人參二醇皂苷通過調節上皮間質轉化抑制喉癌細胞的增殖和遷移

石耿隆，趙昀霞，顏如玉，孟 艷，孫宇新*，辛偉紅*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130033；2.吉林大學基礎醫學院 病理生理學系，吉林 長春130021)

喉鱗狀細胞癌占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%[1]，40%的患者在確診時已進展至Ⅲ期或Ⅳ期，復發和轉移是5年內喉癌患者死亡的主要原因[2]。上皮間質轉化(EMT)可增強細胞遷移和侵襲能力[3]。RAS/RAF/MEK/ERK，Wnt/β- catenin等多種信號傳導途徑參與EMT的激活和調控[3]。喉癌的轉移與EMT過程有關，調節EMT信號傳導途徑是減少喉癌轉移性的潛在治療策略[4]。人參二醇皂苷(PDS)是從人參莖葉中提取的屬于四環三萜類的原人參二醇型提取物。PDS及其代謝產物Rb2、Rd、F2、Rh2、Rg3、CK和PPD可有效抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[5]。PDS具有甾環結構，具有地塞米松樣抗炎、抗休克作用。本研究旨在觀察PDS對人喉癌Hep2細胞遷移的影響，報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞、主要試劑盒、儀器

人喉癌細胞系Hep2細胞(吉林大學基礎醫學院前列腺疾病預防和治療研究中心)，PDS(吉林大學自然醫學研究實驗室的專利產品，專利號為ZL98100070.3)，RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Clark Bioscience公司)，地塞米松(山東新華制藥有限公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，二甲基亞砜、蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司)，逆轉錄試劑盒、SYBR實時熒光定量PCR試劑盒(北京寶泰克公司)，BCA蛋白質測定試劑盒(上海碧云天生物有限公司)。β-actin、MMP2、MMP9、E-cadherin抗體(美國Proteintech公司)，N-cadherin、vimentin、β-catenin抗體(北京博奧森公司)。酶標儀(德國Biotek公司)，CFX96實時熒光定量 PCR 儀、蛋白電泳儀和轉膜儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.2 細胞培養

Hep2細胞含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于37 ℃，5%CO2培養箱中常規培養。以5×105的密度將Hep2細胞接種于6孔板中，當細胞達到70%～75%狀態時，細胞分為3組，分別加入100 mg·L-1PDS(PDS組)、100 nmol·L-1地塞米松(DEX組)及等量PBS(CON組)。48 h后收獲細胞，用于后續分析目的蛋白的mRNA和基因的表達水平。

1.3 MTT實驗

將Hep2細胞以每孔約5×103個細胞接種于96孔板中，每組5個復孔，實驗重復3次。當細胞生長達到70%～75%融合時，加入不同濃度的PDS溶液，繼續培養24 h和48 h。結束實驗前每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)孵育4 h后，去上清后加入150 μL二甲基亞砜充分震蕩溶解后，使用酶標儀在490 nm處測量吸光度(A)值，細胞存活率=實驗組A/對照組A×100%。

1.4 劃痕實驗

將Hep2細胞(1×106/孔)接種到6孔板中并保持對數生長直至生長匯合。使用200 μL移液管尖端在細胞層上劃痕，PBS洗滌后用無血清培養基培養，分別在0 h和48 h拍照記錄劃痕寬度。實驗重復3次，應用Image J軟件對劃痕距離進行統計學分析，計算劃痕愈合率=(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.5 HE染色和形態學分析

將載玻片置于24孔板中，并將細胞(1×104)接種在孔板中。將細胞培養24 h后給與相應藥物處理，繼續培養48 h。用無菌PBS洗滌3次3～5 min，用4%多聚甲醛固定20～30 min，進行HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件進行形態學分析，計算細胞面積和周長。

1.6 實時定量PCR

收集各組細胞后用Trizol試劑裂解，根據說明書制備總RNA。應用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。使用2×Plus SYBR qPCR Mix進行實時熒光定量PCR。反應條件為94℃預變性2 min，之后94℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環后，70℃延伸10 min。以GAPDH為內參，并通過2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。特異性引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 Western blotting法

細胞用冷PBS洗滌后應用細胞裂解液細胞，提取各組細胞蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。加入上樣緩沖液后煮沸變性10 min，取30 μg加樣，通過12%SDS-PAGE凝膠電泳，通過濕轉儀器將蛋白轉移至PVDF膜。1×TBST溶液(含5%脫脂奶粉)室溫封閉1 h，加入一抗后4 ℃過夜。TBST洗膜3次，加入二抗，1 h后TBST清洗后加入ECL顯影，凝膠成像分析儀采集圖像，使用圖像分析軟件(IMAGE J)分析條帶灰度值，β-actin為內參，計算目的蛋白表達水平。

1.8 統計分析

2 結果

2.1 PDS抑制喉癌Hep2細胞的存活率

MTT實驗檢測結果發現，各給藥組與對照組(0 mg·L-1)相比，PDS處理24 h后細胞存活率沒有顯著變化(P>0.05，圖1A)，而PDS處理48 h時，從75 mg·L-1開始細胞存活率明顯下降，并隨著劑量增加，Hep2細胞的生長受到顯著抑制(P<0.05，圖1B)。

n=3.*P<0.05 and **P<0.01 vs 0 mg·L-1 group.

2.2 PDS抑制喉癌Hep2細胞的遷移

與CON組(65.7%±3.5%)相比，用100 nmoL·L-1DEX(31.6%±5.6%)和150 mg·L-1PDS(4.3%±1.7%)處理48 h的細胞顯示更低的劃痕愈合率，明顯抑制了細胞遷移能力(P<0.05，圖2)。

CON,control;PDS,PDS group;DEX,Dexamethasone group.

2.3 PDS抑制喉癌Hep2細胞的上皮-間質轉化

HE染色后的形態學分析顯示，PDS和地塞米松處理48 h后細胞的表面積和周長顯著增加，觸角消失，由紡錘形和多角形，逐漸呈鵝卵石樣形態，存在分化成上皮細胞的趨勢(圖3)。間充質細胞標志物N- E-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而上皮細胞分化標志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平明顯增加(P<0.05，圖4)。表明PDS具有和地塞米松一樣抑制EMT，抑制細胞遷移的作用。

2.4 PDS抑制β-catenin的表達

與CON組相比，PDS組和地塞米松組β-catenin的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，并且PDS對β-catenin蛋白水平較地塞米松的影響更為明顯(P<0.01，圖5 B、C)。

CON,control;PDS,PDS group;DEX,Dexamethasone group.

n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs CON group,#P<0.05,##P<0.01 vs DEX group.CON,control;PDS,PDS group;

n=3.*P<0.05 vs CON group,#P<0.05;##P<0.01 vs DEX group.CON,control;PDS,PDS group;DEX,Dexamethasone group.

3 討論

人參、三七等中藥的提取物，因其潛在的抗癌功能而受到廣泛關注，Fan X等最近研究發現人參二醇皂苷通過調節JAK2-STAT3信號通路，顯著抑制人胰腺癌細胞系 PANC-1 和 Patu8988 的增殖并誘導細胞凋亡[6]。Xiao S等也發現人參二醇皂苷通過線粒體途徑促進人肝細胞癌細胞凋亡[7]。本研究選用喉癌Hep2細胞，觀察了PDS對細胞增殖和遷移的影響，發現PDS可以明顯抑制喉癌Hep2細胞生長，劃痕實驗結果表明PDS處理后48 h細胞遷移能力受到抑制，為PDS在抗腫瘤臨床上的應用提供了新的研究方向。

Chen XJ等報道PDS可抑制EMT，調節細胞黏附分子和MMPs的表達和活性抑制腫瘤細胞侵襲[5]。PDS的有效成分Rg1和Rg3可通過抑制TGF-β1誘導的EMT來抑制肝癌細胞系HepG2或肺癌細胞A549的遷移和侵襲[8]。本研究探討了PDS對Hep2細胞的遷移能力影響的機制。Park MT等因為PDS與地塞米松的結構類似，發現其可通過糖皮質激素受體下調MMP-9 有助于抑制 HT1080 人纖維肉瘤細胞的侵襲能力[9]。這與本研究的HE染色的形態學分析結果相吻合，PDS或地塞米松處理48 h后，Hep2細胞的表面積和周長都顯著增加，存在分化成上皮細胞的趨勢。E-cadherin是分布在上皮細胞表面的鈣依賴性黏附分子，作為上皮細胞標志物，其功能喪失與鱗癌等的轉移性傳播，侵襲和預后不良有關，是EMT的標志之一[10]。在本研究中，PDS抑制Hep2細胞中間充質細胞標志物N-cadherin的表達并誘導E-cadherin的表達。另一種重要的間充質生物標志物是Vimentin，其表達是上皮細胞經歷EMT的特征[11]。在本研究中，PDS也明顯下調了Vimentin在Hep2細胞中的表達，進一步證明了PDS具有地塞米松一樣抑制喉癌細胞EMT過程的作用，進而抑制了細胞的遷移能力。

Wnt/β-catenin被認為是EMT過程中最重要的信號傳導途徑蛋白之一。Wnt信號通路被激活，通過切斷β-catenin的降解途徑，β-catenin轉移到細胞核中，調節下游基因C-myc，Snail等的表達，促進腫瘤細胞EMT，發生轉移[12]。對天然藥物成分、基因干擾等多研究顯示，對Wnt/β-catenin途經的抑制作用可明顯逆轉EMT過程，并影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[13]。本研究中通過PDS處理觀察到Hep2細胞對β-catenin信號傳導的抑制作用，并在蛋白質和基因水平上得到證實。這些結果提供了PDS抑制Hep2細胞中Wnt/β-catenin和TGF-β信號傳導的最新證據，這可能是PDS抑制Hep2細胞中EMT的主要分子機制。

總之，本研究發現PDS抑制Hep2細胞的EMT與遷移能力，這與抑制喉癌細胞的Wnt/β-catenin信號傳導有關。