FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變嚴重程度的關系研究

武振宇

(張家口市婦幼保健院 微生物科，河北 張家口075000)

宮頸病變嚴重程度差異代表著不同的治療難度與治愈成功率，早期宮頸癌篩查有助于降低高級別宮頸病變發生風險，保障女性生命健康安全[1]。目前，臨床以陰道鏡病理活檢作為宮頸癌確診的金標準，但該診斷方法具有侵入性且可能存在一定的并發癥風險，因此在臨床實際中常通過人乳頭瘤病毒(HPV)-DNA等完成初步篩查，對高危型HPV感染或高度懷疑宮頸癌變的患者進一步實施病理活檢[2]。HPV-DNA對宮頸病變患者有較高的陽性檢出率，但隨著宮頸疾病的惡化，游離態病毒載量發生變化，導致部分宮頸疾病仍存在少數假陽性、假陰性等錯診或漏診事件，給患者帶來不必要的心理負擔[3]。吳秋珍等[4]研究提到，E6/E7 mRNA作為HPV病毒致癌基因直接標志物，HPV E6/E7 mRNA高表達量表示癌基因高活性，HPV E6/E7 mRNA表達陽性則提示機體內存在高度HPV感染，有必要繼續完成病理活檢或介入治療。而線粒體分裂蛋白1(FIS1) mRNA在宮頸癌患者體內呈低表達量，進而無法抑制癌細胞增殖，促進疾病進展[5]。本研究旨在明確宮頸病變不同嚴重程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平及相關性，為后續完善宮頸癌初期篩查工作提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集張家口市婦幼保健院2021年1月-2021年7月行宮頸癌篩查的5666例標本。排除標準：(1)檢查前3 d內進行陰道沖洗或陰道內藥物治療者；(2)檢查前24 h內有性生活史者或經期者；(3)檢查時存在外陰、陰道及宮頸等組織損傷或感染者；(4)妊娠期、哺乳期女性或存在近半年內妊娠史；(5)臨床各項資料不全。經病理活檢確診650例宮頸病變患者，其中356例未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)患者、218例宮頸上皮內瘤樣病變(CIN) Ⅰ級患者、42例CIN Ⅱ級患者、24例CIN Ⅲ級患者、15例宮頸鱗狀細胞癌患者，年齡20-60歲，平均年齡(40.19±12.34)歲。

1.2 方法

1.2.1宮頸液基薄層細胞學檢查(TCT)檢查 通過陰道張開器、窺陰器將患者宮頸完全暴露于視野范圍內，使用無菌棉球力度稍輕擦取宮頸分泌物，在宮頸外口、管內用德同生物和諾森試驗專用宮頸刷取適量組織標本置于含有細胞保存液的試管瓶內送檢。包括5090例正常組(健康或慢性炎癥)、285例不典型鱗狀細胞(ASC)、183例鱗狀上皮內低度病變(LSIL)、98例鱗狀上皮內高度病變(HSIL)、10例宮頸癌。

1.2.2HPV-DNA檢查 將收集的宮頸組織標本通過HC-2法檢測，包括4種低危HPV亞型(HPV6、11、42、43)與15種高危HPV亞型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73)，陽性判定標準：HPV-DNA≥1.0(ng/L)。

1.2.3FIS1 mRNA檢查 將適量宮頸組織標本按RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，通過逆轉率試劑盒說明書步驟將其轉錄為cDNA，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書進行qRT-PCR擴增，引物由上海生工生物工程公司提供，檢測擴增產物的RNA表達，計算FIS1 mRNA相對表達量，獨立重復檢查2次以上，參考文獻[6]以其中位表達量為界分為FIS1 mRNA高表達量與FIS1 mRNA低表達量，將FIS1 mRNA低表達量判定為陽性。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢查 通過bDNA技術對采集的宮頸組織標本進行檢測，將標本置于離心管中，3000 r/min進行5 min離心，分離上清液后，添加2 ml雙重水，震蕩混勻，添加3 μl蛋白酶K、300 μl組織裂解液后于65℃條件下完成半小時的孵育，制成品通過宮頸穩態檢測試劑盒測定，獨立重復檢查2次取平均值，陽性判定標準：HPV E6/E7 mRNA平均拷貝數值>1 pg/mL。

1.2.5陰道鏡病理活檢 將擴陰器置于陰道內，根據檢查對象具體生理構造對屈光度、焦距進行微調，充分暴露宮頸上皮、血管及轉化區，使用復方碘酊與含3%醋酸棉球擦拭上述部位，監測顏色轉變情況，若未著色則判定為陽性，進一步定位活檢，于光學顯微鏡下觀察細胞病變性質。

1.3 統計學方法

經統計學軟件SPSS24.0分析整理研究數據，例(n)與率(%)指代計數資料，行χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗；計量資料以四分位數表示，兩組間采用秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)檢驗。采用Pearson相關性分析明確FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達陽性與宮頸病變嚴重程度的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率

以TCT不同診斷級別為參考，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASC(P<0.05)。FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于LSIL(P<0.05)，見表1。

表1 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率[n(%)]

2.2 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量

以TCT不同診斷級別為參考，FIS1 mRNA拷貝數：宮頸癌HSIL>LSIL>ASC(P<0.05)，見表2。

表2 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量[m(P25，P75)，pg/mL]

2.3 不同宮頸病變程度的HPV基因型分布

以病理活檢結果為診斷標準，4種低危HPV亞型(HPV6、11、42、43)與15種高危HPV亞型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52 、56、58、59、66、68、73)的HPV DNA陽性表達情況見表3。

表3 不同宮頸病變程度的HPV基因型分布(n)

2.4 不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率

以病理活檢結果為診斷標準，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASCUS、CIN Ⅰ級(P<0.05)，見表4。

2.5 比較不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量

FIS1 mRNA拷貝數：宮頸鱗狀細胞癌CIN Ⅲ級>CIN Ⅱ級>CIN Ⅰ級、ASCUS(P<0.05)，見表5。

表4 不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率[n(%)]

表5 比較不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量[m(P25，P75)，pg/mL]

2.6 分析FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量與宮頸病變嚴重程度的相關性

Pearson相關性分析結果顯示，以病理活檢結果為診斷標準，宮頸病變嚴重程度與FIS1 mRNA表達量呈顯著負相關性(r=-0.881，P<0.05)，與HPV E6/E7 mRNA表達量呈顯著正相關性(r=0.903，P<0.05)。

3 討論

有關文獻[7]報道，全球宮頸癌患病群體呈逐年增多趨勢，我國每年因宮頸癌死亡的女性可達2-3萬。臨床研究[8]指出，推廣宮頸癌早期篩查有助于及時明確宮頸病變情況，進而完善治療，降低女性死亡風險。HPV-DNA是臨床最常應用的宮頸癌篩查方式，HPV-DNA檢查有助于獲得HPV感染及分型信息，進而明確宮頸病變嚴重程度，具有針對性高、成本低、適用范圍廣等優點，但在高級別宮頸病變中可能存在一定的誤診或漏診風險[9]。TCT是目前臨床較為可靠的宮頸疾病檢查技術，TCT的優點在于對宮頸組織細胞標本裂解更徹底，排除血細胞干擾，避免有效細胞自溶，且操作便捷，具有較高的陽性檢出率[10]。相關研究[11]提到，HPV感染進展至宮頸癌需要E6、E7癌基因參與，其可利用鈍化腫瘤抑制蛋白刺激異常細胞增殖，進而造成癌變，因此HPV E6/E7 mRNA的高表達量一定程度上提示宮頸惡意病變。FIS1是線粒體內部參與裂變過程的關鍵分子，高表達量時可刺激線粒體裂變，并促使細胞凋亡，當FIS1過表達時，宮頸癌HeLa細胞生長受限，當其低表達時，宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移功能不受抑制[12]。以FIS1 mRNA中位表達量為界將低表達量判定為陽性，以HPV E6/E7 mRNA高表達量為陽性，同時以TCT、病理活檢結果分別為參考進一步分析FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變嚴重程度的相關性，對減少后續宮頸癌早期篩查群體的非必要有創檢查有所助益。

本研究結果顯示，以TCT不同診斷級別為參考，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASC。FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于LSIL。以病理活檢結果為診斷標準，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASCUS、CINⅠ級。這說明FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性表達可能更易提示高惡化程度宮頸疾病。這與馬亞琪等[13]研究結果相符。研究結果還表明，以TCT不同診斷級別為參考，FIS1 mRNA拷貝數：宮頸癌、HSILHSIL>LSIL>ASC；以病理活檢結果為診斷標準，FIS1 mRNA拷貝數：宮頸鱗狀細胞癌、CIN Ⅲ級CIN Ⅲ級>CIN Ⅱ級>CIN Ⅰ級、ASCUS。兩種不同參考結果均表明FIS1 mRNA拷貝數隨宮頸疾病的惡化而呈現減少趨勢，而HPV E6/E7 mRNA拷貝數隨宮頸疾病的惡化呈現增加趨勢。目前，有關FIS1 mRNA在宮頸病變領域的研究資料不足，暫時無法進一步結合更多過往研究成果完成對照。王蘭英等[14]研究則提到，HPV E6/E7 mRNA較HPV-DNA更有助于區分宮頸病變不同嚴重程度，部分支持了本研究結論，這是因為隨HPV感染時間延長，游離態病毒減少，而整合態病毒中L1片段已缺失，HPV DNA可能無法準確檢測，但其中的E6/E7 mRNA仍舊表達[15]。進一步通過Pearson相關性分析明確FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變程度的關系，結果顯示，宮頸病變嚴重程度與FIS1 mRNA表達量呈顯著負相關性，與HPV E6/E7 mRNA表達量呈顯著正相關性。證明兩種mRNA分子均與不同嚴重程度宮頸病變存在因果聯系，即當FIS1 mRNA表達量越低而HPV E6/E7 mRNA表達量越高時，女性更易發生高級別宮頸病變。楊詠梅等[16]研究也部分支持了這一結果。FIS1是細胞代謝基礎過程的參與分子，可結合動力相關蛋白分裂線粒體，進而刺激細胞凋亡，當發生宮頸病變或宮頸疾病惡化時，FIS1分子生物學功能發生異常，表現為表達水平降低[17]。另外，HPV E6/E7 mRNA與致癌基因緊密關聯，可參與抑癌基因降解過程，并破壞細胞周期的正常調節能力，影響細胞無規則繁殖，HPV E6/E7 mRNA的檢測有助于評價女性是否存在因攜帶HPV高危亞型感染而導致的宮頸病變以及宮頸疾病不同惡化程度。

綜上所述，FIS1 mRNA表達水平與宮頸病變程度存在顯著負相關性，HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變程度存在顯著正相關性，檢測FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA在早期宮頸癌篩查中均具有一定臨床意義。