堿性藥物反相高效液相色譜分析的挑戰以及改進方法

曹娜,蔣壽劍,李洋*

(1.正大天晴藥業集團股份有限公司,江蘇 南京 210046;2.正大天晴藥業集團股份有限公司 南京研究院,江蘇 南京 210046))

據統計,超過70%的藥物含有堿性官能團,在生命科學以及醫藥領域中,堿性化合物的作用舉足輕重[1-2]。在反相液相色譜分析中,堿性化合物的分析是一個難題,大家可能經常會碰到類似峰形拖尾、峰寬、峰高較矮、檢測靈敏度較差,而增加進樣量會導致色譜峰拖尾加劇,柱的效果迅速降低,相鄰的成分更容易被拖尾峰包裹等等。另外,在傳統硅膠柱上分離堿性化合物會出現嚴重死吸附,這些問題給分離分析和純化制備堿性化合物帶來了諸多困難[3-4]。另外,強極性堿性化合物(胞嘧啶、吡啶)在普通反相材料上保留時間較短,甚至在死時間出峰,很難將目標分析物與干擾物質分離。對于強極性堿性化合物無保留情況,通常會選擇HILIC色譜柱。親水作用色譜(HILIC)是基于樣品中化合物與親水性固定相之間的相互作用來實現分離,是一種補充反相作用色譜的方法,可以有效地分離強極性化合物[5-6]。與反相色譜相比,HILIC在分離極性化合物方面具有更好的選擇性和靈敏度,可以實現強極性化合物的分離。需要注意的是在HILIC模式中經常會出現重現性和峰形問題。重現性問題主要是由于色譜柱沒有達到足夠的平衡時間,特別對于梯度方法;峰形問題往往和分析物本身的特點有關以及不合適的樣品稀釋劑所導致[7]。雖然HILIC對大極性化合物有好的保留和分離效果,但是很多強極性堿性化合物無法溶解在高比例的有機相中,這在很大程度上地限制了HILIC的使用。借鑒分離分析和純化制備多種堿性化合物的經驗以及相關文獻,主要從流動相和固定相兩個方面改進堿性化合物拖尾問題,并提出了一些改進措施。

1 流動相方面

由于硅膠鍵合相容易溶解在堿性介質中,因此,大多數反相高效液相色譜法采用酸性或中性流動相條件。堿性化合物在酸性或者在中性流動相環境下,由于解離平衡的關系,便會以離子形式存在,帶正電荷。堿性化合物解離越容易,其峰拖尾越嚴重,主要是由游離的硅羥基與解離后的堿性化合作用生成的二級效應所致。改進措施如下:

1.1 改變流動相pH值

減少硅醇基與堿性化合物的離子交換作用的方法是選擇低或較高pH值的流動[8]。較低的pH值可以降低硅醇基的電離程度,從而減少與堿性化合物之間的離子交換反應;較高pH值的流動相可以抑制堿性化合物的電離程度,從而降低與硅醇基之間的離子交換反應。選擇合適的流動相需要考慮樣品性質和分析目的。如果樣品中含有大量的硅醇基化合物,則選擇低pH值的流動相可能更適合。相反,如果樣品中含有大量的堿性化合物,則選擇較高pH值的流動相可能更適合。對堿性化合物來說,流動相的pH值不僅僅對峰形,還對保留因子和選擇性都有很大影響,一般我們建議堿性化合物的流動相pH值≤2.5,會有比較好的峰形。

鹽酸安羅替尼項目中羥胺雜質檢測采用ODS色譜柱,乙腈-磷酸鹽體系(pH值2.9),效果較好。阿托品是一種具有叔胺結構的化合物,它呈堿性。在ODS色譜柱上,阿托品的保留時間很短。研究人員張國柱等人[9]在實驗中使用磷酸將三乙胺溶液的pH值調至7.5,通過改變阿托品的狀態,增加其在色譜柱上的保留,從而提高阿托品的分離效果。一般當流動相的pH值高于或低于被分析物的pKa值兩個pH值單位時,可以改善峰形的尖銳度,可以使得化合物以99%的比例存在于一種形式下。

1.2 加入“掃尾劑”

可以使用添加劑來調整流動相的酸堿性。例如,可以在酸性條件下加入三乙胺或二乙胺等一些掃尾劑,然后再用酸來調節流動相。在酸性條件下,三乙胺陽離子與游離于鍵合相中的硅羥基結合,使得堿性化合物與硅醇基之間的相互作用被阻斷,從而改善了峰形。然而,當面對比三乙胺更強堿性的化合物時,三乙胺的效果就不那么明顯了。需要注意的是三乙胺的堿性很強,當加入三乙胺作為掃尾劑改善峰形的時候,加入三乙胺后的流動相pH值可能超出色譜柱pH值的耐受范圍,對色譜柱造成一定損傷,建議流動相中加入三乙胺后再回調至未加入前的pH值。另外,還需要注意三乙胺在210 nm處有一定得吸收,如果液相分析方法中檢測波長在210 nm以下檢測時需要謹慎使用。

N-(3-氟-4-((7-((1-羥基環丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-苯基)-N-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲酰胺,使用ODS色譜柱(如Phenomenex Luna C18,4.6 mm×250 mm,5 μm或類似效能的色譜柱),流動相磷酸鹽緩沖液(將1.36 g的磷酸二氫鉀溶解在1 000 mL的水中,然后加入5 mL的三乙胺,再用磷酸調節pH值至2.7)條件檢測,效果都較之前不含有三乙胺的流動相體系好很多。

1.3 添加離子對試劑

在化學實驗中,我們通常使用堿性離子對試劑。其中比較常見的有高氯酸鹽和烷基磺酸鹽。烷基磺酸鹽包括庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉等。這些試劑在實驗中起到調節酸堿度的作用。在酸性環境中,堿性化合物中的陽離子會與烷基磺酸根陰離子結合,形成中性的離子對,使堿性化合物變成中性化合物,并增強疏水性,改善堿性化合物保留性和峰形。

腺苷蛋氨酸有關物質檢測中采用ODS色譜柱,以甲酸銨溶液(取甲酸銨0.63 g,庚烷磺酸鈉1.4 g,用甲酸調節pH值至2.8,加水稀釋至1 000 mL,搖勻)-甲醇(體積比80∶20)為流動相;在鹽酸二甲雙胍的檢測中采用ZORBAX SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),水-乙腈(體積比73∶27)(內含10 mmol/L磷酸二氫鈉和5 mmol/L十二烷基磺酸鈉)為流動相,增強了ODS柱上目標物質的保留力,峰形也得到了改善;研究人員史鵬杰等人[10]在流動相中加入烷基磺酸鈉類離子對試劑,結果發現檳榔中的生物堿分離效果得到明顯改善。

1.4 加入緩沖鹽

使用緩沖鹽的目的主要有兩點,其一是使流動相維持在一個相對穩定的pH值條件;其二是使流動相具有足夠的離子強度。因此選擇緩沖鹽的類型和濃度就非常重要。游離硅羥基被高濃度緩沖鹽中金屬離子“包裹”,并呈正電狀態,使得堿性化合物與固定相的二級反應受阻,從而減小了拖尾和改善了峰形。緩沖鹽的弱酸根(陰離子)作用是維持流動相體系在一個穩定的pH值環境,提高方法重現性。一般建議緩沖鹽濃度比樣品濃度高10倍以上,20～50 mmol/L使流動相維持穩定體系。

通常含有叔胺基團系列化合物采用ODS色譜柱,以乙腈-0.1%甲酸體系為流動相,檢測結果峰型差,拖尾明顯,流動相由乙腈-0.1%甲酸體系改為乙腈-10 mmol/L磷酸氫二銨/50 mmol/L磷酸二氫銨水溶液,峰型改善明顯。

2 固定相方面

C18色譜柱是將十八烷基鏈鍵合在硅膠上而得到的,是反相液相色譜分析方法中應用最廣泛的色譜柱[11-13]。但是由于十八烷基碳鏈非常長,所以在鍵合的時候空間位阻非常大,造成鍵合率不高,這樣會有很多硅羥基沒有被鍵合而殘留下來。在某些反相液相色譜中,當殘留的硅羥基被解離時,會具有陽離子交換活性。這種活性通常在分離堿性化合物時會導致峰形拖尾并且柱效下降。針對些問題,我們可以考慮以下解決辦法。

2.1 改善ODS鍵合相的封尾技術

針對解決堿性化合物拖尾的問題,研究人員近年來致力于改進固定相結構組成。為了進一步降低游離硅羥基的活性,各色譜柱廠家發展了一些更為先進的制造技術,通過適當的封尾、極性基團修飾以及進一步屏蔽活性硅醇基團,可以得到理想的峰形。如Agilent公司利用雙封尾技術開發了ZorbaxExtend C18色譜柱,該色譜柱能夠在堿性條件下有效地屏蔽硅醇基團。

分析堿性化合物常用色譜柱有Waters Symmetry Shield RP18、Waters ACQUITY UPLC CSH C18,其中Waters Symmetry Shield RP18是采用內嵌極性官能團的方式,作用機理是極性基團是親水性的,很容易抓取流動相中的水在其表層,從而阻止堿性化合物與硅膠表面殘留硅醇基間的作用,能夠獲得較好的峰形,但pH值2～8耐受范圍有限;Waters ACQUITY UPLC CSH C18是一種帶電雜化色譜柱,通過利用色譜柱表面的正電荷與堿性化合物溶質之間的靜電排斥作用,使堿性化合物不能靠近硅醇基,從而使色譜峰的形態得到改善。

2.2 使用混合模式固定相

混合模式色譜是一種分離技術,它在一根色譜柱上同時利用兩種或多種分離機理來實現分離。這項技術可以根據不同樣品的特性來進行分離,從而提高分離的選擇性,多種保留機理的存在將十分有利于強極性堿性化合物的分離工作[14-19]。有文獻指出付紅靖等人[20]開發了一種具有親水性和強陽離子交換功能的毛細管柱,并研究了這一柱體的保留機制,成功地分離出兩性化合物肽和微小結構差異的吡啶化合物。Nicola H等[21]制備了在分離高極性堿性化合物樣品時具有良好的保留性和選擇性,且不會出現峰形拖尾和過載現象的反相/陽離子交換混合色譜柱;劉會娟等[22]制備表面帶正電荷的反相/陰離子交換混合色譜柱,同時考察了該色譜柱對堿性化合物的分離情況,結果發現四種小分子堿性化合物(二羥丙茶堿、茶堿、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺)以及結構中含有強堿性季銨鹽的鹽酸阿米替林都具有良好的峰形,無拖尾現象,說明反相/陰離子交換混合色譜柱中的季銨基團對C18殘留的硅羥基有屏蔽作用;王曉歡[23]通過在硅膠表面鍵合巰基,進一步對表面用苯磺酸及苯基進行改性,制備了一種結合了反相、親水和陽離子交換三種混合模式的固定相,該混合柱同時具有反相疏水、HILIC親水和離子交換作用,能夠成功用于酸性、中性和堿性化合物的分離。目前商業化的混合模式色譜柱如C18/Cation,C8/Cation,C18-Amino,C8-Amino等在市場上已有銷售。

3 總結

本文首先對堿性化合物拖尾的根源進行分析,再分別從固相和流動相兩個方面進行探討解決方案。但在實際工作中,對某一堿性藥物進行分析檢測時,還需要考慮檢測目的以及待分析物的極性、溶解性、酸堿性、穩定性,是否含有異構體等因素,綜合這些因素確定選擇合適的分離方式、固定相、有機相、水相、檢測溫度、流速等檢測條件。

隨著色譜填料種類的豐富,特別是混合作用模式填料的出現,分離堿化物的固定相選擇性更大。但是從操作使用的通用性和耐用性上,選擇一種經過特殊修飾的ODS色譜柱,結合變換流動相組成,仍是改善堿性化合物分析檢測的主流選擇,特別是對水溶性樣品的分析檢測。