B族鏈球菌不同檢測方法的效果評價

周新榮，范世珍，于波海，馬 正，莫 莉

(廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院(福田)，廣東 深圳518034)

B族鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)，又稱無乳鏈球菌，革蘭陽性球菌，常寄生于陰道和直腸，為兼性厭氧的條件致病菌，是引起新生兒敗血癥和腦膜炎等侵襲感染的首要致病菌[1]。妊娠期可引發(fā)晚期流產(chǎn)、胎兒生長受限、胎膜早破、早產(chǎn)等不良妊娠結局[2]。GBS嚴重感染導致胎兒、新生兒死亡的病例也有所報道[1]。2010年美國CDC指南推薦，無論早發(fā)型GBS危險因素是否存在，所有孕婦都應進行GBS篩查[3]，這在很大程度上減少了圍產(chǎn)期GBS感染的危害尤其是早產(chǎn)型GBS感染。國內2018年發(fā)布的《孕前和孕期保健指南》將孕晚期35-37周孕婦GBS篩查作為產(chǎn)前檢查的備查項目[4]。對圍產(chǎn)期孕婦進行GBS篩查，是預防新生兒GBS感染的最有效手段[5]。

GBS篩查的標準方法為細菌培養(yǎng)鑒定方法，但該方法假陰性率高，容易造成漏診[6]。隨著分子生物學的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了許多操作簡便、敏感度高、檢測時間短、結果判斷簡單或能自動化判讀的新檢測方法，如特異性抗原或抗體測定、核酸探針檢測、聚合酶鏈式反應(PCR)等。由于GBS檢測方法、診斷標準的不統(tǒng)一，受年齡和地區(qū)等因素的影響，圍產(chǎn)期GBS感染率差異較大[7]。我國目前還沒有形成GBS篩查及防治的統(tǒng)一方法。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測微生物技術是近年來發(fā)展起來的鑒定病原微生物的新技術，可通過對供試病原微生物的生物活性分子的指紋圖譜進行同源分析而快速鑒定菌種，對疾病診斷具有重要意義[8]。MALDI-TOF-MS在臨床微生物實驗室，主要應用于微生物單個菌落的鑒定，并逐漸取代生化和其他表型分析方法[9]。與傳統(tǒng)病原微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF-MS技術具有靈敏度較高、準確率較高、耗能較低、高通量等優(yōu)點[10]。近年來有研究報道MALDI-TOF-MS在陽性血培養(yǎng)瓶、尿標本[11]微生物快速鑒定中的臨床應用，均具有較好的臨床應用價值，能夠準確、快速對液體標本中的微生物進行鑒定，可以彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，有效縮短檢驗時間，準確快速地為臨床提供檢驗結果。

基于上述研究基礎以及MALDI-TOFMS鑒定微生物的顯著優(yōu)勢，本研究擬采用國產(chǎn)Clin-ToF微生物處理試劑聯(lián)合MALDI-TOFMS方法直接鑒定培養(yǎng)后樣本中的B族鏈球菌，評價該國產(chǎn)化微生物處理試劑的效果，旨在提供一種可選擇的B族鏈球菌靈敏快速檢測方法，以降低B族鏈球菌鑒定的時間成本。此外本研究同時采用質譜快速鑒定法、選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法、細菌培養(yǎng)法、實時熒光PCR法和膠體金免疫層析法進行GBS篩查實驗，旨在分析質譜快速鑒定法、選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法、實時熒光PCR法和膠體金免疫層析法在孕婦B群鏈球菌(GBS)定植篩查中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1臨床菌株 278株GBS臨床菌株分離自2019年8月至2020年9月在廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院產(chǎn)科門診自愿接受產(chǎn)前GBS篩查的孕婦(孕35-37周)。孕婦在標本采集前2周無性交且未接受抗菌藥物治療。

1.1.2質控菌株 無乳鏈球菌(ATCC12386)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)。

1.2 儀器與試劑Clin-ToF II飛行時間質譜系統(tǒng)(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)、QuantStudio Dx(美國ABI)、B族鏈球菌核酸檢測試劑盒-熒光PCR法(江蘇碩世生物科技股份有限公司)、VITEK2-Compact型全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃)、血瓊脂平板(鄭州安圖)、B族鏈球菌檢測試劑-膠體金免疫層析法(廣州市微米生物科技有限公司)

1.3 方法

1.3.1標本采集 采用藻酸鈣、普通棉拭子或滌綸拭子采集生殖道或直腸等部位帶上皮細胞的分泌物標本。(1)妊娠35-37周孕婦生殖道分泌物：先拭去陰道過多的分泌物，采用無菌拭子插入陰道至內1/3處，沿陰道壁輕輕旋轉取得分泌物，將采集的拭子置于無菌管中，密閉送檢，注明采集部位和采集時間。(2)妊娠35-37周孕婦直腸分泌物：將拭子插入肛門，在肛門括約肌以上約2.5 cm處，沿腸壁輕輕旋轉取得標本，將采集的拭子置于無菌管中，密閉送檢，注明采集部位和采集時間；(3)樣本一經(jīng)采集，則應盡快送至檢測實驗室。

1.3.2GBS檢測 (1)細菌培養(yǎng)法：按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》規(guī)范操作。標本接種于血瓊脂平板，在恒溫培養(yǎng)箱35℃孵育18-24 h。挑取血平板上有β溶血的疑似GBS菌落分純培養(yǎng)后，革蘭染色陽性、觸酶實驗陰性，挑取典型菌落用Clin-TOF飛行時間質譜系統(tǒng)進一步鑒定，確認并記錄結果。(2)實時熒光PCR檢測GBS-DNA：對GBS的cfb基因編碼區(qū)的保守區(qū)為靶區(qū)域，設計引物和探針。通過熒光標記的GBS特異性探針和內標對照探針檢測GBS。核酸制備、擴增檢測及陰陽性結果判斷嚴格按照試劑盒說明書進行。(3)質譜快速鑒定法：將棉拭子標本置于專用增菌培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱35℃孵育4 h。按照試劑盒說明書進行操作，使用飛行時間質譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑處理后，用Clin-TOF飛行時間質譜系統(tǒng)進行檢測。鑒定結果以置信度分數(shù)來判讀，置信度≥25分，表示結果可信；置信度在<25分之間，該置信度下的鑒定結果不可靠，應重新處理菌株或重新采集樣品點再測試。鑒定軟件中每個數(shù)據(jù)均會產(chǎn)生10個鑒定結果，以置信度分數(shù)最高且排名第一的結果為準。(4)選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板培養(yǎng)法：標本接種于毅新博創(chuàng)B族鏈球菌增菌培養(yǎng)基中置35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后轉種血平板，35℃孵育18-24 h，挑取血平板上有β溶血的疑似GBS菌落分純培養(yǎng)后，革蘭染色陽性、觸酶實驗陰性，挑取典型菌落用Clin-TOF飛行時間質譜系統(tǒng)進一步鑒定，確認并記錄結果。(5)膠體金免疫層析法：嚴格按照試劑盒說明書進行操作和結果判讀。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以細菌培養(yǎng)法作為金標準，計算其他檢測方法的診斷性能評價指標。靈敏度=a/(a+c)×100%，特異度=d/(b+d)×100%，準確性=(a+d)/(a+b+c+d)×100%，陽性預測值=a/(a+b)×100%陰性預測值=d/(c+d)×100%，誤診率=b/(b+d)×100%，漏診率=c/(a+c)×100%；a為真陽性標本例數(shù)，b為假陽性標本例數(shù)，c為假陰性標本例數(shù)，d為真陰性標本例數(shù)。

2 結果

2.1 檢測結果比較278例標本中，細菌培養(yǎng)法檢出陽性26例，陽性率9.4%；選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板培養(yǎng)法檢出陽性29例，陽性率10.4%；實時熒光PCR法檢出陽性51例，陽性率18.3%；質譜快速鑒定法檢出陽性19例，陽性率為6.8%；膠體金免疫層析法檢出陽性34例，陽性率為12.2%。細菌培養(yǎng)法、實時熒光PCR法、質譜快速鑒定法、選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板培養(yǎng)法、膠體金免疫層析法陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 診斷性實驗性能評價以細菌培養(yǎng)法作為金標準，計算其他檢測方法的診斷性能評價指標，結果見表2。選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法準確度最高，為98.9%；靈敏度最高，為100.0%；漏診率最低。質譜快速鑒定法特異度最高，為99.6%；陽性預測值最高，為94.7%；誤診率最低，為0.4%；但漏診率最高，為30.8%。實時熒光PCR法特異度為88.0%；靈敏度為77.0%；誤診率最高，為12.0%。膠體金免疫層析法特異度為96.0%，靈敏度為92.3%，準確度為95.7%。4種診斷性實驗陰性預測值均較高，達96.0%以上。4種診斷性實驗靈敏度、特異度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 診斷實驗評價表(n)

表2 4種診斷性實驗性能評價(%)

2.3 檢測時長比較細菌培養(yǎng)法、選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法、質譜快速鑒定法、實時熒光PCR法、膠體金免疫層析法檢測GBS的時長分別為48-72 h、52-76 h、5-6 h、2-4 h、10 min，細菌培養(yǎng)法和選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法耗時最長，膠體金免疫層析法耗時最短。

3 討論

據(jù)美國CDC統(tǒng)計，產(chǎn)婦感染GBS的發(fā)病率為10%-30%，其中40%-70%的感染孕婦在分娩過程中將GBS傳播至新生兒，1%-3%的帶菌新生兒早期即可出現(xiàn)侵入性感染，感染患兒的病死率約為5%。孕婦經(jīng)產(chǎn)道垂直傳播GBS是導致新生兒感染的主要途徑[12-14]。因此，產(chǎn)前進行GBS定植篩查有利于阻止和減少新生兒GBS感染[15]。有文獻報道，孕婦GBS定植率為3.4%-15.8%，且定植率在不同國家、地區(qū)、人群種族間有一定差異，并受到人群年齡、教育程度、檢測技術及檢測頻率的影響[16-17]。

產(chǎn)前生殖道分泌物普通細菌培養(yǎng)是目前是確診GBS感染的金標準，普通細菌培養(yǎng)法檢測GBS應用最廣，鑒定的同時還可進行藥敏試驗。但缺點是檢測時間長，而且GBS營養(yǎng)要求高，在血平板上生長易受陰道與直腸中其他細菌的干擾和抑制，從而導致漏檢[18]。另外標本取材后若不及時進行處理，在環(huán)境、保存條件的影響下可誘導B族鏈球菌的凋零，從而導致無法培養(yǎng)檢出，降低靈敏度低[16]。因此，尋找更為快捷、準確的GBS檢測方法十分重要。

美國CDC自1996 年至今共發(fā)布了3版妊娠期GBS 篩查指南，我國在2010年開始公布妊娠期GBS 篩查指南。指南中直接接種細菌培養(yǎng)法被各大醫(yī)院廣泛應用，主要是細菌培養(yǎng)法對實驗設備及場地要求不高，容易操作。但是研究表明，直接接種細菌培養(yǎng)法陽性檢出率不高，臨床容易出現(xiàn)漏診[19]。相關文獻報道，選擇性肉湯增菌后轉種細菌培養(yǎng)進行檢測，能夠獲得更高的陽性檢出率[20]。主要是因為直接培養(yǎng)法中菌種豐富，影響GBS的生長，加大了檢測難度。而選擇性肉湯培養(yǎng)基中包含有多粘菌素B、萘啶酮酸抗菌藥，能夠有效抑制受檢者陰道樣本中非目標菌種(多數(shù)為革蘭陰性菌)的生長，雖然對GBS也會產(chǎn)生輕度抑制作用，但選擇性肉湯培養(yǎng)基中的鏈球菌生長營養(yǎng)成分可同時有助GBS的生長，更利于檢出。本文通過研究發(fā)現(xiàn)，選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板培養(yǎng)法陽性檢出率為10.4%，準確度最高，為98.9%，特異度較高，為98.8%，漏診率及誤診率均較低，但檢測時間最長，成本最高，可作為普通細菌培養(yǎng)法的改良方法。因此，有條件的醫(yī)院可將選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板培養(yǎng)法作為GBS檢測的常規(guī)方法，其準確性及特異性均優(yōu)于直接細菌培養(yǎng)法。

膠體金免疫層析法通過標記的單克隆抗體于GBS抗原特異性結合，抗原-抗體復合物被固相多克隆抗體捕捉后，出現(xiàn)紅色帶即為陽性。金標法具有以下特點：(1)操作簡單：可直接檢測標本，無需進行培養(yǎng)，不需要特殊的培養(yǎng)條件和設備，并可隨時檢測；(2)檢測快速：僅需10 min即可完成檢測，在幾種常用方法中檢測時長最短；(3)特異度較高：金標法檢測GBS的特異度在幾種常用方法中較高，達到96.0%。有研究稱，孕婦陰道分泌物中分離的假豕鏈球菌會導致膠體金免疫層析法出現(xiàn)假陽性。因此，金標法適合作為門診大規(guī)模常規(guī)初步篩查、基層醫(yī)院常規(guī)篩查方法。

熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術作為一種重要的分子生物學方法，因其具有良好的特異性和敏感性而在臨床廣泛使用，近年來受到越來越多研究者的青睞。其具有實時、快速、準確等優(yōu)點，適用于圍產(chǎn)期篩查和緊急情況下的快速檢測[21-22]。PCR 法是一種快速且高效的病原微生物檢測的方法，可通過對不同種屬特異性核算序列設計引物及不同熒光染料標記探針的應用，在高通量檢測儀器的輔助下完成具有快速性、敏感性且高通量性的閉蓋檢測，具有檢測結果準確可靠、敏感性高的優(yōu)勢[16]。其主要缺點是無法進行藥敏試驗，且檢驗結果容易受實驗操作的影響，因此需要對實驗人員進行完整是體系培訓，對實驗場地及實驗人員均有較高的要求。應用PCR法進行GBS檢測時，檢出時間可控制在4小時內，耗時明顯低于細菌培養(yǎng)法，因而具有很好的臨床實踐意義[23-24]。本文通過研究發(fā)現(xiàn)，PCR方法診斷GBS的特異度為88.0%，陰性預測值為97.4%，與國內研究一致[16,24]，提示實時熒光定量PCR對于GBS具有較好的診斷效能，可及時、準確的對GBS進行診斷。因此，PCR技術適用于孕婦GBS的快速篩查。理論上，PCR方法靈敏度和特異度均較好，但本實驗中結果中靈敏度僅為77%，誤診率最高達12%；分析原因可能與陰道分泌物中可能存在干擾熒光成分有關、引物特異性有關，具體原因需要進一步研究證實。因此本研究認為，PCR法對于B族鏈球菌的臨床實驗診斷應用價值有待進一步研究。

MALDI-TOF-MS 是一種非常有前景的微生物鑒定方法，它具有很明顯的準確性和高效性[25-26]?；贛ALDI-TOF-MS在陽性血培養(yǎng)瓶、尿標本[11]微生物快速鑒定中的良好臨床應用價值，其在液體標本中微生物快速鑒定的應用前景不容小覷。本文通過研究發(fā)現(xiàn)，質譜快速鑒定法在GBS篩查實驗中特異度最高，為99.6%；陽性預測值最高，為94.7%；誤診率最低，為0.4%；但靈敏度最低，為69.2%。有相關文獻報道，MALDI-TOF-MS在血培養(yǎng)微生物整體鑒定靈敏度為70.8%，其中陽性球菌鑒定靈敏度為52.9%；在尿液微生物整體鑒定靈敏度為78.6%，其中陽性球菌鑒定靈敏度為75.0%，與本文報道靈敏度較一致。MALDI-TOF-MS在陽性血培養(yǎng)微生物快速鑒定時，當血培養(yǎng)瓶中有兩種及以上細菌時，常無法準確鑒定出細菌；在尿液微生物快速鑒定時[11]，當細菌含量低于104cfu/ml時，陽性球菌準確檢出率低于17%。結合本研究分析其靈敏度較低的原因可能有，其一，液體培養(yǎng)基增菌后B族鏈球菌濃度仍較低，故可能導致無法檢出；其二，液體培養(yǎng)基增菌后仍有較多其他細菌，干擾檢測B族鏈球菌檢測，導致無法檢出。將增菌后的液體培養(yǎng)基涂布平板后發(fā)現(xiàn)部分陽性標本中僅有少量B族鏈球菌，其菌量占比低于10%；此外涂布平板后發(fā)現(xiàn)仍有較多腸桿菌科細菌(如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等)、腸球菌(屎腸球菌、糞腸球菌等)、葡萄球菌屬等細菌。本實驗采用的增菌培養(yǎng)基配方主要成分為BHI肉湯、多粘菌素B、萘啶酮酸、純水，其中多粘菌素B、萘啶酮酸對多種陰性菌有抑制作用?？焖儋|譜法在4種GBS篩查方法中特異度最高，達到99.6%；陽性預測值最高，為94.7%，在臨床應用中，其快速診斷有不容小覷的應用前景。

綜上所述，與細菌培養(yǎng)法相比，選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法、實時熒光PCR法和膠體金免疫層析法方法篩查GBS的檢出率均較高。膠體金免疫層析法操作簡單、檢測快速、特異度較高，金標法適合作為門診大規(guī)模常規(guī)初步篩查、基層醫(yī)院常規(guī)篩查方法。實時熒光定量PCR對于GBS具有較好的診斷效能，可及時、準確的對GBS進行診斷，PCR技術適用于孕婦GBS的快速篩查。基于選擇肉湯培養(yǎng)后涂平板法準確度高、靈敏度高，但檢測時間最長，成本最高，可作為普通細菌培養(yǎng)法的改良方法，有條件的醫(yī)院可作為常規(guī)篩查方法?？焖儋|譜法在GBS篩查實驗中特異度最高，陽性預測值最高，在臨床應用中，快速診斷有不容小覷的應用前景。