噬菌體在水產養殖中治療細菌感染的研究進展和挑戰

龔夢馨, 李明源

噬菌體在水產養殖中治療細菌感染的研究進展和挑戰

龔夢馨, 李明源

(喀什大學 生命與地理科學學院, 新疆 喀什 844000)

高密度、集約化水產養殖業的發展導致疾病不斷發生并呈現日趨嚴重之勢, 同時, 由于細菌對傳統抗生素產生耐藥性而使抗生素的使用受到越來越多的限制, 世界各國科學家都在致力于研究替代抗生素的新療法。噬菌體因為可以特異性地殺死某些細菌, 對動、植物以及環境都沒有副作用, 因此, 在水產養殖病害防治中呈現良好的應用前景。本文從噬菌體的特異性、安全性、賦形方法以及對環境的影響等方面對國內外水產養殖中的噬菌體治療研究現狀和存在的主要問題進行了簡要論述, 為了解學科進展, 促進噬菌體在治療中的成功使用提供了理論依據。

水產養殖; 噬菌體療法; 噬菌體; 抗生素耐藥性

作為優質蛋白重要來源的水產品, 人們對其需求正日漸增長。據《2022年世界漁業和水產養殖狀況》[1]報告, 2020年世界漁業和水產養殖總產量上升至歷史最高水平, 亞洲國家漁業和水產養殖動物產量約占全球總量的70%。隨著水產養殖業的擴大發展, 特別是高密度、集約化養殖的發展, 導致疾病經常爆發, 引起養殖動物大量死亡, 給產業帶來巨大損失, 致使生產效益下降、成本提高。水生動物病原體主要包括細菌、病毒、原生動物和真菌等。其中, 細菌給水生動物造成的危害最大。據統計, 水生動物約34%的疾病是由細菌引起[2]。抗擊水生動物的疾病對公眾健康可能產生巨大影響, 因為某些人畜共患病原體可通過與患病動物或動物源性食品的直接接觸傳播, 存在導致人類疾病或導致公共衛生風險[3]。水生養殖動物發病后, 往往使用抗生素治療。然而, 抗生素治療不但容易造成環境污染, 而且會導致產生耐藥性細菌, 所以抗生素的使用正受到越來越多限制。目前, 世界各國科學家都在致力于研究替代抗生素的新療法。噬菌體由于可以特異性地殺死某些細菌, 對動、植物以及環境都沒有副作用, 因此, 在水產養殖病害防治中呈現良好的應用前景。下面, 我們對水產養殖中的噬菌體治療研究現狀和存在主要問題, 作簡要概述。

1 噬菌體概述

噬菌體是指可以感染細菌的病毒, 發現于20世紀初, 是由一層蛋白質或脂蛋白組成的衣殼包裹著核酸(單鏈或雙鏈DNA或RNA)組成的生物實體(圖1)。它的衣殼可以保護噬菌體遺傳物質, 而尾部可以通過位于尾部纖維上的特定受體識別宿主細菌[4-5]。噬菌體是地球上最豐富、最多樣化的微生物, 其數量大約是細菌的10倍。目前, 大多數已知的噬菌體都屬于有尾病毒目(Caudovirales)的有尾噬菌體。

噬菌體表現出兩個不同的復制循環(周期): 裂解性循環和溶原性循環。只表現出裂解循環的噬菌體為烈性噬菌體, 而同時表現出裂解循環和溶原循環的噬菌體為溫和噬菌體。無論是裂解性循環還是溶原性循環, 噬菌體都是從被動地黏附到細菌細胞(宿主菌)表面特異性受體(或轉運蛋白)后將基因組注入宿主細胞開始進行裂解循環。在裂解循環中, 噬菌體基因組在宿主菌細胞內誘導自身組分合成, 包括基因組復制, 從而致使宿主菌細胞直接裂解。溶原性循環中, 噬菌體基因組整合到宿主菌基因組中, 并與宿主基因組一起復制形成原噬菌體。

圖1 噬菌體照片(a)和模式圖(b)

原噬菌體可以以質粒的形式存在于宿主菌中, 這一狀態稱為溶原性。溶原性可以持續很多代, 直到由于環境因素(如抗生素治療、DNA 損傷等)出現而誘導裂解循環發生為止[4-5]。原噬菌體和宿主菌雙方都從溶原性中獲益。一方面, 宿主菌為噬菌體提供生存之所, 另一方面, 原噬菌體可以影響宿主菌代謝特性, 使之獲得對超級感染的免疫力和諸如抗生素抗性、毒力因子等新的表型, 有利于其拓展生存環境。

表現出溶原性循環的噬菌體即溫和噬菌體被認為是參與細菌細胞之間基因水平轉移的噬菌體。它們可以轉移毒力因子或抗生素抗性基因。因此, 溫和噬菌體不適合用于疾病防治。相反, 只表現出裂解循環的烈性噬菌體, 可以直接裂解宿主菌, 其參與基因轉移的可能性有限, 從而使它們可以用于疾病治療[4, 6]。

2 水產養殖中噬菌體治療研究現狀

2.1 噬菌體的發展簡史

噬菌體應用研究由來已久。早在1919年, 噬菌體的發現和命名者之一Felix d’Herelle就開始嘗試利用噬菌體治療人類細菌感染疾病。1921年Richard Bruynoghe和Joseph Maisin發表了有關噬菌體治療由金黃色葡萄球菌()引起的皮膚病的論文, 這是第一篇關于噬菌體治療人類細菌感染性疾病的研究報告[7]。但是, 隨著磺胺類藥()和青霉素()分別于1930和1940年代相繼投入使用, 人類對細菌感染疾病的治療進入抗生素化學治療時代, 這極大削弱了對噬菌體治療的研究熱情, 只在少數國家包括前蘇聯、波蘭和印度仍然進行噬菌體治療研究。有趣的是, 自20世紀80年代, 利用噬菌體治療動物細菌感染[8-12]和治療人類多重耐藥性細菌感染獲得成功以來, 人們又開始重視噬菌體治療這一方法。

2.2 噬菌體的研究進展

利用噬菌體治療水產養殖動物細菌性疾病, 始于20世紀90年代。NAKAI等[13]把分離到的格氏乳球菌()噬菌體PLgY, 通過皮下注射到格氏乳球菌感染的黃尾魚()的體內, 發現可以顯著降低感染黃獅魚的死亡率。變形假單胞菌()是魚類養殖中常見的一種致病性很強的細菌, 能導致不同時期的香魚()發病。PARK等[14]發現讓變形假單胞菌感染魚苗, 口服分離到的變形假單胞菌的兩株噬菌體PPpW-3和PPpW-4, 不但可以顯著降低病魚死亡率, 而且可以顯著減少池塘中的變形假單胞菌數, 特別值得注意的是, 治療變形假單胞菌感染的香魚所用的噬菌體PPpW-3和PPpW-4, 不會在香魚體內長期存在, 也不會誘導香魚產生中和抗體[15]。中國學者在水產養殖動物疾病的噬菌體防治方面開展了大量研究。弧菌Ⅱ(Ⅱ)可以感染皺紋盤鮑(Ino)誘發膿皰病, 李太武等[16]分離到的河流弧菌Ⅱ的噬菌體, 可以有效地治療或推遲膿皰病引起的鮑死亡, 把鮑成活率提高50%以上。目前, 噬菌體用于治療鮑哈維氏弧菌()感染[17]、牡蠣()副溶血弧菌(s)感染[18]和刺參()鰻弧菌()感染[19]都有報道(表1)。

2.3 噬菌體的特異性

噬菌體具有很強特異性, 作用一般僅限于少數或幾種細菌菌株。噬菌體可以特異識別目標細菌表面受體, 具有高度特異性, 僅感染一種細菌屬甚至某些特定菌株。噬菌體不會損害環境或宿主的天然微生物群落, 特別是益生菌群落[4]。另外, 噬菌體不會與真核細菌相互作用, 僅作用于原核生物細菌, 因此, 利用噬菌體治療副作用很小[5, 20]。應用噬菌體治療感染殺鮭氣單胞菌()的比目魚()實驗表明, 噬菌體不但有效降低了氣單胞菌(sp.)的感染, 而且對養殖水體的天然細菌群落沒有影響[21], 這與使用抗生素治療結果形成反差。用抗生素特別是具有廣譜活性的抗生素治療魚類疾病, 會改變環境和宿主正常的微生物群落, 并可能導致繼發感染和耐藥性的出現[22]。

表1 水產養殖中主要的噬菌體治療實驗研究總結

水生動物病原體范圍廣泛, 而噬菌體作用具有特異性, 所以, 分離廣譜噬菌體成為一個主要研究領域[23]。VINOD等[24]分離出對50株對哈維氏弧菌()具有活性的噬菌體, 以保護蝦幼蟲; ZHANG等[25]發現了一種對副溶血性弧菌()具有廣泛宿主范圍的噬菌體。新近, 劉莉等[26]鑒定到一株廣譜噬菌體, 發現分離自中華鱉()、南美白對蝦()、鱸魚()等養殖動物的嗜水氣單胞菌()、遲緩愛德華氏菌()、副溶血弧菌和黃桿菌()等10多種致病株都對該噬菌體敏感, 而枯草芽孢桿菌()、酵母菌()等益生菌對其不敏感, 顯示出該噬菌體在水產動物疾病防治中具有良好應用前景。

鑒于已發現的廣譜噬菌體十分有限, 克服噬菌體宿主范圍狹窄這一挑戰的方法還可以使用具有不同特異性的噬菌體混合物來實現, 這種方法也稱為噬菌體雞尾酒療法。混合物中的噬菌體各自都有特定的靶細菌, 它們共同作用, 實現廣譜殺菌的同時, 又不影響益生菌群落。隨著越來越多的噬菌體被發現和鑒定, 使得利用混合噬菌體同時治療不同的細菌疾病成為可能[27-28]。目前, 已經報道有混合噬菌體制劑成功應用于醫學治療[29]。中國已有一種有噬菌體性質的制劑神克隆菌應用于水產養殖動物疾病防治, 其對水產養殖動物的主要致病菌如弧菌()、假單胞菌、氣單胞菌、耶爾森氏菌()、愛德華氏菌()等都較好治療作用。研究還發現, 重復或連續使用噬菌體治療比單次使用噬菌體治療效果更好[30]。

3 水產養殖中噬菌體治療存在問題

噬菌體療法在水產動物養殖上的應用雖然前景光明, 但仍有些理論和應用問題有待解決, 特別是噬菌體基因轉移的風險亟待探索[40, 41]。烈性噬菌體具有高度特異性, 一般不會破壞有益細菌, 也不會影響環境[42], 人們擔心的是噬菌體根除病原體可能會導致空出的生態位被其他細菌重新入侵[43], 通過調節宿主菌的數量改變群落比例, 從而破壞微生物組對環境產生負面影響。噬菌體還通過裂解細菌細胞釋放有機物, 也可能對生物圈中有機物循環產生重要影響[44]。這些因素在水生環境中可以快速傳播, 其作用尤為明顯[45]。使用最小的噬菌體劑量, 可能有助于降低破壞環境細菌群落的可能性。但是, 有關噬菌體的繁殖研究尚不充分, 少量噬菌體在治療期間可能低于閾值且效率低下。因此, 在規模化應用之前, 亟需對每種噬菌體對微生物群落的影響進行研究[41, 46, 47]。

3.1 噬菌體的基因轉移

使用噬菌體治療時要考慮的一個重要安全因素是基因水平轉移的風險。據報道細菌對噬菌體比對抗生素產生耐藥性的速率大約慢10倍, 并且耐噬菌體細菌對具有相似靶標范圍的其他噬菌體沒有耐藥性[48], 但這仍然是需要重視的問題。眾所周知, 選擇壓力和環境中抗生素的持續存在會導致細菌產生抗藥性。細菌在結合和轉導過程中可以通過基因水平轉移獲得抗生素抗性基因。結合指供體細菌和受體細菌通過細胞間的暫時溝通, 將遺傳物質自供體菌轉入受體菌, 使受體菌獲得供體菌部分遺傳性狀[49]。轉導是指外源DNA被引入細菌細胞, 這個過程不需要細菌細胞的直接接觸, 溫和的噬菌體可能會在這個過程中發揮作用。因此, 水產養殖動物疾病防治中, 應將具有轉導可能的溫和噬菌體排除在外, 僅選擇烈性的噬菌體用于噬菌體雞尾酒療法[50]。有證據證明, 應用噬菌體雞尾酒療法可能是避免細菌對噬菌體產生耐藥性的有效方法。MATEUS等[51]發現一種由3種噬菌體組成的混合物不但可以防治水產養殖動物疾病, 而且可能會延緩細菌對噬菌體抗性的發展, 這是因為對一種以上的噬菌體產生耐藥性意味著細菌的適應成本更高[40, 52]。

3.2 噬菌體賦形

每個生物系統都是不同的, 因此, 應用噬菌體療法進行治療或者作為預防性治療時, 正確的使用方法包括噬菌體的選擇、遞送方式和穩定性等因素, 必需獨立考慮。噬菌體療法成功的第一步是選擇合適的噬菌體, 一般而言, 選擇具有烈性且裂解周期短的噬菌體可以提高治療效率[53]。噬菌體在自然界中非常豐富, 據報道每毫升水中含有多達 104～108個噬菌體[42], 分離能夠有效應用于治療的新型烈性噬菌體仍然是一項重要工作[54-55]。

在水產養殖中, 噬菌體遞送方式包括浸泡、注射、飼喂和局部施用。當疾病是外部的或當噬菌體穿過一些天然屏障可以到達感染的內部部位時, 浸泡是一種有效的治療方法[56-57]。噬菌體遞送方式遇到的挑戰之一是噬菌體有時難以到達體內的細菌感染部位。噬菌體療法成功的關鍵是有足夠數量的噬菌體可以到達并攻擊目標。只有當噬菌體被有效地運送到感染部位并且它們不被動物的免疫系統清除時, 才能實現有效治療。KALATZIS等[40]報道魚類的噬菌體療法可以引起其自身免疫系統反應, 從而清除噬菌體并阻止其到達感染部位, YUN等[58]驗證了噬菌體裂解物可能具有免疫調節作用并誘導細胞和體液免疫反應的事實, 他們使用嗜水氣單胞菌的噬菌體裂解物來刺激鯉魚, 發現用噬菌體裂解物的存活率高于用滅活細菌細胞疫苗免疫的魚。這與PARK 等[56, 59]的黃尾魚()進行噬菌體治療后沒有發現產生中和抗體的報告相矛盾, 因此這個問題尚需深入研究。解決阻礙噬菌體抵達體內細菌感染部位的可能方法, 一是將噬菌體微膠囊化進行保護[48], 二是篩選噬菌體突變體, 旨在減弱表面蛋白的免疫原性, 使噬菌體不易被動物的免疫系統清除[60]。

耐pH和耐熱性對噬菌體的存活至關重要。pH可以影響噬菌體的感染性, 低于5 或超過10時, 感染細菌效率較低, 大多數噬菌體在pH為6～8時活性最佳[61]。當魚類胃中pH值較低, 會影響噬菌體的胞內復制和增殖。解決這一問題的方法, 可以在含有噬菌體的魚飼料上用乳清蛋白涂層[62], 既能控制噬菌體的釋放并保護它們到達目的地[41, 60]。溫度對噬菌體的活力、儲存和發生關系密切, 高溫可能會降解構成衣殼的蛋白質。水產養殖用水溫度通常適中, 不影響噬菌體活性。需要注意的是在生產過程中, 有時需要在低溫或高溫下加工產品, 因此, 這時最好選擇對溫度敏感性較低的噬菌體。另外, 水產養殖動物疾病治療和預防治療中, 使用噬菌體的劑量和遞送時間, 也會影響治療和預防效果。

終上所述, 噬菌體由于其對動、植物以及環境沒有副作用, 在水產養殖病害防治中具有非常良好的應用前景。然而, 目前對水產養殖中的噬菌體治療仍有一些問題, 如適用的噬菌體數量有限及其對基因水平轉移的風險, 都需要深入研究。

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Research progress and challenges of bacteriophage in the treatment of bacterial infections in aquaculture

GONG Meng-xin, LI Ming-yuan

(School of Life and Geographical Sciences, Kashi University, Kashi 844000, China)

With the rising frequency of diseases in aquaculture as a result of high-density and intensive farming, as well as antibiotics limits, biologists all over the world are investigating alternatives to antibiotics for the treatment of bacterial infection. Bacteriophages can precisely kill some bacteria while having a little detrimental impact on animals, plants, and the environment; they are thus emerging as a promising option for non-antibiotic therapy to treat bacterial diseases. This study briefly examines the research status and major challenges of phage therapy in aquaculture at home and abroad in terms of specificity, safety, shaping method, and environmental impact. The successful application provides a theoretical foundation.

aquaculture; bacteriophage; phage therapy; antibiotic resistance

Jul. 25, 2022

Q939.48

A

1000-3096(2022)11-0160-07

10.11759/hykx20220725001

2022-07-25;

2022-09-13

新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目(2021D01A18)

[The Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2021D01A18]

龔夢馨(1994—), 女, 新疆喀什人, 助教, 碩士, 主要從事噬菌體研究, E-mail: mercyxin@163.com; 李明源,通信作者(1984—), E-mail: mingyuan_lee@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)