小麥吸漿蟲小熱激蛋白基因Hsp21.9的克隆及在滯育過程與溫度脅迫下的表達特性

古麗旦，劉洋，李方向，成衛寧

小麥吸漿蟲小熱激蛋白基因的克隆及在滯育過程與溫度脅迫下的表達特性

古麗旦1，劉洋1，李方向2，成衛寧1

1西北農林科技大學植物保護學院/農業農村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，陜西楊凌 712100；2西安市農業技術推廣中心，西安 710061

【】小麥吸漿蟲（）是最重要的小麥害蟲之一，滯育使其度過酷暑和嚴寒。本研究旨在探討小麥吸漿蟲小熱激蛋白（small heat shock protein，sHsp）基因在滯育中的作用?！尽坷肦ACE和RT-PCR技術從小麥吸漿蟲滯育前幼蟲中克隆全長cDNA序列；利用生物信息學軟件對其核苷酸和編碼蛋白特性進行分析；采用RT-qPCR技術分析在滯育進程（滯育前、滯育、滯育后靜息期和滯育后發育）不同階段幼蟲及夏滯育幼蟲在短期（≤120 min）極端高溫（35—50℃) 和越冬幼蟲在短期（≤120 min）極端低溫（0—-15℃）脅迫下的表達模式；通過大腸桿菌原核表達系統誘導表達及純化其編碼蛋白，采用吸光值法測定重組蛋白抑制豬心蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）熱聚沉的能力?！尽靠寺～@得了cDNA全長為1 087 bp的小麥吸漿蟲，命名為（GenBank登錄號：KT749988），其開放閱讀框長度為582 bp，編碼193個氨基酸，其中谷氨酸含量最高（12.4%），半胱氨酸含量最低（0.5%）；預測的蛋白分子量為21.9 kD，等電點為5.67。SmHsp21.9氨基酸序列具有小熱激蛋白家族典型的-晶體結構域，該結構域由6個-折疊組成，其在空間上形成-三明治結構。蛋白序列相似性和系統進化分析表明，SmHsp21.9蛋白與長角亞目昆蟲搖蚊（）Hsp27的相似性最高、親緣關系最近。RT-qPCR分析結果表明，小麥吸漿蟲滯育不同時期幼蟲表達量存在顯著差異，進入滯育后表達量顯著降低，10月后逐漸升高，滯育后靜息階段的12月和翌年1月顯著高于其他季節。與未處理的對照相比，35—45℃高溫、-5—-10℃低溫處理可顯著誘導越夏、越冬幼蟲的表達，以30—60 min處理誘導效果較明顯；高于50℃或低于-15℃誘導效果不明顯。獲得的SmHsp21.9重組蛋白可顯著抑制MDH在高溫（43℃）下聚集，具有顯著的分子伴侶活性?！尽啃←溛鼭{蟲的表達不僅受滯育發育影響，而且受環境溫度的調控，其可能參與滯育的啟動和終止，且與滯育期間的耐熱和耐寒性相關。

小麥吸漿蟲；Hsp21.9；基因克??；滯育；溫度脅迫；基因表達

0 引言

【研究意義】小麥吸漿蟲（）是北半球小麥生產中的重要害蟲[1-2]，同時是一種典型的專性滯育昆蟲。老熟幼蟲脫離麥穗后鉆入土中結繭進入滯育，直至12月大部分個體終止滯育后進入靜息期，翌年3月小麥拔節后破繭恢復發育[3-4]，即滯育不僅使小麥吸漿蟲生活史與小麥物候保持一致，同時使其度過酷暑和嚴寒。探討小麥吸漿蟲滯育進程中熱激蛋白（heat shock protein，Hsp）基因表達與滯育發育與溫度耐受性之間的關系，對闡釋其滯育的分子機理及滯育過程中對逆境的適應機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】面對各種環境脅迫，幾乎所有的生物能夠合成Hsp。Hsp主要通過幫助蛋白質正確折疊，促進變性蛋白降解而發揮分子伴侶的功能。根據分子量大小，Hsp可分為Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHsp）4個主要家族[5-6]。sHsp分子量一般在12—43 kD，是Hsp超家族中分子量變化最大、種類和功能最多樣化的家族[7]。目前從人類和家蠶（）基因組中分別鑒定了10個和16個[8-9]。近年來的研究表明，sHsp不僅參與生物對熱/冷[10-11]、干旱[12]和重金屬[13]等的脅迫，而且與昆蟲發育[14-15]和滯育密切相關，其在滯育中的作用因昆蟲種類和同家族成員的不同有較大差異。例如紅尾肉蠅（）滯育期表達水平顯著高于滯育前和滯育后，與滯育維持及滯育期間的抗寒性有關[16]；其他昆蟲如蔥蠅（）[17]、棉鈴蟲（）和梨小食心蟲（）、也發現了相似結果。然而與之不同，棉鈴蟲和梨小食心蟲進入滯育后下調表達[18-19]，絲光綠蠅（）和叔白顏果蠅（）的表達與滯育無關[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c】前期研究了小麥吸漿蟲和在滯育進程及極端高、低溫脅迫下的表達特點[22]。由于不同成員在昆蟲滯育[18-19]或抵抗溫度脅迫[10]時的作用機制不同，有關小麥吸漿蟲其他成員在滯育發育或極端溫度脅迫中的作用還有待探究。【擬解決的關鍵問題】克隆小麥吸漿蟲，分析其在滯育進程與極端高、低溫脅迫下的mRNA表達模式；通過原核表達系統和蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）熱聚沉試驗研究Hsp21.9重組蛋白的分子伴侶活性，為探明Hsp21.9在小麥吸漿蟲滯育中的作用及適應溫度響應的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

供試蟲源為小麥吸漿蟲滯育前、滯育、滯育后靜息和滯育后發育幼蟲，均采自田間，參考Cheng等[23]的方法獲得。2020年5月，在陜西省興平市大量采集被小麥吸漿蟲嚴重危害的麥穗，剝穗獲得3齡幼蟲作為滯育前樣本，其余麥穗放入在陜西楊凌構建的養蟲圃（34°16′N，108°4′E），為使蟲體快速脫離麥穗和鉆入土中結繭進入滯育，適度澆水。前期研究發現，12月以后從田間采集的結繭幼蟲轉入25℃后，幾乎全部羽化，說明此后它們已終止滯育進入滯育后靜息期[4]。從6月下旬大部分幼蟲進入滯育至翌年2月，每月定期淘土采集滯育（6—11月）和滯育后靜息（12月至翌年2月）幼蟲，3月幼蟲離開繭后采集發育幼蟲。收集的幼蟲每20頭放入2 mL凍存管中液氮速凍，-80℃保存。

1.2 極端高、低溫處理

自然條件下，小麥吸漿蟲幼蟲主要在地下3—10 cm滯育[24]，陜西楊凌此范圍夏季最高和冬季最低溫度分別為30℃和0℃左右，而夏季地表極端溫度常超過50℃，冬季達-15℃。為明確小麥吸漿蟲對極端高、低溫脅迫的響應，將8月采集的滯育幼蟲放入2 mL離心管，分別置于不同溫度（35、40、45和50℃）水浴中處理 1 h和40、45℃水浴中處理不同時間（0、15、30、60和120 min）；12月采集的幼蟲在低溫培養箱中進行不同低溫（0、-5、-10和-15℃）處理1 h和-5、-10℃處理不同時間（0、15、30、60和120 min）。處理結束后樣本液氮速凍，-80℃保存。每處理20頭試蟲，重復3次。

1.3 小麥吸漿蟲Hsp21.9全長序列的克隆

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成 以采集的麥穗幼蟲為樣本，參照RNA simple Total RNA Kit說明書（TIANGEN，北京）提取總RNA，用核酸蛋白濃度測定儀檢測其濃度（OD260/OD280），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取1 μg總RNA，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，大連）反轉錄試劑盒說明書除去基因組DNA后反轉錄合成cDNA第1鏈，-20℃保存備用。

1.3.2 RACE擴增 基于本實驗室獲得的小麥吸漿蟲幼蟲轉錄組中Unigene序列分別設計5′和3′ RACE特異引物（表1），按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase和5′-Full RACE Kit with TAP（Takara，大連）說明進行5′和3′ RACE擴增。Outer PCR反應程序為94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃60 s，25個循環；最后72℃延伸10 min。Inner PCR反應程序除循環數為35外，其余同Outer PCR。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預期大小的條帶用DNA純化回收試劑盒（TIANGEN，北京）回收后連接到克隆pMDTM-19T載體，然后轉化DH5感受態細胞，藍白斑篩選后隨機挑選3個陽性克隆在LB培養基中37℃振蕩培養，菌液PCR鑒定后送英濰捷基（）貿易有限公司測序。

1.3.3 全長序列驗證 將獲得的5′和3′末端序列與轉錄組中的序列用DNAMAN 6.0軟件進行拼接，根據拼接獲得的序列設計特異引物（表1）進行PCR擴增，擴增程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。PCR產物克隆測序步驟同上。

1.4 序列分析和系統進化樹構建

應用在線軟件Expasy（http://www.expasy.org）將克隆獲得的小麥吸漿蟲核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并進行分子量和等電點預測，在線程序ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html）預測開放閱讀框，在線工具Conserved Domains（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白功能域預測，SWISS-MODEL服務器（https://www. swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三維結構預測。應用Blastp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行蛋白序列相似性分析，用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹（Bootstrap：1 000 次）。

1.5 小麥吸漿蟲Hsp21.9在滯育和極端溫度脅迫下的表達分析

1.5.1 RNA提取和cDNA模板的合成 取滯育進程不同階段和高、低溫處理的小麥吸漿蟲幼蟲各20頭，按照1.3.1節的方法提取總RNA并反轉錄合成cDNA。每處理重復3次。

1.5.2 RT-qPCR分析 根據獲得的全長cDNA序列設計定量引物（表1），以小麥吸漿蟲（GenBank登錄號：KR733066）為內參，合成的cDNA為模板，按照SuperReal熒光定量預混試劑增強版（SYBR Green）（TIANGEN，北京）試劑盒說明，在QuantStudio?5實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，Hercules，CA）上進行PCR擴增。20 μL反應體系包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，模板1.0 μL，其余為ddH2O。反應程序為95℃預變性15 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，40個循環；最后從55℃開始，以每循環增加0.5℃后停留10 s，81次循環進行熔解曲線擴增。

1.5.3 數據分析 qPCR反應結束后讀取Ct值，分別以小麥吸漿蟲滯育前和未處理的越夏/越冬幼蟲轉錄水平為基準，采用2-ΔΔCt法[25]計算滯育進程不同階段和高、低溫處理下的相對表達水平，所得數據進行單因素方差分析（＜0.05）和Duncan氏多重比較。

表1 本研究所用引物

酶切位點用下劃線標記 Restriction sites are underlined

1.6 小麥吸漿蟲Hsp21.9的原核表達與純化

以合成的cDNA為模板，利用帶R Ⅰ和dⅢ酶切位點的特異引物（表1）擴增目的基因編碼區，擴增產物連接至pMD-19T載體并轉化DH5感受態細胞，白色菌落振蕩培養后提取質粒并測序驗證。將pMD19-T/SmHsp21.9重組質粒和表達載體pET28a (+)分別進行雙酶切，純化后用T4連接酶連接，轉化DH5感受態細胞，陽性克隆培養后測序。測序正確的重組表達質粒轉化BL21 (DE3)感受態細胞，陽性克隆培養、測序驗證后于含100 μg·mL-1卡那霉素的LB培養基中振蕩培養（37℃、220 r/min）；取5 μL過夜培養的菌液接種至50 mL新鮮的LB培養基中繼續培養，當菌液OD600達到0.6—0.8時，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG誘導蛋白表達，5 h后離心收集菌體；菌體用含0.5 mmol·L-1PMSF的20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）懸浮，0.4 mg·mL-1溶菌酶裂解，液氮反復凍融后在1 200×離心30 min，收集上清和沉淀，15% SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。重組蛋白的變性、復性、純化和濃度測定等參照文獻[26]。

1.7 重組蛋白的分子伴侶活性分析

為明確Hsp21.9重組蛋白是否具有分子伴侶活性，參照Pérez-Morales等[27]的方法分析其抑制豬心蘋果酸脫氫酶（MDH，Sigma，美國）熱聚沉的能力。目的蛋白、牛血清蛋白（BSA，對照）和MDH用1×PBS緩沖液（pH 7.0）分別稀釋至1 μmol·L-1，設3個處理組，即100 μL MDH+100 μL Hsp21.9重組蛋白、100 μL MDH+100 μL BSA和200 μL MDH。各處理置于溫度為43℃的酶標儀中，分析360 nm處70 min內吸光值的變化。重復3次。

2 結果

2.1 小麥吸漿蟲Hsp21.9 cDNA特征

通過RACE-PCR技術克隆獲得了cDNA全長為1 087 bp的小麥吸漿蟲（，GenBank登錄號：KT749988）（圖1）。開放閱讀框（ORF）長度為582 bp，編碼193個氨基酸，預測的蛋白分子量為21.9 kD，等電點為5.67；5′和3′非編碼區（UTR）長度分別為100 和405 bp，其中3′-UTR具有真核生物典型的多聚腺苷酸信號（AATAAA）和PolyA結構。氨基酸組成分析表明，該蛋白由19種氨基酸組成，其中谷氨酸（Glu，E）含量最高（24個），占12.4%；半胱氨酸（Cys，C）含量最低（1個），占0.5%。保守結構域搜索顯示，SmHsp21.9具有sHsp家族典型的-晶體結構域（第59—137位氨基酸）和IXI基序（第149—151位氨基酸）。

起始密碼子和終止密碼子用方框標注，多聚腺苷酸位點用下劃線表示，α-晶體結構域用陰影表示，IXI基序用橢圓標注

二級結構預測顯示，SmHsp21.9-晶體結構域由6個-折疊和2個-螺旋組成，它們分別包含46和6個氨基酸，各占58.2%和7.6%。利用SWISS-MODEL同源建模服務器，以斑馬魚（）-晶體蛋白（PDB ID: 3n3e.1A）為模板對其三維結構進行預測，發現該蛋白以二聚體形式存在，每個單體中6個反向平行的-折疊構成-三明治結構（圖2）。

2.2 SmHsp21.9氨基酸序列相似性和進化分析

將SmHsp21.9與來自于雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲的其他20種sHsp氨基酸序列進行Blastp比對，發現SmHsp21.9與同目長角亞目搖蚊（）Hsp27（AGJ98435.1）一致性最高，為59.0%，與地中海實蠅（）Hsp23（XP_ 004523813.1）橘小實蠅（）Hsp23（XP_011198111.1）銅綠蠅（）Hsp23（KNC34287.1）、黑腹果蠅（）Hsp26（XP_017121953.1）和蔥蠅Hsp23（ADX36150.1）的一致性為50.9%—53.9%，與其他昆蟲同源蛋白（包括同亞目的岡比亞按蚊（）Hsp20.9）的一致性為36.2%—49.6%?；卩徑臃嫿⊿mHsp21.9與20種同源蛋白的進化關系，結果（圖3）顯示系統樹分為4支，即雙翅目、鱗翅目、膜翅目和包含不同目昆蟲（包括岡比亞按蚊家蠅（）家蠶和大蜜蜂（））sHsp的直系同源族，雙翅目中，SmHsp21.9與搖蚊親緣關系最近，與氨基酸序列比對和昆蟲傳統分類結果一致；同時發現同目中，同物種sHsp間的親緣關系比與其他物種間的近。

N和C分別表示N端和C端，藍色和綠色片層表示兩個單體的β-折疊結構，箭頭表示氨基酸序列由N端到C端，紅色部分為α-螺旋

圖3 SmHsp21.9與其他昆蟲sHsp系統進化關系

2.3 小麥吸漿蟲滯育進程中SmHsp21.9表達量變化

對小麥吸漿蟲滯育前（5月）、滯育（6—11月）、滯育后靜息（12月至翌年2月）和滯育后發育（翌年3月）幼蟲的表達量分析結果（圖4）表明，滯育進程中表達量存在顯著差異。滯育前較高，入土進入滯育后（6月）顯著降低，僅為滯育前的12%；9月之前維持在較低水平，但是10月后逐漸升高，大部分幼蟲終止進入滯育后靜息期的12月和1月達到最高（滯育前的2.89—3.27倍），顯著高于其他階段；2月后表達量顯著降低，恢復發育后降到滯育前的水平。

2.4 短期極端高溫對越夏幼蟲SmHsp21.9表達的影響

由圖5-A可知，35—45℃高溫處理1 h可顯著誘導越夏幼蟲的表達，以40℃處理的誘導效果最明顯，表達量為對照（未處理幼蟲）的4.43倍，其次為45℃處理，表達量為對照的3.22倍；然而50℃處理的表達量與對照差異不顯著。同時分析了40℃和45℃處理不同時間對表達的影響，結果（圖5-B）表明，15—120 min處理均顯著誘導的表達，但不同處理時間之間表達量差異顯著。60 min處理范圍內，隨著時間的延長，表達量逐漸升高，60 min處理的表達量顯著高于其他處理。

2.5 短期極端低溫對越冬幼蟲SmHsp21.9表達的影響

由圖6-A可知，不同低溫處理1 h的越冬幼蟲表達量差異顯著，其中-5℃處理的表達量最高，為對照（未處理幼蟲）的5.85倍，顯著高于其他處理；其次為-10℃，表達量為對照的3.41倍；0℃和-15℃處理與對照差異不顯著。同時分析了-5℃和-10℃處理不同時間對表達的影響，結果（圖6-B）表明，-5℃下，30和60 min 處理的表達量顯著高于其他處理，其次為15 min處理，90 min處理的表達量與對照差異不顯著；-10℃下，60 min處理的表達量顯著高于對照和15 min處理，其他處理間差異不顯著。

圖中數據為平均值±標準誤，柱上不同小寫字母表示經Duncan氏多重比較后差異顯著（P＜0.05）。圖5、圖6同

CK：未處理的對照The untreated control。圖6同The same as Fig. 6

圖6 不同低溫處理1 h（A）和-5、-10℃處理不同時間（B）的小麥吸漿蟲越冬幼蟲SmHsp21.9相對表達量

2.6 SmHsp21.9的原核表達與分子伴侶活性分析

將成功構建的原核表達重組質粒pET28a(+)/ SmHsp21.9轉入BL21感受態細胞，經IPTG誘導表達后用15% SDS-PAGE檢測（圖7），發現重組蛋白以包涵體形式存在（泳道3）；重組蛋白經變性、復性和純化后在約25 kD（包括His標簽）處出現單一條帶（泳道4），表明獲得了較高純度的融合蛋白。

為明確SmHsp21.9蛋白是否具有保護細胞免遭高溫脅迫的分子伴侶功能，應用吸光值法測定了其抑制豬心蘋果酸脫氫酶（MDH）熱聚沉的能力（圖8）。MDH在43℃孵育時，360 nm處吸光值不斷升高，表明發生明顯的熱聚沉反應[26]，當與無分子伴侶活性的牛血清蛋白（BSA）等摩爾濃度混合時吸光值快速上升，熱聚沉速度更快。但當混入等摩爾濃度的SmHsp21.9時，吸光值非常低，說明其顯著抑制MDH熱聚沉，具有顯著的分子伴侶功能。

M：蛋白分子量標準molecular weight marker；1：未誘導的蛋白復合物un-induced pET28a (+) /SmHsp21.9；2：IPTG誘導的蛋白上清supernatant of pET28a (+) /SmHsp21.9 after induction by IPTG；3：IPTG誘導的蛋白包涵體inclusion body of pET28a(+) /SmHsp21.9 after induction by IPTG；4：純化后的融合蛋白purified pET28a (+)/SmHsp21.9

圖8 蘋果酸脫氫酶熱聚沉分析中SmHsp21.9的分子伴侶活性

3 討論

3.1 SmHsp21.9具有sHsp家族典型的結構特點

本研究成功克隆了小麥吸漿蟲全長序列，其編碼蛋白僅含有1個半胱氨酸，但富含谷氨酸，這與已報道的多數伴侶蛋白半胱氨酸含量較少的結論相一致[28]；研究表明谷氨酸能夠提供額外的靜電引力維持蛋白質在高溫下的穩定性[29]。SmHsp21.9蛋白不僅與同目長角亞目昆蟲sHsp序列相似性最高，親緣關系最近，而且與已報道的多數昆蟲sHsp一樣，包含-晶體結構域[30]，且其富含-折疊，在空間上形成-三明治結構。-結構對sHsp的分子伴侶及對底物蛋白的特異性結合是十分重要的，-三明治結構對于低聚物的形成十分必要[31]，說明該基因屬于-晶體/sHsp家族，在進化中結構高度保守，即具備在高溫下發揮分子伴侶作用的條件。

3.2 SmHsp21.9的表達與小麥吸漿蟲滯育啟動、終止和20E滴度相關

小麥吸漿蟲的表達與滯育進程相關。滯育啟動后表達量顯著下調，9月前的滯育維持期表達量一直很低，10月后隨著田間溫度的降低，滯育終止率的提高表達量逐漸升高，所有個體終止滯育進入滯育后靜息（低溫靜息）階段的初期（12月至翌年1月）[4]表達量達到最高，即該基因表達量變化與滯育的啟動和終止緊密相關。該結論與蛀莖夜蛾（）在滯育期表達量較低，滯育終止后表達量顯著升高[32]的結論相一致。小麥吸漿蟲滯育和滯育后靜息幼蟲均以結繭形式存在[4]，二者在形態上無法區分，故可以表達量變化作為判斷滯育終止、區分兩種狀態的分子指標。

昆蟲發育和滯育受激素調控，而20E是調控昆蟲發育和滯育最重要的激素之一。有研究表明，在昆蟲發育中發揮作用，其在發育中的表達受20E的調控，如地中海實蠅[33]、中華蜜蜂（）[34]和甜菜夜蛾（）、[35]。本實驗室前期研究發現，小麥吸漿蟲進入滯育后20E滴度顯著降低，12月和翌年1月的低溫靜息階段顯著高于滯育前、后和滯育期其他階段[36]，即與該蟲滯育進程表達變化趨勢相一致，故此認為在小麥吸漿蟲滯育中的表達可能受20E調控。

3.3 SmHsp21.9在小麥吸漿蟲抵御溫度脅迫中發揮作用

大量研究表明，昆蟲受到極端環境尤其熱、冷脅迫后表達量會迅速提高，在昆蟲抵抗熱、冷脅迫中發揮著重要作用。如40℃以上高溫處理（≤2 h）可迅速提高中華稻蝗（）/[37]和赤擬谷盜（）[38]的表達量，說明在中華稻蝗和赤擬谷盜抵抗高溫脅迫中起到一定作用。-10℃低溫處理1 h可誘導白蠟蟲（）的表達[39]；紅尾肉蠅在低溫下的上調表達提高了越冬蛹的存活率[16]。本研究發現，短期（≤ 2 h）極端高溫（≥35℃）、低溫（≤-5℃）脅迫可顯著誘導小麥吸漿蟲越夏、越冬幼蟲的表達，但隨著溫度的進一步升高、降低或者暴露時間的延長，誘導效果不明顯或者下降，說明夏季、冬季通過農事操作（如翻地）將吸漿蟲幼蟲從地下翻到地表時，可能在機體抵御一定程度的短期極端地面溫度脅迫中發揮作用，SmHsp21.9抑制MDH熱聚沉的能力說明其具有保護細胞免遭高溫脅迫的分子伴侶功能。

4 結論

小麥吸漿蟲的表達不僅受滯育發育影響，而且受環境溫度的調控，其在滯育中的表達與滯育啟動和終止相關；極端高、低溫脅迫可誘導越夏、越冬幼蟲的表達，可顯著抑制MDH熱聚沉，說明該基因與滯育期的耐熱和耐寒性相關。

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Cloning of Small Heat Shock Protein Geneand its Expression Characteristics during Diapause and Under Temperature Stresses

GU LiDan1, Liu Yang1, Li FangXiang2, CHENG WeiNing1

1College of Plant Protection,Northwest A&F University/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern Loess Plateau, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yangling712100, Shaanxi;2Xi’an Agricultural Technology Extension Centre, Xi’an 710061

【】The wheat blossom midge(Diptera: Cecidomyiidae), one of the most important wheat pests, undergoes obligatory larval diapause to survive adverse temperature extremes during hot summers and cold winters. This study aims to explore the potential roles of small heat shock protein (sHsp) gene.【】 RACE and RT-PCR technologies were used to clone the full-length cDNA offrompre-diapause larvae. Bioinformatics programs were used to characterize the nucleotide and amino acid sequence of cloned. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to determine the mRNA expression level of, as well as over-summering larvae exposed to short-term (≤120 min) heat stress (35-50℃) and over-wintering larvae exposed to short-term (≤120 min) cold stress (0 to -15℃). The recombinant Hsp21.9 proteinwas expressed byprokaryotic expression technology, and then purified. The activity of bacterially expressed recombinant proteins to suppress thermal aggregation of pig heart mitochondrial malate dehydrogenase (MDH) was determined by colorimetry.【】The full-length cDNA of() obtained was 1 087 bp (GenBank accession number: KT749988), which contained a 582 bp open reading frame (ORF). The predicted ORF encoded a protein of 193 amino acids of which the content of glutamic acid (12.4%) was the most, and the content of cysteine (0.5%) was the least. The estimated molecular weight and isoelectric point were 21.9 kD and 5.67, respectively. The amino acid sequence of SmHsp21.9 contains typical-crystallin domain of the sHsp family. The domain consists of six-sheets, which forms a-sandwich structure. Sequence alignment and phylogenetic analysis suggested that SmHsp21.9 displayed the highest amino acid identity and the closest relationship to Hsp27 from the Nematocera. RT-qPCR indicated thatexpression differed significantly among different diapause stages. The expression level was decreased after the initiation of diapause, gradually increased in October, and peaked in early-to-mid phase of post-diapause (December and January). Compared with the untreated control, the expression level ofwas significantly induced in over-summering larvae exposed to heat stress (35-45℃) or over-wintering larvae exposed to cold stressed (-5 to -10℃), but temperature extremes i.e. as high as 50℃ or as low as -15℃ failed to do so. The treatment duration also affected transcript levels of, with the maximum value at 30-60 min. Recombinant SmHsp21.9 proteins obtained significantly prevented heat-induced (43℃) aggregation of MDH, suggesting its significant molecular chaperone functionality.【】The expressionofis regulated not only by diapause development, but also by environmental temperature.might be involved in initiation and termination of diapause, and heat/cold tolerance during diapause in.

; Hsp21.9; gene cloning; diapause; temperature stress; gene expression

2022-07-25；

2022-09-08

國家自然科學基金（31371933）、陜西省重點研發計劃（2020NY-059）

古麗旦，E-mail：826185856@qq.com。通信作者成衛寧，E-mail：cwning@126.com

（責任編輯 岳梅）