膠質母細胞瘤患者MGMT基因啟動子甲基化檢測與分析

施克青，楊 斌，王 楠，楊福偉，秦治剛，張金男*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 神經外科,吉林 長春130033；2.吉林省膠質瘤精準診療重點實驗室)

膠質母細胞瘤(GMB)屬于膠質瘤中惡性程度最高的類型，臨床上通常以手術切除為主，輔以放、化療等綜合治療，但患者的預后較差，死亡率較高。因此，探索治療GMB的有效方法是當前醫療工作者的研究重點[1]。有研究發現[2-3]，MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)基因啟動子甲基化的患者對烷化劑藥物反應較好,預后優于非甲基化的患者，且DNA異常甲基化還可作為預防腫瘤轉移、復發等分子標記物對腫瘤患者的預后效果進行評估。MGMT作為一種DNA修復酶，可逆轉由烷化劑引起的DNA損傷，從而導致腫瘤對替莫唑胺和基于亞硝基脲的化療不敏感。MGMT啟動子的甲基化使MGMT沉默，使得腫瘤對用烷化劑治療更敏感[4]。本文通過對1例多形性膠質母細胞瘤患者MGMT基因啟動子甲基化進行檢測與分析，以期為GMB的預后評估提供一定的理論依據。

1 臨床資料

患者，男性，58歲，經臨床診斷和影像學特征確診為多形性膠質母細胞瘤多出血伴囊性變WHO:IV級，收集其家人相關信息。采用MGMT啟動子甲基化檢測MGMT啟動子區12個CpG位點的甲基化程度，預測替莫唑胺(TMZ)的敏感性。患者A片免疫組化：Vinentin(+)；CK(-)；EMA(局部弱+)；GFAP(+)；CD34(血管+)；PR(-)；Ki67(局部30%+)；S-100(+)；011g-2(+)；TDH1(-)；MGMT(3%+)；ATRX(散在+)；P53(局灶10%+)；NeuN(-)。

2 結果

2.1 相關基因變異

變異分級為Ⅰ類的基因變異的分別為ATRXNM_000489.4intron13 c.4214+3A>G、BRAFNM_004333.4 exon15p.V600E c.1799T>A、CDKN2A缺失、CDKN2B缺失，突變豐度/拷貝數分別為62.84%、30.39%、0.69、0.63，見表1。

表1 相關基因變異

2.2 常見分型及預后基因列表

檢查結果為野生型中檢測的項目分別為IDH1、IDH2、TERT、H3F3A/HIST1H3B/HIST1H3C，檢測內容分別為R132、R172、c.-124C>T(C228T)/c.-146C>T(C250T)、p.K28M(K27M)，相關癌種分別為膠質瘤、膠質瘤、膠質瘤/腦膜瘤、彌漫中線膠質瘤；檢查結果為未檢出融合的項目分別為BRAF、RELA、YAP1、MYB，檢測內容均為融合，相關癌種分別為膠質瘤、室管膜瘤、室管膜瘤、血管中心性膠質瘤；檢查結果為未檢出突變>G項目別為ATRX，檢測內容為點突變，相關癌種為膠質瘤；檢查結果為未檢出擴增的項目為EGFR、7號染色體，檢測內容均為擴增，相關癌種為膠質母細胞瘤；檢查結果為檢出缺失的項目分別CDKN2A、CDKN2B、1p染色體、19q染色體、10號染色體，檢測內容均為缺失，相關癌種分別為膠質瘤、膠質瘤、少突膠質瘤、少突膠質瘤、膠質母細胞瘤，見表2。

2.3 靶向用藥提示

變異分級為Ⅰ類，基因變異為BRAFNM_004333.4exon15p.V600E c.1799T>A，突變豐度/拷貝數約為30.39%，本癌種可能敏感藥物為達拉非尼+曲美替尼(A級)、維莫非尼+Cobimetinib(A級)、Encorafenib+Binimetinib(C級)、Selumetinib(C級)、達拉非尼(C級)、維莫非尼(C級)、Ulixertinib(D級)、依維莫司+PLX4720(E級)、依維莫司+Selumetinib(E級)；其他癌種可能敏感藥物為Encorafenib+Binimetinib(C級)、Panitumumab+Encorafenib(C級)、達拉非尼(C級)、達拉非尼+曲美替尼(C級)、曲美替尼(C級)、維莫非尼(C級)、維莫非尼+Cobimetinib(C級)、西妥昔單抗+Encorafenib(C級)，無可能耐藥藥物；變異分級為Ⅱ類，基因變異為CDKN2A缺失，突變豐度/拷貝數約為0.69，本癌種可能敏感藥物為哌柏西利(E級)，其他癌種無敏感藥物和耐藥藥物，見表3。

表2 常見分型及預后基因列表

表3 靶向用藥提示

3 討論

據統計，顱內原發性惡性腫瘤中膠質瘤約為70%左右，其中，GBM患者占比約50%，是一種最為常見的惡性腫瘤類型，且對患者身體危害大，預后效果較差，致死率較高，嚴重威脅其生活質量和生命安全[5]。隨著醫療水平的提高，GBM治療手段已得到明顯的提升，但患者的中位生存期仍較短，因此，對GBM病因以及預后因素的影響具有重要意義[6]。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)作為一種DNA修復酶，可提高逆轉由烷化劑引起的DNA損傷，降低腫瘤對替莫唑胺和亞硝基脲的敏感性，而GMT啟動子的甲基化可以使MGMT沉默，增強腫瘤對烷化劑的敏感性[7]，有研究發現[8]，在GBM患者治療中，約30%-60%的患者MGMT啟動子是甲基化狀態，這也說明MGMT啟動子甲基化狀態治療前的預測對患者預后效果的影響較大。

本例研究發現，在變異分級為I類中，基因變異為ATRXNM_000489.4intron13c.4214+3A>G，突變豐度/拷貝數為62.84%，說明ATRX突變有助于膠質瘤的診斷(NCCN.org)。ATRX突變常伴有IDH突變檢出，而幾乎不會與1p19q染色體缺失同時檢出。因此，ATRX突變結合IDH突變是一種典型的星型細胞瘤。基因變異為BRAFNM_004333.4exon15p.V600Ec.1799T>A，突變豐度/拷貝數為30.39%，說明在中樞神經系統中，BRAFV600E突變主要發生在幕上毛細胞星形細胞瘤，神經節細胞瘤，多形性黃色星形細胞瘤，胚胎發育不良性神經上皮腫瘤,約50%的IDH野生型上皮樣膠質母細胞瘤也存在該變異。基因變異為CDKN2A缺失，突變豐度/拷貝數為0.69，提示CDKN2A缺失常與EGFR擴增/TERT啟動子突變/7，10號染色體變異同時出現，是膠質母細胞瘤的一類標志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級別星形膠質瘤/膠質母細胞瘤或IDH野生型的膠質母細胞瘤預后不良相關(PMID:33235995、32385699)。基因變異為CDKN2B缺失，突變豐度/拷貝數為0.63，提示CDKN2B缺失常與EGFR擴增/TERT啟動子突變/7，10號染色體變異同時出現，是膠質母細胞瘤的一類標志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級別星形膠質瘤/膠質母細胞瘤或IDH野生型的膠質母細胞瘤預后不良相關(PMID:33235995、32385699)[9]。

研究發現，突變形式為exon15c.1799T>A p.V600E突變豐度為30.39%，原因在于BRAF作為一種癌基因，位于7號染色體，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是Ras/Raf/Mek/Erk/Mapk通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種生類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF基因突變[10]。BRAF突變在黑色素瘤中的發生率約為37%-50%，最為常見的是V600錯義突變，大約80%-90%的V600 BRAF突變為V600E。通常情況下，BRAF突變不會與黑色素瘤中的其他致癌基因突變(NRAS突變/KIT突變)同時發生。另外，BRAF突變在NSCLC中發生率為1%-4%，其中V600E占50%，突變患者多為腺癌和有吸煙史患者。大多數情況下，BRAF突變不會與NSCLC中其他致癌基因突變(如EGFR/ALK)同時發生。研究發現，突變形式為拷貝數0.69時，CDKN2A位于9號染色體上，可編碼腫瘤抑制蛋白p16、p14arf等幾種蛋白產物。p16基因是1994年美國冷泉港實驗室Kamb等發現的新抗癌基因，p16能與cyclinD競爭性結合CDK4/6，抑制CDK4/6的激酶活性，阻止細胞進入S期和DNA合成啟動，通過抑制CDK4/6激酶的活性而使pRb不能磷酸化，未磷酸化的pRb增多抑制細胞增殖。同時高磷酸化的pRb可誘導p16的表達與CDK4/6結合抑制CDK4/6的活性，最終使pRb的磷酸化程度減弱[11]。因而p16在cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F細胞周期調節途徑中起著負反饋的作用。p16基因的變異或其蛋白的失活都會導致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調節途徑的失控使細胞過度增殖而導致腫瘤發生。p14arf能夠激活抑癌基因p53。認為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因。P16基因已經在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發現純合子缺失以及無義，錯義及移碼突變。這表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參予腫瘤形成，檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預測腫瘤的預后，具有十分重要的臨床意義。研究發現，MLH1(Exon1-3)-FLNB(Exon12-47)突變豐度34.8%時，MLH1基因位于3號染色體，編碼的蛋白參與DNA錯配修復，該基因是遺傳性非息肉性結腸癌(HNPCC)相關基因。其突變機制為DNA錯配修復蛋白的功能缺陷，導致了染色體和微衛星不穩定，其中微衛星不穩定是引起HNPCC的主要原因，約90%的HNPCC有MLH1和MSH2基因的胚系突變[12]。

綜上所述，MGMT啟動子甲基化與膠質母細胞瘤生存獲益相關，并用于臨床試驗的風險分層。MGMT啟動子發生甲基化的患者明顯比未發生甲基化的患者使用烷化劑的療效好，其總體生存率和無進展生存率更高。MGMT啟動子區甲基化對膠質瘤一線化療藥物TMZ治療膠質瘤的化療療效具有預測價值，且是獨立的預后較好的指示指標。MGMT啟動子未甲基化者從TMZ常規治療方案中獲益較小，應對這類患者采用更有效的有助于克服耐藥的其他化療方案。

本次受檢者未檢出顯著臨床意義的變異，目前研究未發現這些類型變異與腫瘤發生有明確關系，罹患腫瘤的風險為普通風險。普通風險不能完全排除罹患腫瘤的可能，可能是環境因素、檢測基因范圍以外存在其他未知致病突變的風險。