預報中心, 山東 青島 266061)

受河流沿岸工農業發展以及人口急劇增加影響, 小清河河口及鄰近海域受到嚴重污染。口蝦蛄()作為小清河河口及鄰近海域重要漁業資源之一, 承受著巨大的捕撈和生存壓力。為了掌握口蝦蛄種群在該區域的種群遺傳多樣性, 本研究于2020年6—10月在小清河河口及鄰近海域采集口蝦蛄生物樣本, 進行了基于線粒體基因的種群遺傳多樣性分析。研究結果表明, 基于216條長度為655 bp的基因片段, 共定義90個單倍型, 63個多態位點, 其中包括59個轉換位點, 1個顛換位點和3個轉換與顛換同時存在的位點, 核苷酸多樣性指數和單倍型多樣性分別為0.970 0和0.005 1。與其他海域相比, 小清河河口種群遺傳多樣性處于相對較高水平; 同時遺傳結構分析發現黃渤海與東海及南海分布的口蝦蛄種群遺傳變異較大, 但黃渤海海域內遺傳變異較小。通過本研究基本掌握了小清河河口及鄰近海域口蝦蛄種群遺傳多樣性背景, 也可為口蝦蛄資源管理以及種質資源庫建立等提供科學的基礎理論依據。

小清河河口及鄰近海域; 口蝦蛄; 線粒體; 遺傳多樣性

口蝦蛄(), 俗稱爬蝦、蝦爬子, 隸屬于節肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squillidae), 自然分布于西太平洋溫熱帶淺水海區, 在中國沿海均廣泛分布, 其中以黃渤海產量最大[1]。口蝦蛄棲息于潮下帶泥沙質海底, 其食性主要以貝類及甲殼類為主[2]。口蝦蛄具有個體大、產量高、繁殖周期短、易捕撈等優點, 使其具有很高的經濟價值, 是中國沿海重要的海產經濟種類, 同時其肉質鮮美、營養價值高, 沿海民眾喜食。因此, 口蝦蛄多年來均作為近海漁業主要捕撈對象之一[3]。特別在渤海, 口蝦蛄已成為支柱漁業之一[4]。但近年來, 由于全球氣候變化、環境污染、養殖疾病危害以及過度捕撈等導致口蝦蛄野生資源急劇減少[5], 并進而影響或降低口蝦蛄野生種群的遺傳多樣性。

鑒于口蝦蛄重要的經濟價值, 國內對該物種已開展了較多研究, 涉及到生物學特征[6-8]、生理生態[9]、漁業資源[10-11]和人工繁育[12-13]等方面。隨著分子生物學技術發展以及口蝦蛄資源管理和種質資源保護的需要, 對口蝦蛄種群遺傳多樣性的研究也日漸增多。劉海映等[14]基于隨機擴增多態性DNA標記(random amplified polymorphic DNA, RAPD)分析了大連海域口蝦蛄遺傳多樣性; Liu等[15]報道了口蝦蛄線粒體全長序列, 自此關于利用線粒體基因作為遺傳標記研究其種群遺傳多樣性的報道也日漸增多; Zhang等[16]使用線粒體基因作為遺傳標記分析了口蝦蛄在中國海域的地理分布、擴散與遺傳差異; Du等[17]以作為遺傳標記分析口蝦蛄在渤海、黃海和東海的遺傳多樣性; 隋宥珍等[18]基于細胞色素(cytochrome,)基因分析了口蝦蛄黃渤海種群、東海種群、南海種群的遺傳多樣性; 隋宥珍等[19]基于細胞色素氧化酶亞基I(cytochrome oxidase subunit I,)基因分析了東海海域口蝦蛄遺傳多樣性。上述研究基本摸清了中國不同海域口蝦蛄種群的遺傳多樣性現狀和不同地理種群的遺傳分化。但對個別區域, 尤其是具有重要生態意義的河口區如小清河河口, 口蝦蛄種群的遺傳多樣性研究迄今還尚未詳細開展。

小清河河口及鄰近海域曾經是渤海萊州灣重要的漁業區, 是渤海生態系統中漁業生物的產卵場與索餌場。小清河是典型受污染河流之一, 沿河污染物隨河流入海, 使河口及鄰近海域污染加重[20-22], 且導致河口內出現低氧區[23]。小清河河口及鄰近海域的污染加重以及不斷增大的捕撈強度, 必然導致該區口蝦蛄種群數量的維持和生存受到影響。因此有必要對口蝦蛄開展遺傳多樣性研究, 摸清該海域口蝦蛄的遺傳分化潛力, 以維持資源生產力。線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)為母系遺傳, 基因結構簡單, 且容易提取擴增, 是研究海洋生物遺傳多樣性的重要手段。基因是線粒體基因的重要組成部分, 具有結構簡單、進化速率適中、具有較高的多態性以及易被通用引物擴增的優勢, 已被廣泛用于種群遺傳多樣性研究。本研究采集了小清河河口及鄰近海域口蝦蛄生物樣本, 基于口蝦蛄種群基因標記研究其遺傳多樣性, 評估小清河河口及鄰近海域口蝦蛄種質資源現狀, 為該種群健康維持、資源合理開發利用以及相關部門管理決策的制定提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年6—10月于小清河河口及其鄰近海域(表1), 采用漁業拖網方式, 采集口蝦蛄生物樣品。隨機選取部分樣品放于體積分數95%的乙醇中暫存并轉移至實驗室備用。

1.2 DNA提取、擴增及測序

取口蝦蛄背部肌肉, 使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]按照操作說明書提取每個口蝦蛄個體總DNA。用NanoDrop 1000分光光度計(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)測定提取DNA的純度和完整性, 并進行1%瓊脂糖凝膠電泳。合格DNA放于–20 ℃暫存備用。

COI基因片段擴增引物為通用引物, 引物序列: LCO1490: 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′;HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[24]。PCR擴增在50 μL反應體系中進行。50 μL反應體系包括: 25 μL含DNA聚合酶反應混合物[天根生化科技(北京)有限公司], 17 μL ddH2O, 上游引物和下游引物各2 μL(100 μmol/L)及模板DNA 4 μL。PCR擴增按照以下熱循環程序進行: 94 ℃初步變性5 min; 隨后94 ℃變性45 s, 40 ℃退火45 s, 72 ℃延伸30 s, 進行35個循環; 最后在72 ℃下延伸10 min, 10 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后, 送測序公司[生工生物工程(上海)股份有限公司]進行雙向測序。

表1 口蝦蛄樣本采集信息

1.3 數據分析

通過BioEdit軟件對獲得的序列進行可視化、修剪、編輯、拼接以及人工校對, 獲得完整無誤的序列, 并在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行復檢。在MEGA 7.0.26進行CLUSTAL比對和序列堿基組成及變異分析。采用DAMEB 7軟件分析基因序列的堿基替換飽和度。使用DNAsp v6.12.03計算多態位點()、總變異位點()、單倍型數量()、單倍型多樣性指數(H)、遺傳多樣性指數()、平均核苷酸差異數()等遺傳多樣性參數, 分析種群遺傳多樣性。

為明確小清河河口及鄰近海域口蝦蛄種群遺傳結構現狀, 采用從GenBank上額外下載的唐山、青島、舟山和廣州口蝦蛄種群的序列, 進行系統發育樹構建和遺傳結構分析。序列包括唐山種群(GenBank登錄號: MF173560-MF173566)、青島種群(GenBank登錄號: MF173526-MF173534)、舟山種群(GenBank登錄號: MF173576-MF173598)[25]以及廣州種群(GenBank登錄號: HQ621811-HQ621829)[26]。分子系統發育樹的重建是在MEGA 7.0.26中使用基于Kimura雙參數法模型(Kimura 2-parameter)遺傳距離的非加權分組平均法(unweighted pair group method using arithmetic average, UPGMA)進行, 并選用bootstrap法進行1 000次重復自舉檢驗, 評估系統發育樹。遺傳結構分析是利用Arlequin 3.5.2.2軟件開展分子方差分析(AMOVA)和遺傳分化系數ST計算。

2 結果

2.1 小清河河口及鄰近海域口蝦蛄COI序列

獲得序列后經剪切、人工校正及NCBI復檢后, 共獲得216條長度為655 bp的口蝦蛄基因部分序列片段。序列片段無插入和缺失。所有序列A、G、C、T的平均含量分別為36.6%、17.1%、18.4%和27.9%, A+T含量明顯高于G+C含量。4種堿基在密碼子第1位上分布較為均勻(A=26.48%, G=32.96%, C=16.90%, T=24.65%), 第2位上T的含量較高(A=13.30%, G=18.81%, C=25.23%, T=42.66% ), 第3位上呈現G和C的含量較低的偏倚現象(A=43.83%, G=4.32%, C=9.22%, T=42.63%)。

所有序列共發現66個變異位點, 其中63個多態位點, 由30個單一突變位點和33個簡約信息位點組成。63個多態位點中包括59個轉換位點, 1個顛換位點和3個轉換與顛換同時存在的位點。4個變異位點發生在密碼子的第1位, 59個變異位點發生在第3位, 無變異位點發生在第2位。655 bp的基因序列共定義218個氨基酸, 且堿基的替換并未導致氨基酸序列發生變化。

堿基的替換飽和分析見圖1, 成對堿基的轉換率、顛換率都與遺傳距離成線性相關, 其中, 94.18%的堿基轉換和5.84%的堿基顛換能分別得到相關線性分析。序列堿基替換飽和度分析結果也表明, 標準堿基替換飽和值(ss.c)顯著大于實際檢測到的基因堿基替換值(ss)(<0.05)。

2.2 小清河河口口蝦蛄種群遺傳多樣性以及與其他海域的比較

該海域口蝦蛄種群H為0.970 0,為0.005 1,為3.330 0。所有序列共定義90個單倍型, 其中, 單倍型Hap-1、Hap-16、和Hap-27分別為20、19和15個個體所有, 是優勢單倍型。

圖1 小清河河口口蝦蛄種群COI基因堿基替換飽和分析

本研究口蝦蛄種群單倍型多樣性與粵東海種群、東海種群相當, 略高于渤海灣種群、皮口種群、綏中種群和青島種群; 與Zhu等[25]研究的唐山種群、龍口種群、青島種群、連云港種群以及七星列島種群單倍型多樣性相當, 但略高于東營種群、小洋山種群、舟山種群和三門種群; 核苷酸多樣性低于粵東海種群, 東海種群, 高于渤海灣種群、遼東灣種群和青島種群, 低于Zhu等[25]研究中的青島種群、連云港種群和七星列島種群, 高于唐山種群、小洋山種群和三門種群(表2)。

2.3 口蝦蛄種群遺傳結構

小清河河口口蝦蛄種群與唐山種群、青島種群、舟山種群以及廣州種群之間的親緣關系和遺傳結構見圖2。分子系統發育樹顯示所有單倍型聚為兩支: 小清河河口種群首先與青島種群聚集在一起, 然后再與唐山種群匯合, 組成一支, 廣州種群和舟山種群組成則組成另一支。

AMOVA分析結果顯示, 5個口蝦蛄種群遺傳變異主要來自于種群間, 且5個口蝦蛄種群間具有顯著的遺傳分化水平(ST=0.857 38,<0.05)(表3)。不同種群間成對ST范圍在–0.020 62～0.900 91之間(表4)。結果表明, 唐山種群、小清河河口種群及青島種群與舟山種群和廣州種群間存在顯著遺傳分化(<0.05), 但唐山種群、小清河河口種群和青島種群間不存在顯著遺傳分化(>0.05), 廣州種群和舟山種群間不存在顯著遺傳分化(>0.05)。

表2 其他海域口蝦蛄種群遺傳多樣性

圖2 基于5個口蝦蛄種群COI單倍型序列遺傳距離構建的UPGMA系統發育樹

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎, 開展遺傳多樣性的研究, 對于漁業資源管理的可持續利用以及漁業資源的管理和保護都具有重要意義[29]。一般而言, 遺傳多樣性水平高的物種, 具有較強的環境適應能力、生存能力和進化潛力。因此, 物種遺傳多樣性一旦降低, 可導致物種適應及生存能力降低、物種退化甚至滅絕[30]。

物種在基因水平上的遺傳變異最直接的表現就是堿基組成的差異。目前已觀測到的無脊椎動物線粒體基因組中堿基組成基本規律均為A+T含量顯著高于G+C含量[31]。本研究中口蝦蛄種群的序列堿基組成A+T含量高于G+C含量, 該結果與三疣梭子蟹()[32]、脊尾白蝦()[33]、芋螺[34]的基因片段研究結果相似。本研究中, 口蝦蛄的序列堿基轉換與顛換之比為9, 遠大于基因變異達到飽和狀態的臨界值2[35], 說明小清河河口的序列變異還未達到飽和狀態。堿基轉換數大于顛換數, 符合在動物線粒體進化過程中堿基的替換主要以轉換為主的結論[36]。并且一般在線粒體DNA進化過程中, 親緣關系較近物種間, 轉換更容易頻繁發生, 而顛換則在親緣關系較遠的物種間更容易發生。同一物種內部, 轉換數量高于顛換數量[37]。同時,基因片段的堿基飽和性分析顯示小清河河口口蝦蛄種群實際堿基替換值顯著低于期望堿基替換飽和值, 表明基因堿基替換未達到飽和狀態。基于基因未校正的轉換、顛換與遺傳距離的散點分布圖得到的線性關系也表明小清河河口口蝦蛄種群的基因序列未達到飽和狀態, 因此, 線粒體基因適合用作研究口蝦蛄群體遺傳多樣性的分子標記。

表3 基于COI序列的口蝦蛄5個地理種群間的AMOVA分析

注:<0.05差異顯著

表4 基于COI序列的口蝦蛄5個地理種群間的FST值

注: *表示種群間差異顯著,<0.05差異顯著

在所有堿基變異中, 有59個變異位點發生在密碼子的第3位上, 僅有4個變異位點發生在密碼子的第1位上, 無變異位點發生在密碼子的第2位上。可見, 密碼子第3位的變異率明顯高于第1位和第2位, 這與密碼子第1位相對保守、第2位非常保守以及第3位具有搖擺性的特點相符, 這與某些魚類研究結果一致[38-39]。同時本結果檢測到的所有核苷酸變異均為同義突變。這進一步說明密碼子簡并性大多發生在密碼子第3位上且在物種穩定上起著重要作用。

Grant和Bowen[40]根據線粒體基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性, 將海洋生物的遺傳多樣性分為4種類型: 第1類, 低單倍型多樣性(H>0.5), 低核苷酸多樣性(<0.005)型, 近期種群瓶頸或是由單一、少數種群所產生的建立者效應; 第2類, 高單倍型多樣性(H>0.5), 低核苷酸多樣性(<0.005)型, 種群瓶頸, 隨后是種群快速增長和突變積累; 第3類,低單倍型多樣性(H<0.5), 高核苷酸多樣性(>0.005)型, 種群差異, 這種差異可能來自孤立種群間的二次接觸或者是一個大而穩定的種群中發生過瓶頸效應; 第4類, 高單倍型多樣性(H>0.5), 高核苷酸多樣性(>0.005)型, 種群由一個大而穩定的種群經過長時間演化所產生, 或是兩個不同系群的種群二次接觸產生。本研究口蝦蛄種群總的單倍型多樣性H為0.970 0, 核苷酸多樣性為0.005 1, 屬于第4類種群狀態, 即種群屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性模式, 種群遺傳多樣性較高, 處于長期穩定狀態。本研究口蝦蛄種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性在中國沿海多數海域中處于相對較高水平, 這說明小清河河口口蝦蛄種群的遺傳多樣性在我國沿海處于相對較高的水平, 可考慮作為種質資源選育及建立種質資源庫的選擇之一。

種群遺傳結構受地理隔離、洋流、生境、人類活動、遷移和歷史因素等多種因素的影響[41-42]。唐山種群、小清河河口種群和青島種群位于黃渤海, 這3個種群間兩兩相互聚為姐妹群, AMOVA和ST分析也顯示3個種群間沒有顯著遺傳分化, 表明3個種群間極可能存在基因交流, 而且小清河河口種群與青島種群交流更為頻繁。一方面在黃渤海水交換過程中, 黃海沿岸流流動方向基本終年不變, 沿山東半島北岸從渤海進入北黃海, 然后南下到達南黃海[43], 另一方面口蝦蛄具有大約2個月的幼蟲浮游期。因此, 口蝦蛄幼體可在海洋環流的驅動下發生擴散, 從而維持口蝦蛄種群連通性[44]。此外, 本研究中AOMVA、ST和分子系統發育樹也均顯示以長江為界, 長江口以北口蝦蛄種群和長江口以南的種群間存在顯著的遺傳分化。但目前, 關于中國沿海口蝦蛄種群遺傳結構尚未得到統一。Cheng和Sha[45]通過線粒體基因標記和核基因標記分析認為, 在長江入海口兩側存在兩個口蝦蛄亞種。一些學者分別通過對和分析, 認為東海和黃海的口蝦蛄種群的遺傳分化的原因可能是由長江淡水的注入形成的物理屏障和局部適應造成[17, 25]。也有學者通過以線粒體基因和核基因為遺傳標記, 認為口蝦蛄在冰川時期受臺灣海峽分隔, 長期隔離形成了南海種群孤立于其他海域種群的一個顯著的南北種群結構[16]。因此未來對中國沿海口蝦蛄種群的遺傳研究中, 在選擇遺傳標記時, 應綜合考慮遺傳標記的進化速度、多態性、遺傳信息的全面性等。

4 結論與展望

口蝦蛄作為小清河河口及鄰近海域常年優勢種之一, 面臨著巨大的捕撈和生存壓力。研究結果表明小清河河口及鄰近海域口蝦蛄種群遺傳多樣性目前還處于較高水平, 為以后口蝦蛄的苗種選育、野生種質資源保護和合理開發利用提供了新的依據。為了維持該海域口蝦蛄種群的遺傳多樣性水平, 建議加強口蝦蛄資源保護, 基于現有資源量的科學評估, 進行合理采捕, 如控制網具網目大小, 減小網目尺寸, 以利于口蝦蛄幼體的存活和自然種群的延續, 保障口蝦蛄野生資源可持續利用。同時, 由于口蝦蛄在4月下旬便進入繁殖期, 而目前休漁期在5月1日至9月1日, 有必要考慮適當延長休漁時間至4月下旬。

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Analysis of thesequence characteristics and genetic diversity ofin the Xiaoqing River Estuary and its adjacent sea

LIU Ying1, 2, WANG Quan-chao1, LI Hai-hui3, JI Ying-lu4, CHEN Lin-lin3, LI Bao-quan1, 2

(1. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Laboratory of Protection of Biological Resources Biology in Coastal Waters, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Shouguang Marine Fishery Development Center, Shouguang 262700, China; 4. North China Sea Marine Forecasting Center of State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China)

The Xiaoqing River Estuary has been severely polluted due to the quick development of industry and agriculture as well as the rapid increase in the population in the region. Mantis shrimp () is an important fishery resource in this area that is under great threat from overfishing and pollution. In this study, samples were collected in the Xiaoqing River Estuary and its adjacent sea during June–August 2020 to understand the population genetic diversity based ongene. A total of 90 haplotypes and 63 polymorphic loci, including 59 transition loci, 1 transversion loci, and 3 loci where both a transition and transversion existed, were defined based on 216gene fragments with a length of 655 bp. The nucleotide diversity and haplotype diversity were 0.970 0 and 0.005 1, respectively.Compared with other sea areas, we found that the genetic diversity of the Xiaoqing River Estuary population was relatively high. Meanwhile, genetic structure analysis showed an obvious difference in the genetic variation of the mantis shrimp population on a large spatial scale, e.g., the Yellow Sea and the Bohai Sea, the East China Sea and the South China Sea. Whereas, it did not show any difference on a relatively smaller spatial scale, e.g., the Yellow Sea and the Bohai Sea. The genetic diversity background of the mantis shrimp population in the Xiaoqing River Estuary and its adjacent sea could provide a theoretical basis for resource management and germplasm bank establishment.

XiaoqingRiver Estuary and its adjacent sea areas;;gene; genetic diversity

Jun. 18, 2021

S917.4

A

1000-3096(2022)11-0038-09

10.11759/hykx20210618001

2021-06-18;

2021-07-06

美麗中國生態文明建設科技工程專項(XDA23050304); 山東省自然基金面上項目(ZR2021MD084)

[The Strategic Priority Research Program of the Chinese Acade-my of Sciences, No. XDA23050304; the Shandong Provincial Natural Scie-n-ce Foundation, No. ZR2021MD084]

劉英(1996—), 女, 四川內江人, 碩士, 主要從事大型底棲動物生理生態研究, E-mail: 3104931657@qq.com; 李寶泉(1972—),通信作者, 男, 研究員, 主要從事海洋生物多樣性、底棲動物生理生態和生態健康評價研究, E-mail: bqli@yic.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)