干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量和蛋白質含量變化的全基因組關聯分析

胡盛，李陽陽，唐章林，李加納，曲存民，劉列釗

干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量和蛋白質含量變化的全基因組關聯分析

胡盛，李陽陽，唐章林，李加納，曲存民，劉列釗

西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715

【】干旱是甘藍型油菜生長發育過程中一種常見的非生物脅迫，嚴重影響了其產量和品質。聯合全基因組關聯分析和轉錄組差異表達分析，篩選干旱脅迫條件下影響甘藍型油菜籽粒含油量和蛋白質含量變化的候選基因，為解釋干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量及蛋白質含量的變化提供理論基礎。【】利用旱棚盆栽方式模擬干旱脅迫環境，使用183份甘藍型油菜構成的自然群體，于2019和2020年在模擬干旱脅迫條件下收獲2年的籽粒，并進行籽粒含油量以及蛋白質含量的測定，將得到的表型數據與60K芯片的基因型數據（包含34 103個SNP）進行全基因組關聯分析，同時，結合相同處理下花后不同干旱時間段（30、40和50 d）的籽粒轉錄組差異基因數據，篩選共有基因，并利用甘藍型油菜和擬南芥數據庫注釋信息、已報道的相關文獻和轉錄組差異基因表達水平鑒定與干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量及蛋白質含量變化相關的候選基因。【】通過對2年間籽粒含油量和蛋白質含量的分析，發現材料重復性較好，干旱脅迫造成甘藍型油菜籽粒的含油量下降，蛋白質含量上升；全基因組關聯分析得出的最佳模型主要為一般線性模型下的Q或na?ve模型，共檢測出38個顯著關聯位點（＜1/31597或＜1/31278），主要分布在A03（6個）、A04（8個）和C03（8個）染色體，各位點分別對含油量和蛋白質含量變化的貢獻率均超過10%，其中含油量變化位點最大貢獻率為23.97%，蛋白質含量變化位點最大貢獻率為22.21%。通過整合全基因組關聯分析和轉錄組分析，篩選出256個共有基因，根據基因注釋和文獻報道鑒定出與干旱脅迫下含油量及蛋白質含量變化相關的25個候選基因，其中包含轉錄因子（如bZIP transcription factor GBF6、TALE transcription factor ATH1、MYB-like Domain transcription factor MYBD、NAC transcription factor ANAC029和ERF transcription factor ERF111）、相關激酶（如與油脂相關的蛋白激酶CIPK9、水分脅迫響應激酶PIP5K1和代謝相關激酶PFK7）、相關蛋白（如與油脂相關轉運蛋白ABCA9、與蛋白相關的存儲蛋白CRU3、脅迫響應蛋白HUP26和M10、葉綠體蛋白DG238和CP12）等，涉及生長發育、光合反應、物質運輸等多個生物學過程。【】鑒定出25個相關候選基因，可能響應干旱脅迫，并影響油菜籽粒蛋白質和含油量的積累。

甘藍型油菜；干旱脅迫；含油量；蛋白質含量；候選基因

0 引言

【研究意義】干旱缺水是陸生植物經常遭受的一種環境脅迫，也是影響農林業生產的重要因素之一，特別是在中國干旱和半干旱地區[1]。據估計，全球約有40%的地區受到干旱的影響，而且還會隨著氣候的變化而加劇[2]。干旱作為非生物脅迫的一種，對作物生長發育的各個時期均有不同程度的危害[3]，如種子萌發期受旱，容易造成發芽率低，出苗不齊[4]；苗期受旱，光合性能下降，生長減緩[5]；特別是花期受旱，普遍造成花粉活力弱，降低結實率和產量水平，如Yang等[6]發現水稻在花期受到干旱后會明顯降低其籽粒產量，相關生理性狀也會顯著降低；Joshan等[7]發現油料作物紅花在花期受到干旱脅迫后，其種子油脂成分含量會發生改變，軟脂酸和硬脂酸等飽和脂肪酸顯著增加，亞油酸含量減少，從而降低了油料品質。甘藍型油菜作為中國重要油料作物之一，是中國食用植物油的主要來源。中國植物油自給率嚴重不足，而干旱脅迫又嚴重影響菜籽油的產量和品質，對中國食用油供給安全造成重大影響[8-9]。因此，模擬干旱脅迫環境，篩選耐旱種質，鑒定相關候選基因，對保障菜籽油產量和品質具有重要意義。【前人研究進展】基于高通量測序和DNA芯片分析技術的完善以及成本的降低，全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）是目前研究復雜數量性狀的有效方法，已在棉花[10]、大豆[11]、水稻[12]等諸多作物中廣泛應用。甘藍型油菜作為異源四倍體，遺傳背景復雜，目前，利用關聯分析挖掘出大量與產量、品質、抗逆等復雜數量性狀相關的候選基因，為后續基因功能驗證及等位基因利用提供依據。Xiao等[13]基于高通量重測序技術，對588份甘藍型油菜種質的含油量進行全基因組關聯分析，鑒定出17個顯著SNP位點，并結合轉錄組數據，篩選出7個與含油量及蛋白質含量相關的候選基因。Tang等[14]對370份油菜籽粒12個性狀進行測定，結合60K芯片數據進行全基因組關聯分析，檢測到7個與種子含油量和蛋白含質量相關的SNP，并在其中篩選到5個相關候選基因。Khanzada等[15]利用15% PEG6000模擬干旱處理，獲得228份材料的耐逆指數和敏感指數，利用關聯分析鑒定出與耐旱相關的85個候選基因。Zhang等[16]利用PEG6000模擬環境脅迫對140份甘藍型油菜種質進行處理，全基因組關聯分析鑒定出16個顯著位點，并結合RNA測序結果聯合篩選出79個候選基因，其中8個基因與擬南芥的抗旱基因同源相關。【本研究切入點】鑒于甘藍型油菜異源四倍體復雜的遺傳背景和種子發育復雜的生物學過程，籽粒性狀的遺傳研究一直是油菜遺傳育種研究的重點和難點[14]。前期研究多數是對正常生長發育過程籽粒性狀的遺傳定位研究，而對干旱逆境脅迫下籽粒品質性狀開展遺傳定位和候選基因篩選的鑒定工作較少。【擬解決的關鍵問題】本研究以183份甘藍型油菜作為分析群體，利用包含34 103個SNP標記的60K芯片數據，以干旱脅迫條件下2年油菜籽粒含油量以及蛋白含量變化為切入點進行全基因組關聯分析，同時，結合花后不同干旱時段籽粒轉錄組數據，聯合篩選出與干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量及蛋白質含量變化相關的候選基因，為甘藍型油菜耐旱育種研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料的種植及處理

從國內外收集的183份甘藍型油菜種質，包括地方性品種、育成材料和高代材料，其中，國內164份，主要來源于重慶、湖北、四川、江蘇等地區，國外19份，來源于德國、加拿大、朝鮮等國家（電子附表1）。于2019年和2020年在重慶市西南大學油菜工程技術研究中心，以盆栽的方式種植在基地旱棚中，光周期同室外條件。每盆稱取約6 kg混勻土（田間土﹕腐殖土=3﹕1），幼苗前期采取定量澆水的辦法培養至四葉一心期，每個材料選擇大小、長勢一致的3盆進行干旱處理（drought stress，DS），3盆進行正常灌溉（well watering，WW），在抽薹、開花期間各補充一次水溶肥，等量施用。利用土壤水分測定儀（浙江托普儀器有限公司TZS-1K型）監測含水量，DS組在6%—10%，WW組保持在20%—24%，其他條件與大田生產完全一致。

1.2 籽粒性狀的測定及處理

使用福斯（FOSS）近紅外分析儀（NIRS DS2500）對所收獲2年自交種籽粒進行品質測定，3次重復，分析含油量和蛋白質含量變化情況。利用IBM SPSS Statistics 25對表型數據進行統計學分析。

將相對應材料處理值與正常值（DS/WW）的比值作為該材料的耐旱指數，使用耐旱指數作為表型數據的指標，用于后續的關聯分析。

1.3 全基因組關聯分析

利用Illumina公司開發的油菜60k芯片對國內油菜育種單位收集的種質資源分析獲得的基因型數據[17]，按照Qu等[18]方法對標記進行質控，篩選并刪除等位基因頻率（allele frequency，AF）小于0.05，大于1.0，且SNP得率（call frequency）小于80%的標記，結合2年所獲得的可用材料，分別保留31 597個SNP標記和31 278個SNP標記用于后續分析。

利用Tassel 5.2.80軟件[19]對處理好的數據進行關聯分析，分別在一般線性模型（general linear model，GLM）下進行PCA（主成分）、Q、na?ve模型分析以及混合線性模型（mixed linear model，MLM）下的K、K+PCA、K+Q模型分析，利用R語言CMplot包對6個模型下的結果繪制Quantile-quantile（QQ）圖，并分析比較觀測值與期望值得出最佳模型，利用最佳模型繪制曼哈頓（Manhattan）圖，顯著性SNP位點篩選的閾值設定為“1/所使用的標記”。

1.4 差異基因分析

使用重慶市油菜工程技術中心提供的在花后不同時段干旱脅迫（30、40和50 d）的籽粒轉錄組數據[20]。轉錄組材料為油菜工程技術中心提供的重組自交系群體中6份含油量不同的株系，處理方式同1.1，取材時間定于花期后30、40和50 d，分別收取對照和處理植株的角果，于冰上小心剝取籽粒，將同一階段的材料籽粒等量混勻，置于-80℃保存，送至北京百邁克生物科技有限公司進行測序。利用Cufflinks2.0.0軟件[21]將干旱處理組和正常灌溉組的數據進行差異分析，篩選條件為差異倍數log2|(fold change)|≥1.7，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.01，得到各個比較組的差異基因。

1.5 候選基因鑒定

參考LD分析[22]的衰減距離（上下游500 kb），根據關聯分析得到的顯著SNP標記篩選候選區間內的所有基因，并聯合轉錄組數據整理得到的差異基因，將同時篩選得到的初步定位相關基因。根據已公布的甘藍型油菜基因組信息（“Darmor-Bzh”，BRAD (brassicadb.cn)）以及擬南芥基因組信息（“Araport11”, TAIR-Home Page (arabidopsis.org)），進一步進行信息比對和功能注釋，尋找注釋信息中有關于干旱脅迫、含油量變化或蛋白質含量變化相關的基因，并查詢相關已報道過的文獻，最終確認篩選的甘藍型油菜在干旱脅迫下響應籽粒含油量及蛋白質含量變化的候選基因。

2 結果

2.1 籽粒含油量及蛋白質含量分析

通過對2019年收獲的162份可用材料和2020年收獲的128份可用材料進行近紅外數據分析（表1），與正常灌溉組（WW）相比，干旱處理組（DS）的含油量水平顯著降低，蛋白質含量水平顯著升高，2年的變化趨勢一致，同時，變異系數結果均小于10，說明群體數據分布較為集中，趨勢較好。相關性分析結果顯示（表2），同一年份的各處理間相關性顯著，而且含油量和蛋白質含量之間呈顯著負相關，而不同年份各性狀之間的相關性較弱。對耐旱指數分布作直方圖（圖1），發現2份低含油量高蛋白質含量材料（編號129和編號74）和2份高含油量低蛋白質材料（編號63和編號33）。

表1 2019及2020年干旱脅迫及正常處理下籽粒含油量和蛋白質含量統計分析

WW：正常灌溉；DS1、DS2分別指同年份處理的2個重復；**表示差異顯著（p＜0.01）。下同

WW: well watering; DS1 and DS2 refer to two repeats in the same year; ** represents the significant difference (p＜0.01). The same as below

表2 2年各處理間籽粒蛋白質和含油量的相關性分析

2.2 全基因組關聯分析

根據不同算法，將6種模型（PCA、Q、na?ve、K、K+PCA、K+Q）下對含油量和蛋白質含量響應干旱脅迫變化關聯分析得到的結果繪制QQ圖，并對-log10()觀察值與期望值的相關程度來選擇對應的最佳模型，在最佳模型下，利用CQ2019的31 597個和CQ2020的31 278個SNP標記，進行Manhattan圖的繪制，并以值小于定義閾值（1/31 597和1/31 278）的點作為顯著關聯SNP（圖2）。

對含油量變化進行分析，在2019和2020年的4個處理中，共重復篩選出16個顯著性SNP標記，蛋白質含量變化在2年4個處理下共重復篩選出22個顯著性SNP標記（表3）。其中，位于C03染色體上的Bn-scaff_16755_1-p1427195標記在2019年處理二的含油量和蛋白質含量變化中重復篩選到，A03染色體上的Bn-A03- p21505530與Bn-A03-p21505363間僅167 bp，其余部分標記（Bn-scaff_18322_1-p2147199與Bn-scaff_18322_1-p2150739、Bn-A08-p18820218與Bn-A08-p18827698、Bn-A06-p5279490與Bn-A06- p5260549）之間距離為2—9 kb范圍內。所有顯著性標記對不同年份間的含油量以及蛋白質含量變化的貢獻率均超過10%，部分達到20%以上，說明這些標記都可以考慮作為可靠顯著性標記。

A—H：2019年和2020年含油量和蛋白含量耐旱指數頻率分布圖；I—L：2019年和2020年含油量和蛋白含量變化共有極端材料，藍黃柱狀圖之間的數據表示該材料的耐旱指數

2.3 候選基因鑒定

根據GWAS篩選得出的表3數據，對應油菜基因物理位置信息，共找到3 681個基因，聯合花后不同干旱時段籽粒轉錄組數據整理得出6 571個差異基因，篩選出256個共有相關基因（圖3），參照油菜和擬南芥的基因組注釋信息以及相關文獻，從注釋信息以及報道的文獻中進一步篩選與含油量變化、蛋白質含量變化以及干旱脅迫相關的基因或擬南芥同源基因，參考轉錄組差異基因的表達水平變化，最終篩選出25個與干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量和蛋白含量變化相關的主要候選基因（表4），這些基因主要包括編碼一些與油脂以及蛋白相關的激酶和蛋白，功能涉及光合作用、物質儲藏、脅迫響應等多個方面，其中包含一些重要轉錄因子，如、、、等。同時，根據該25個候選基因在轉錄組中的表達水平熱圖（圖4），可以發現這些基因在不同時段的對照和處理中均有不同的表達，且在某一階段內出現顯著程度的表達差異，如、、等在干旱處理花后30 d就有顯著表達差異；、、等在干旱處理花后40 d出現顯著表達差異；、、等則在50 d出現顯著差異，說明這些基因可能在不同的時間點對干旱處理條件下籽粒含油量和蛋白質含量變化起到一定的調控作用。

表3 干旱脅迫下油菜籽粒含油量和蛋白質含量變化顯著關聯的SNP位點

DAF30、DAF40、DAF50：分別代表花后30、40和50 d的差異基因集

3 討論

3.1 GWAS和轉錄組聯合分析

非生物脅迫影響作物的生長發育，特別是干旱脅迫，導致作物的產量和品質大幅降低。甘藍型油菜作為中國主要的重要油料作物，有著不可或缺的價值地位[22-23]。隨著氣候的變化，干旱脅迫對甘藍型油菜的生產造成了嚴重的影響[24-25]。因此，開展干旱脅迫條件下甘藍型油菜含油量以及蛋白質含量變化相關性狀的位點以及基因挖掘對增強甘藍型油菜在干旱環境下耐受性、提高籽粒產量和品質具有重要意義。

CK30、CK40、CK50：對照組花后30、40和50 d候選基因表達水平；DS30、DS40、DS50：干旱處理組花后30、40和50 d候選基因表達水平

Choudhury等[26]利用90K芯片數據對335份小麥材料進行抗病性全基因組關聯分析，并在一般線性模型下的K模型中鑒定出4個重復位點，為小麥抗病育種提供依據；Zheng等[27]利用全基因組關聯分析對水稻籽粒寬度變異程度進行研究，并在一般線性模型和混合線性模型下共同鑒定出7個候選位點，為候選基因篩選給出思路；Pace等[28]利用多態性標記對玉米384個自交系進行GWAS分析，分別在一般線性模型和混合線性模型下鑒定出263個和4個與根系發育性狀相關的顯著標記，并說明結合一般線性與混合線性2種模型的計算方式才是關聯分析優選的方案。這些研究均將全基因組關聯分析中的GLM和MLM的結果比較整合，并從中找出最相關的顯著位點，極大地控制了假陽性的情況。本研究也利用2種模型用于關聯分析，最終得到的最佳模型均在一般線性模型下產生，并得到了較多的顯著SNP標記（38個）和較大的貢獻率（10.82%— 23.97%）。另外，Liu等[29]對521份油菜籽粒含油量的全基因組關聯分析中鑒定出50個顯著相關位點，其中，Bn-A03-p21298611、Bn-A04-p18354325、Bn-A05- p21491115、Bn-scaff_16888_1-p1561387等位點與本研究中Bn-A03-p21357849、Bn-A04-p18595858、Bn-A05- p21188442、Bn-scaff_16888_1-p1803454位點存在重疊區間，且Bn-A03-p21357849和Bn-A05-p21188442位點是基于蛋白質含量變化檢測，其原因可能說明含油量和蛋白質含量之間的協同變化可能通過相同位點實現；Fletcher等[30]對甘藍型油菜的耐旱性進行QTL分析，鑒定出5條染色體上多個QTL區間，其中，A03中2個顯著區間與本研究中Bn-A03-p15615278、Bn- A03-p21505530、Bn-A03-p21478889、Bn-A03-p21357849、Bn-A03-p21505363位點存在重疊區間。從抗旱性和含油量相關的分析中均可在本研究中鑒定出部分位點，為位點的可靠性提供了證據。除此之外，為了降低假陽性，研究還利用同等處理條件下的籽粒轉錄組數據，參考了干旱條件下花后30、40和50 d的差異表達基因結果，進一步了解候選基因的表達情況。通過整合GWAS和轉錄組差異分析結果，共找出256個共有基因，這大大縮小了篩選范圍，同時根據注釋信息和報道文獻進一步從中篩選出25個可能與干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量以及蛋白質含量變化相關的候選基因。

表4 候選基因鑒定

3.2 干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒成份變化候選基因分析

甘藍型油菜籽粒是由多成份構成、多通路參與、多基因控制。在以前的一些研究中，Li等[20]對油菜籽粒油體的掃描電鏡觀察和含油量測定發現干旱脅迫會明顯降低油菜籽粒中的油脂含量；油菜籽粒油脂含量的下降是由于環境中干旱和鹽分的影響，這不僅會造成菜籽油的品質下降，還會增加其本身硫代葡萄糖苷和硬脂酸的含量[31-33]；另外，Mohammadi等[34]發現干旱缺水的條件對作物的負面影響還存在于代謝方面，因為合成油的碳水化合物的減少以及體內油脂氧化反應的增加，造成生物體內的合成代謝活動減少，從而造成含油量方面的降低。本研究篩選出部分與含油量相關的基因，其中[35]負責編碼與糖相關的蛋白激酶，能被外傷應激誘導表達，擬南芥中負調控脂質積累，油菜中該基因的過表達也會降低油脂的合成，并且在花后30 d的轉錄組的差異表達的基因中，該基因的表達顯著下降，符合分析的結果；另外，還有一種編碼ABC轉運蛋白的基因[36]，其過表達會增加亞麻薺種子的油脂含量，目前，在油菜中是否也存在這種功能還未得到具體的研究證實，在轉錄水平中，該基因在干旱處理花后40和50 d的表達出現上調，這說明該基因在協調含油量變化中起到一定的作用。除此之外，其他與環境脅迫（ERF111、M10、PIP5K1等）和氧化反應（如HUP26、ACHT5、TRX1等）相關的蛋白在本研究中也有被鑒定，共同解釋干旱脅迫下油菜籽粒含油量降低的原因。

早期研究發現，油料作物中油脂含量和蛋白含量之間存在著負相關關系[37-38]，這與本研究考察的籽粒性狀一致。本研究鑒定出一種種子儲存蛋白CRU3[39]，是油菜籽粒中一種重要的12S球蛋白，主要為籽粒積累氮源，為油菜萌發提供能量。在表達水平上，該基因干旱處理花后30 d的表達水平未表現出明顯變化，但在50 d表現出明顯上調，說明種子的發育后期該基因可能對12S球蛋白的積累起到一定作用。這些也可以認為是籽粒含油量下降的協同原因之一。

ABA作為植物脅迫響應中常見的激素之一，參與調節植物生長發育的眾多方面[40]。本研究鑒定出的部分基因也參與ABA的調控，如ANAC029[41]，一類葉片衰老相關的轉錄因子，能被ABA誘導表達，加速衰老。除此之外，油脂生物合成也離不開光合產物的積累，Tang等[42]發現通過參與葉綠體的發育，調節光合作用，而且過表達該基因會增加種子含油量。轉錄組學[43]和蛋白質組學[44]研究說明不少差異結果富集的通路與光合作用相關，為其參與油脂的積累提供了證據。本研究中也有很多基因和蛋白涉及光合作用，參與葉綠體的發育或響應光信號或與光系統有關，如ATH1、PSB8、DG238、CP12等，這都為干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量下降，蛋白質含量增加提供了一定的參考依據。

4 結論

干旱脅迫造成甘藍型油菜含油量下降，蛋白質含量上升，2年籽粒干旱表型數據的全基因組關聯分析鑒定出38個與干旱脅迫下甘藍型油菜籽粒含油量與蛋白質含量變化顯著關聯的SNP位點，結合干旱處理下花后不同時段的籽粒轉錄組數據，共篩選出256個相關基因，利用甘藍型油菜和擬南芥數據庫的基因功能注釋，參考已報道文獻和差異基因

表達水平，進一步鑒定出可能在干旱脅迫條件下籽粒含油量及蛋白含量變化過程中起重要作用的25個候選基因。

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Genome-Wide association Analysis of the Changes in oil content and protein content under drought Stress inL.

HU Sheng, LI YangYang, TANG ZhangLin, LI JiaNa, QU CunMin, LIU LieZhao

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715

【】 Drought is one of the most adverse abiotic stresses that hinder growth and development ofL., threatening its yield and quality. In this study, we identified the candidate genes that influence oil and protein content changes according to the results of the genome wide association mapping (GWAS) and differentially expressed genes (DEGs) under drought stress in. 【】 A natural population comprising 183lines under drought stress across two years was genotyped with a Brassica 60K Illumina Infinium SNP array to perform GWAS. Combined with drought stressed seed transcriptome data from different treatment periods, the candidate genes related to the changes in oil and protein contents under drought stress were identified. 【】 The analysis showed that the best model for phenotypic data analysis in 2 years was mainly the Q or na?ve model, and a total of 38 significant associated loci were detected (＜1/31597 or＜1/31278). By integrating GWAS and transcriptome results, 256 common genes were selected, and by comparing the database information ofand, 25 related candidate genes were identified. These genes, including transcription factors (e.g., bZIP transcription factor GBF6, TALE transcription factor ATH1, MYB-like Domain transcription factor MYBD, NAC transcription factorANAC029, ERF transcription factor ERF111), related kinases (e.g., PIP5K1, PFK7), related proteins (e.g., seed stores protein CRU3, chloroplast protein DG238 and CP12, stress-responsive proteins HUP26 and M10), are involved in multiple biological processes such as photosynthetic reaction, substance transport, and stress response. For instance, oil-related protein kinase CIPK9, ABCA9 transporter, storage-related protein CRU3, may provide basis for explaining the changes in oil and protein contents ofunder drought stress. 【】 The 25 identified candidate genes may affect the accumulation of protein and oil contents under drought stress during the seed development in.

L.; candidate genes; drought stress; oil content; protein content

2022-08-22；

2022-10-21

重慶市研究生科研創新項目（CYS21122）、國家自然科學基金（31971902，32001509）

胡盛，E-mail：916340758@qq.com。通信作者劉列釗，E-mail：liezhao@swu.edu.cn

（責任編輯 李莉）