血清學結合基因檢測對1例Bx亞型的鑒定

孫 巖，王曉寧，劉 冰*，鐘 靖

(1.吉林大學第一醫院 輸血科，吉林 長春130021；2.邵陽市中心醫院 輸血科)

截至目前，共有376個人類紅細胞血型抗原被國際輸血協會(ISBT)認定，其中有345個抗原屬于總數為43種的紅細胞血型系統(www.isbtweb.org)。每個血型系統表現為一個單基因或相關區域兩個至三個緊密連鎖基因構成的基因簇，在它們之間很少或幾乎沒有可識別的重組，因此每個血型系統都具有基因獨立性[1]。其中ABO血型系統在臨床輸血中具有重要的意義，在輸血前常規檢測中會發現某些ABO亞型表現為正反定型不一致[2]。大部分的ABO亞型都是由于ABO基因不同的突變位點造成A、B轉移酶的活性變化，導致了H抗原轉化為A/B抗原的數量不同，形成了不同類型的ABO亞型，其中B血型亞型主要包括B3、Bx、Bm、Bel等，其B抗原表達逐漸減弱[3]。本實驗室在常規血型檢測中發現了1例疑似B亞型，并通過基因方法證實為Bx/Bweak表型，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

產婦肖某，女，31歲，孕1產1，無肝炎、傳染病史，無輸血及獻血史，無藥物過敏史。2021年10月順產足月寶寶送吉林大學第一醫院檢測新生兒溶血3項試驗。對該孕婦進行血型鑒定時，使用微柱凝膠卡在室溫下進行正反定型，其結果為抗-A呈陰性，抗-B呈陰性，抗-D呈陽性4+凝集，陰性對照孔為陰性，正定型O、RhD+，反定型檢測患者血漿與標準試劑A細胞出現4+凝集，與標準試劑B細胞在室溫下不凝集，反定型為B型，正反定型不相符為疑難血型，遂利用血清學及基因檢測方法鑒定其血型。

1.2 試劑與儀器

血型檢測卡(西班牙DIANA，批號21014.02)；抗人球蛋白檢測卡(西班牙DIANA，批號21092.01)；抗A、抗B試劑(上海血液生物醫藥，批號20210504)；單克隆抗-AB、抗-H(Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH)；ABO血型反定型試劑盒(長春博迅，批號2021080101)；不規則抗體檢測試劑(長春博迅，批號20210903)；快速PCR擴增高保真DNA聚合酶(北京全式金)；Axyprep DNA試劑盒(批號21419KC3，康寧生命科學公司)；QIAquick膠體DNA回收試劑盒(德國Eppendorf)，以上所有試劑均在效期內使用。卡式法離心機、孵育器(DIANA)；低速離心機(雷勃爾公司)；高速離心機(Eppendorf)；梯度PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像系統(Bio-Rad Gel Doc XR+型)；電泳儀(DYY-8C，北京六一)；引物合成與基因測序均由上海生工生物工程公司完成。

1.3 方法

1.3.1血清學實驗 患者血型鑒定，采用卡式法、試管法分別在不同溫度條件下檢測，卡法按廠家說明書操作，紅細胞吸收放散試驗、試管法按文獻[3]中方法操作；患者血漿意外抗體篩查試驗采用卡法，按說明書操作。

1.3.2基因檢測 DNA提取按照試劑盒說明書提取血液標本基因組。參照美國NCBI GenBank中ABO基因編碼區堿基序列設計引物，對ABO血型外顯子2-7 PCR引物進行擴增，PCR反應條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環，72℃延伸10 min，延伸結束后，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的片段進行膠回收實驗，以回收產物為模板繼續進行PCR擴增，擴增產物瓊脂糖電泳檢測條帶清晰，進行測序，測序結果以ABO blood group alleles(IBST 001)v1.1 171023突變位點比對，DNAStar軟件進行序列比對，進行基因型和表型分析[4]。

2 結果

2.1 ABO 血型鑒定及H 抗原檢查

患者樣本在常規室溫下檢測正定型為O型，其紅細胞與微柱凝膠卡中單克隆抗-A、抗-B反應均陰性，反定型為B型，但樣本紅細胞在4℃條件下與抗-B抗體反應呈弱陽性凝集，結果見表1；患者樣本在不同溫度條件下試管法血型鑒定及其紅細胞與抗-AB反應結果見表2。

表1 患者ABO血型鑒定(微柱凝膠法)

2.2 意外抗體檢測及紅細胞H物質活性強度測定

樣本意外抗體篩檢試驗結果陰性，說明患者血清中不存在ABO系統以外的意外抗體。將患者紅細胞及O、B型紅細胞分別與抗-H反應，結果凝集強度分別為3+、弱陽、陰性，與亞型H物質含量測定標準相符[1]。

表2 患者ABO血型鑒定結果(試管法)

2.3 樣本紅細胞吸收放散實驗結果

采用人源抗-B(效價128)進行吸收放散試驗，最后一次洗滌液與健康成人O型、B型細胞均不反應；樣本紅細胞放散液與O型細胞無凝集，但與健康成人B型細胞反應，凝集強度3+，說明樣本紅細胞表面存在B抗原。考慮為B亞型，進行基因檢測。

2.4 基因檢測結果

測序結果顯示，外顯子 2、3、4、5 無突變位點，外顯子 6、7 有突變，突變位點見表3。樣本序列與B101(ABO*B.01)基因序列比對，僅在6號外顯子278位發生C>T的突變，見圖1。經檢索[5]，樣本序列與ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T堿基突變導致93位脯氨酸變成亮氨酸，經過分析該樣本基因型為ABO*BW.12，表型為Bx/Bweak亞型。

表3 樣本ABO血型基因突變結果

3 討論

血型之父Landsteiner于1900年首次描述了ABO血型，其至今仍是輸血醫學中最重要的血型系統。同RH血型的D抗原一樣，A和B抗原具有高度免疫原性，輸注ABO不相容的血液可導致嚴重的免疫反應，這種反應可能導致急性血管內溶血和腎功能衰竭等并發癥，并導致患者出現致命的后果[6]。除了常見的ABO表型外，還發現了許多在紅細胞上弱表達A或B抗原的ABO亞型，ABO亞型雖然罕見，但卻是導致ABO血型正反定型不符合的重要原因之一。抗原弱表達的ABO亞型是由ABO 基因座上罕見的等位基因遺傳引起的，通常涉及基因編碼區、剪切位點或調控序列中的錯義突變、插入或缺失等，有文獻報道中國人群弱ABO亞型的檢出率約為0.015%左右[7]。

圖1 樣本ABO血型基因6號外顯子的c.278C>T突變

根據與單克隆抗-B/抗-AB/抗-H抗體的凝集程度、人源抗-B抗體吸收放散實驗結果、唾液分泌狀態以及血清中是否存在抗-B等，可將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，如果不符合以上四類，則可劃分為Bw[8]。另外，如要準確的確定正反定型不相符的患者ABO血型，仍需借助基因檢測的方法來分析確定[4]。在本例，患者樣本常規條件下檢測正定型O型，反定型B型，正反定型不相符。但患者紅細胞與抗-H強反應，且在4℃條件下檢測其紅細胞與抗-B和抗-AB抗體呈弱反應，并使用人源抗-B吸收放散后可驗證有B抗原存在，可初步判斷為弱B亞型，疑似為Bx。在諸多B亞型中，Bx、Bm的檢測確認尤其是重要的，因為這些B亞型紅細胞上只有極弱的B抗原，作為獻血者其可能會被錯誤地判斷成O型，如果輸血給O型受血者，則可能導致溶血性輸血反應的發生[4]。另外，當這類B亞型(如Bx)個體由于其血清(血漿)中可能含有弱的抗-B抗體，因而其作為受血者時應該給其輸O型紅細胞和(或)匹配/兼容的血漿和血小板成分[8]。

目前，ISBT(國際輸血協會)確認的涉及弱B的等位基因接近50個，最常見的B基因是ABO*B.01(B表型)，弱B表型的基因突變主要發生在6、7外顯子[5]。不同的B等位基因編碼翻譯出不同的糖基轉移酶，Bx型是由于基因的錯義突變，造成了編碼翻譯的酶只具有弱的合成抗原的能力[9]。本例患者樣本的直接測序結果顯示，在ABO基因第6外顯子出現c.278C>T、c.297A>G兩個等位基因突變，在第7外顯子出現c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A共6個等位基因突變。通過比對ISBT的ABO血型抗原等位基因突變資料，分析得出患者樣本序列與ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T堿基突變導致93位脯氨酸變成亮氨酸，而這一突變在中國人群中已有多例發現，并推測該突變正是其弱表型Bx/Bweak形成的分子基礎[5,10-11]。