IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A與再生障礙性貧血的相關性分析

孔令環,王雪野,邢明雨,呂作福,艾英莉,邵萬艷,魏灼如

(吉林省人民醫院，吉林 長春130021)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是由于原因不明因素引起骨髓造血干細胞和(或)微環境損害，骨髓增生低下，外周血全血細胞減少的一組臨床綜合征，本質上是由免疫異常介導的造血功能障礙疾病。以往認為Th1細胞、Th2細胞介導的異常免疫應答是AA發病機制中的主要環節，另有研究[1]表明Th17分泌的IL-17A在AA的免疫發病機制中占有重要地位。本研究通過IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A等細胞因子水平變化，判斷Th1、Th2、Th17平衡狀態，了解機體免疫功能，進一步探討AA的發病機制，有助于臨床探索新的AA治療方案。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2020年1月至2022年9月吉林省人民醫院血液科收治再生障礙性貧血初治病人54例，其中重型(SAA)25例，非重型(NSAA)29例。SAA組，男11例，女14例，年齡27-87歲，中位年齡58歲；NSAA組，男9例，女20例，年齡18-84歲，中位年齡58歲。免疫抑制劑治療有效組(貧血出血癥狀明顯好轉，不輸血，1個月內血紅蛋白增長30 g/L以上)16例，其中男6例，女10例，年齡21-64歲，中位年齡50歲。按照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》(第3版)[2]，符合再生障礙性貧血的診斷標準。同時，選擇本院健康志愿者30例為對照組，男7例，女23例，年齡29-54歲，中位年齡44歲，均知情同意。

1.2 檢測方法

采用流式細胞術檢測細胞因子。受試者清晨空腹靜脈采血2 ml，EDTA抗凝，離心，血漿凍存在-80℃冰箱。試劑選購BDTMCytometric Bead Array(CBA) Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit;儀器為BD FACSCanto II流式細胞儀。同時常規進行血常規及T淋巴細胞亞群檢測并記錄結果。

1.3 操作步驟

1.3.1制備人Th1/Th2/Th17細胞因子標準品人Th1/Th2/Th17細胞因子標準品是凍干粉，因此實驗前需要重懸并進行梯度稀釋。

1.3.2混合人Th1/Th2/Th17細胞因子捕獲微球 7種捕獲微球分別裝在7個小瓶中(A1-A7)，使用前應將7種微球立即混在一起，混合的捕獲微球按需求移到實驗管中。

1.3.3對熒光試劑處理好的人的Th1/Th2/Th17流式樣本進行檢測 50 μl血漿+50 μl混合微球+50 μl PE抗體，避光3 h,加入Wash Buffer 1 ml,混合離心5 min,棄上清,加300 μl Wash buffer.混勻，上機。用儀器調整微球做儀器條件設置。檢測指標有7個：IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IL-4。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 AA病人外周血中細胞因子水平

NSAA組病人IL-2，TNF-α水平低,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05);NSAA組病人IL-6，IFN-γ/IL-4水平高,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；NSAA組病人IL-10,IL-17A,IFN-γ水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1、2。

SAA組病人外周血中IL-2，IL-10水平低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05);SAA組病人IL-17A，IFN-γ，IL-6，IFN/IL-4水平高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 AA病人IL-2、IL-10、IL-17A、IFN/TI-4水平

表2 AA病人IL-4、IL-6、TNF、IFN、水平

2.2 AA病人免疫抑制劑治療后,有效組IL-2、IL-10、IL-17A、IFN-γ/IL-4水平

AA病人免疫抑制劑治療后IL-2、IL-17A水平減低，與AA組比較差異有統計學意義(P<0.05);IL-10、IFN-γ/IL-4水平與AA組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 AA病人免疫抑制治療前后IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN/IL-4水平

2.3 AA病人細胞因子與血細胞(WBC,HB,PLT,ANC中性粒細胞比例,淋巴細胞比例)相關性

SAA組:IFN-γ與ANC有相關性,r=-0.563,P=0.003;IL-6與ANC有相關性,r=-0.477,P=0.016;Th1/Th2與ANC有相關性，r=-0.444，P=0.026。NSAA組：IL-6與WBC有相關性,r=-0.464,P=0.011;IL-6與淋巴細胞有相關性，r=-0.467,P=0.011。

2.4 AA病人外周血細胞因子之間以及與T淋巴細胞亞群的相關性

NSAA組：IL-10與CD8+T細胞有相關性,r=0.369,P=0.049;IL-10與B淋巴細胞有相關性,r=-0.532,P=0.003;IL-17A與IFN-γ有相關性,r=0.544,P=0.002;IL-2與IL-17A有相關性,r=0.443,P=0.016;IL-2與IFN-γ有相關性,r=0.545,P=0.002;IL-2與IL-4有相關性,r=0.531,P=0.003。

SAA組：IFN-γ與IL-6有相關性,r=0.487,P=0.014;IL-10與IL-6有相關性，r=0.662,P=0.001；IL-2與IL-4有相關性,r=0.463,P=0.02;IL-4與B淋巴細胞有相關性，r=-0.409,P=0.042；IL-4與CD8+T細胞有相關性，r=0.422,P=0.035。

3 討論

AA 的發病與免疫異常密切相關[3-4]。尤其是CD4+T細胞功能紊亂，CD4+T細胞主要分為Th1和Th2。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，主要參加細胞免疫應答。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、和IL-10等，刺激B淋巴細胞增殖并產生抗體，主要介導體液免疫應答過程。IFN-γ和IL-4分別是Th1細胞和Th2細胞發揮功能的關鍵的細胞因子，常用IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2平衡。Th1/Th2平衡是免疫應答的關鍵環節，病理條件下Th1/Th2極化異常或缺陷參與自身免疫性疾病的發生發展。現有研究發現[5-6]，再障患者呈現Th1細胞極化現象，造血負調控因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平增高，Th1/Th2細胞比例明顯失衡。Kaito[7]等通過檢測再障患者IST治療后外周血Th1/Th2細胞比例發現，治療有效者Th1細胞數量、Th1/Th2比例均低于治療無效者，進一步說明Th1淋巴細胞在再障發病中占優勢。結論與本研究一致，AA病人(包括SAA和NSAA病人)Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)均高于對照組，差異有統計學意義。還發現SAA病人Th1/Th2與ANC呈負相關，證明Th1淋巴細胞在再障發病中占優勢；SAA組與NSAA組之間TH1/TH2無顯著性差異，提示Thl細胞的增多與疾病的嚴重性無關。

Th17細胞是一種新的CD4+T細胞亞群，參與炎癥、感染、自身免疫性疾病等多種病理過程[8]。IL-17A是Th17細胞分泌的最具特征性的細胞因子，屬于IL-17細胞因子家族中的一員。IL-17A是一種致炎因子，具有獨立的分化發育調節機制,能誘導巨噬細胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血負調控因子[9]。本研究中，SAA組的IL-17A水平高于對照組，IST治療后明顯降低，與陸翔等[10]報道一致,IL-17A能誘導巨噬細胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血負調控因子,抑制骨髓造血，參與AA病理過程。免疫抑制劑治療后IL-17A水平明顯降低，對骨髓抑制作用減低，造血恢復，所以血紅蛋白濃度升高。IL-17A在SAA與NSAA中表達水平有顯著性差異，所以分泌IL-l7A的Th17細胞與疾病的嚴重性相關。隨著IST治療，IL-l7A水平降低,IL-17在疾病嚴重程度及治療療效中表達不同，提示其可以作為AA診斷及預后的重要指標。

IL-10具有免疫抑制和抗炎作用，通過下調巨噬細胞的抗原呈遞功能，從而抑制Th1細胞產生造血負調控因子如IFN-γ,TNF等，抑制NK細胞活化，下調免疫應答。同李文靜等[11-12]研究一致,本研究中發現AA組病人IL-10水平減低，免疫抑制作用降低，對Th1抑制減低，分泌更多造血負調控因子，抑制骨髓造血功能，促進AA的發生。Asano等[13]觀察IL-10對造血祖細胞生長的影響，發現IL-10能顯著增強CFU-E的形成，或許可以利用IL-10作為AA的支持性治療工具，通過抑制IFN-γ而促進紅系造血島的形成，對AA具有治療作用。

Chen等報道[14],IFN-γ等抑制性因子通過Fas通路、半胱天冬酶和相關促凋亡基因的上調降低造血基因的表達，上調IFN-γ基因增強小鼠凋亡基因表達及活化細胞毒性T細胞，增加造血干細胞和祖細胞破壞。Capone等[15]證明微量內源性IFN-γ即產生強大抑制效應，所以低濃度IFN-γ足以產生骨髓抑制。與本研究相符，通過相關性分析發現SAA病人IFN-γ、IL-6與ANC呈負相關，NSAA病人的IL-6與WBC、淋巴細胞呈負相關；SAA組病人IFN-γ和IL-6水平高于對照組，NSAA組IL-6水平高于對照組；可以認為造血負調控因子IFN-γ和IL-6直接參與了AA疾病的發生過程。本研究中AA病人IFN-γ比例增加，IST治療后比例降低，同報道一致[12]，說明IFN-γ也是AA區別其他血液病所導致的血細胞減少的標志之一。

另外，Dutta等[16]研究證實，骨髓和外周血中，IL-2,TNF-α,andIFN-γ水平均升高，而且PBP和BMP中的3種細胞因子水平均呈正相關。所以檢測外周血中IL-2,TNF-α,and IFN-γ因子水平可以代替骨髓，判斷骨髓造血的抑制程度，更方便臨床觀察和治療。

有研究報道[17]，體外高濃度的IL-2可以提高Treg的數量，提出臨床AA治療除了標準IST外，低劑量和/或低親和力IL-2治療AA的潛在作用，以擴大自體Treg細胞的數量，改善患者的臨床預后。本研究中SAA和NSAA病人IL-2水平均低，免疫抑制劑治療有效組IL-2水平繼續減低。如果能提高AA病人體內IL-2水平或許可以改善體內Treg細胞數量和功能，給AA治療找出一條新思路。

造血的免疫調節因素包括各種細胞及其分泌的細胞因子之間互相調節[18-19]。例如，本研究中NSAA組病人IL-2與IL-17A,IFN-γ，IL-4均呈正相關;IFN-γ與IL-17A、IL-2有相關性；SAA組：IL-6與IFN-γ、IL-10有相關性；IL-4與IL-2有相關性。當造血負調控因子占主導時，骨髓造血功能受抑制，則導致AA的發生；免疫抑制治療后，造血負調控因子減少，則造血恢復。本研究發現，AA病人主要是IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-10、IL-2水平異常，直接或間接參與了造血調控，與骨髓造血衰竭相關，是AA發病機制中的主要環節。調控機體內的白介素水平，或許能成為疾病治療和預防的新途徑。