乙酰唑胺對圓錐角膜成纖維細胞膠原代謝的影響

謝云鵬，雷旭琴，宋 婕，李曉娜，賀 瑞，楊繼忠，馮鵬飛

(1.太原理工大學 生物醫學工程學院，太原 030024；2.山西省眼科醫院a.準分子激光室，b.角膜病科，太原 030002)

圓錐角膜是以角膜中央變薄、向前突出成圓錐形為特征的一種角膜疾病，患病率在0.030～4.790‰之間[1]。圓錐角膜的病因尚不明確，角膜基質變薄、結構改變是造成角膜向外擴張的主要原因。角膜基質占角膜厚度的90%以上，主要由膠原蛋白組成[2]，為角膜維持正常的屈光特性提供力學支持。病理狀態下，膠原合成和降解的穩態失衡，膠原纖維結構發生改變，導致基質層變薄，角膜力學性能下降，抵抗變形能力降低，在眼內壓及外界刺激下角膜擴張形成圓錐角膜[3]。膠原代謝異常是圓錐角膜發生的原因之一，膠原代謝相關的基因COLs、MMPs是圓錐角膜的易感基因[4]。已有研究[5-7]表明，圓錐角膜中膠原合成基因COLs、交聯基因LOXs的表達降低，MMPs等降解基因表達升高，膠原含量減少。改善膠原的合成及交聯程度對減緩圓錐角膜進程具有重要的意義。

圓錐角膜的治療方法主要有角膜移植、角膜交聯、佩戴接觸鏡等，臨床上根據角膜厚度等參數和圓錐角膜進程選擇合適的治療手段。晚期圓錐角膜患者需進行角膜移植術，早中期圓錐角膜可通過佩戴角膜接觸鏡進行治療，但受散光、屈光參差或高度近視、屈光不正等因素的限制[8]。角膜交聯是目前治療早期圓錐角膜的主要手段，通過膠原交聯提高角膜的力學性能可以顯著延緩圓錐角膜的進程，但交聯方案在提高氧利用率及核黃素的通透性方面仍待進一步改進，新型交聯劑的開發應用也是目前角膜交聯研究的主要課題[9]。藥物治療圓錐角膜鮮有報道，研究發現，蘿卜硫素能夠降低兔圓錐角膜模型中角膜曲率，增加角膜中央厚度，防止圓錐角膜的進展[10]，為圓錐角膜的治療提供了新思路。

乙酰唑胺是一種結晶磺胺類藥物，可用于青光眼、高原反應、水腫等疾病的治療[11-13]，在眼組織中，可通過抑制碳酸酐酶活性，減少房水生成從而降低眼壓[12]。乙酰唑胺對眼組織的作用主要集中在對眼壓的調節，對眼部其他疾病的作用尚不明確。對關節炎大鼠研究發現，乙酰唑胺藥物治療后，軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白基因表達及蛋白多糖的含量升高[14]。橫向主動脈縮窄小鼠的研究發現，乙酰唑胺可以降低心臟組織中Ⅱ型膠原蛋白的表達[15]。上述研究推測，乙酰唑胺能夠調節膠原等細胞外基質成分的代謝。鑒于此，本研究采用乙酰唑胺溶液處理人圓錐角膜成纖維細胞，分析處理后角膜細胞中膠原代謝基因表達及膠原含量的變化，探究乙酰唑胺調節圓錐角膜中膠原合成的機制。研究結果對揭示乙酰唑胺類藥物在圓錐角膜中的作用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 圓錐角膜成纖維細胞的提取及培養

人圓錐角膜組織來源于山西省眼科醫院角膜病科，為角膜移植術后的遺棄組織，實驗經太原理工大學倫理委員會批準。圓錐角膜組織按照實驗室前期建立的方法用 0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶消化提取角膜成纖維細胞，加入含體積分數10%胎牛血清(FBS，Gibco)、體積分數1%青鏈霉素的DMEM/F12培養基(HyClone)，于37 ℃、體積分數5%CO2孵育箱中培養，傳代3～4 次的細胞進行乙酰唑胺藥物處理。

1.2 乙酰唑胺藥物處理

將提取的圓錐角膜成纖維細胞以3×105個細胞/孔的密度接種到六孔板中，貼壁后更換為不含血清的DMEM/F12基礎培養基，饑餓處理 6 h后加入100 μmol/L乙酰唑胺溶液，繼續培養 24 h 后收集細胞和培養液上清，用于后續基因和蛋白水平檢測。以相同培養條件下未進行乙酰唑胺處理的細胞作為對照。

1.3 實時熒光定量PCR( qPCR )檢測基因表達

收集的圓錐角膜成纖維細胞經PBS清洗后，加入細胞裂解液，采用EastepSuper 總RNA 提取試劑盒(Promega，上海)提取胞內總RNA，采用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒(Takara，大連)將提取的RNA反轉錄成cDNA.采用qPCR檢測對照組和乙酰唑胺處理細胞中膠原合成(COLs)、羥基化修飾(P4Hs、PLODs)、交聯(LOXs)、降解(MMPs、TIMPs)相關基因及抗氧化酶基因(NQO-1、HO-1)的表達變化。引物信息如表1所示，以管家基因GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 qPCR引物Table 1 List of Primers for qPCR

1.4 膠原含量檢測

收集的細胞培養液上清經離心去沉淀后直接用于胞外膠原含量檢測；細胞經PBS清洗后，加入適量體積的RIPA裂解液(含體積分數1%磷酸酶抑制劑和體積分數1% 蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10 min，12 000 g離心10 min，取上清檢測胞內膠原含量。

使用BCA試劑盒對待測樣本中的總蛋白進行定量。采用人總膠原ELISA試劑盒(酶免，上海)檢測樣本中總膠原含量的變化，按照試劑盒說明書檢測450 nm波長處OD值的變化，根據標準曲線計算樣本中總膠原的含量。采用Western blot 法檢測胞內I 型膠原的表達，20 μg總蛋白通過8% SDS-PAGE電泳分離，并轉移至PVDF膜(Millipore，美國)。將膜放置于質量濃度為5%脫脂奶粉中，室溫條件下進行封閉處理2 h，分別加入鼠抗人Collagen I抗體和GAPDH抗體(1∶500)(Servicebio，武漢)，4 ℃孵育過夜。一抗孵育結束后加入HRP偶聯的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武漢)，室溫孵育1 h.漂洗后使用ECL發光試劑盒顯影，采用ImageJ分析軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以GAPDH為內參，比較乙酰唑胺處理前后圓錐角膜成纖維細胞中I型膠原的表達。

1.5 細胞內氧化應激水平檢測

乙酰唑胺處理后，采用活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA(10 μmol/L)孵育圓錐角膜成纖維細胞，通過熒光倒置顯微鏡成像，使用 ImageJ 1.8.0 軟件對熒光強度進行定量，分析乙酰唑胺處理后細胞內 ROS 含量變化。收集乙酰唑胺處理后的細胞，通過反復凍融裂解細胞，取上清，BCA法蛋白定量后采用丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(索萊寶，北京)和總氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(普利萊，北京)檢測細胞內 MDA 含量和T-AOC的變化。

1.6 數據分析

每組實驗重復3次(n=3)，使用 SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析，p<0.05認為在統計學上有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 乙酰唑胺調節圓錐角膜成纖維細胞膠原代謝相關基因的表達

為了探討乙酰唑胺類藥物在圓錐角膜成纖維細胞基質重塑過程中的作用，本研究通過qPCR分析了乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞膠原蛋白合成和降解相關基因的表達變化。結果如圖1所示，與對照組相比，乙酰唑胺處理組中COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1等膠原合成基因的表達顯著上調(圖2(a)，p<0.05).脯氨酰 4-羥化酶(P4H)和前膠原賴氨酸2-氧代戊二酸5-雙加氧酶(PLOD)參與脯氨酰和賴氨酰殘基的羥基化修飾，在膠原蛋白組裝、成熟過程中起重要作用。乙酰唑胺處理后，圓錐角膜成纖維細胞中膠原羥基化修飾基因P4HA、P4HB和PLOD2、PLOD3的表達沒有顯著變化(圖2(b)、(c))，而參與膠原交聯的賴氨酰氧化酶基因LOX3、LOX4的表達顯著升高(圖2(d)，p<0.05).基質金屬蛋白酶(MMP)及其組織抑制因子(TIMP)參與膠原的降解，相較對照組，乙酰唑胺處理組中MMP2、MMP3、MMP9的表達顯著下降(圖2(e)，p<0.05)，TIMP1、TIMP2、TIMP4的表達顯著上調(圖2(f)，p<0.05).

圖1 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞內膠原合成和降解相關基因的表達變化Fig.1 Expression of genes related to collagen synthesis and degradation in acetazolamide treated keratoconus cells

圖2 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞中膠原含量變化Fig.2 Changes of collagen content in keratoconus fibroblasts after acetazolamide treatment

2.2 乙酰唑胺提高圓錐角膜成纖維細胞中膠原蛋白的含量

采用ELISA方法分析乙酰唑胺處理后胞內外總膠原含量的變化，結果顯示，乙酰唑胺處理24 h后圓錐角膜成纖維細胞培養液上清及胞內總膠原含量均顯著增加(圖2(a)，p<0.05).I型膠原是角膜細胞外基質的主要成分，采用Western blot 進一步檢測I型膠原的表達變化，如圖2(b)所示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞中 I 型膠原蛋白表達為對照組的 5 倍(p<0.05).

2.3 乙酰唑胺抑制圓錐角膜成纖維細胞內氧化應激水平

為深入探究乙酰唑胺調節圓錐角膜成纖維細胞中膠原合成的機制，本研究進一步分析了乙酰唑胺處理后細胞內氧化應激水平的變化。如圖3所示，乙酰唑胺處理后，角膜成纖維細胞中ROS水平顯著降低(p<0.05).進一步檢測氧化應激標記物MDA 含量和細胞總抗氧化能力、抗氧化酶表達的變化，結果發現，乙酰唑胺處理后，胞內 MDA 含量下降(圖4(a))，細胞總抗氧化能力提高(圖4(b))，抗氧化酶基因NQO-1的表達顯著升高(圖4(c))(p<0.05).

圖3 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞內ROS含量變化Fig.3 ROS level in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts

圖4 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞內MDA含量、總抗氧化能力及抗氧化酶基因表達的變化Fig.4 MDA content，T-AOC，and gene expression of antioxidant enzymes in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts

3 討論

探索能從根本上改善膠原降解、增強角膜力學性能的方法，對減緩圓錐角膜進程、治療圓錐角膜具有重要意義。目前，臨床上晚期圓錐角膜患者不得不進行角膜移植術，早中期圓錐角膜的治療手段仍主要依賴佩戴角膜接觸鏡，膠原交聯治療圓錐角膜仍在探索改進中，尚無藥物治療圓錐角膜的報道。研究發現，乳鐵蛋白能夠保護人角膜上皮細胞免受氧化應激損傷，可用于治療氧化應激導致的眼部疾病[16]。蘿卜硫素能夠激活兔角膜組織中Nrf-2/HO-1抗氧化信號途徑，減緩圓錐角膜的進展[10]。本研究發現乙酰唑胺可以調節角膜細胞氧化應激水平，增加圓錐角膜I型膠原及交聯蛋白的表達，下調MMPs表達，降低圓錐角膜細胞外基質的降解。

膠原是角膜細胞外基質的主要成分，膠原的含量和結構對角膜的結構和功能維持具有重要作用[17]。膠原合成和降解失衡，形態和排列發生改變，能夠導致角膜抗變形能力降低、生物力學性能下降，進而誘導圓錐角膜的發生。已有研究表明，圓錐角膜患者的眼淚中膠原降解酶MMPs 的表達提高，膠原降解產物增加[2]。轉錄組測序結果發現，圓錐角膜中COL5、COL6、COL12等膠原合成基因的表達下調，膠原羥基化修飾基因P4Hs、PLODs 及交聯基因LOXs 的表達降低[5，7，18]。蛋白組學分析結果顯示，與正常角膜相比，圓錐角膜中I 型、 III 型膠原等細胞外基質蛋白含量顯著降低[3]。qPCR 結果顯示，圓錐角膜細胞中 COL1的表達降低[19]。上述已有研究表明，圓錐角膜中膠原合成及羥基化修飾基因表達降低，膠原降解增加，膠原含量減少。本研究結果顯示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞中編碼I、III、V、VI膠原基因及膠原交聯酶基因LOXs的表達升高，膠原降解蛋白基因MMPs的表達下降，膠原修飾基因 P4Hs、PLODs的表達沒有顯著變化。 I 型膠原是角膜細胞外基質的主要成分，占總膠原蛋白的 60%[20].進一步分析結果顯示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細胞中I型膠原含量降低。本研究結果表明，乙酰唑胺能夠促進圓錐角膜細胞中膠原的合成和交聯，減少其降解。

氧化應激參與多種眼部疾病的發生，在圓錐角膜的發病過程中發揮重要的作用[21-22]。對文獻報道的圓錐角膜中的氧化應激標志物進行系統分析，結果發現與健康對照組相比，圓錐角膜中ROS以及MDA含量顯著增加，總抗氧化能力降低，氧化-抗氧化穩態失衡[23]。氧化應激可以通過調節細胞外基質重塑參與多種疾病的發生。對癌細胞的研究表明，H2O2可以通過下游的MAPK途徑、PI3K途徑激活MMPs[24].ROS能夠通過NF-κB信號途徑誘導大鼠腦星形膠質細胞MMP9的表達[25]。在腎臟組織中，ROS可通過TGF-β1通路調節膠原的合成和降解[26]。對肺動脈平滑肌細胞的研究發現，乙酰唑胺可以減弱由缺氧誘導產生的活性氧[27]，推測乙酰唑胺可能通過調節氧化應激水平發揮作用。本研究發現乙酰唑胺處理后，圓錐角膜成纖維細胞中氧化應激標記物含量減少，抗氧化酶表達及細胞總抗氧化能力升高，表明乙酰唑胺能夠降低圓錐角膜成纖維細胞中氧化應激水平，進而通過氧化應激介導的信號途徑調節膠原的代謝。

角膜組織與其他結締組織不同，需要保持透明。圓錐角膜治療除了要考慮改善膠原蛋白含量及交聯程度，還要避免瘢痕的形成。III型膠原是瘢痕組織主要表達的膠原蛋白，雖然本研究發現乙酰唑胺能改善圓錐角膜成纖維細胞I型膠原的表達，誘導III型膠原亞基編碼基因的表達，但是否會影響III型膠原的含量還不明確。鑒于此，后續實驗將進一步考量乙酰唑胺對III型膠原等調節角膜透明度的蛋白或蛋白多糖含量的影響，以及對角膜組織力學性能的作用，為該類藥物改善圓錐角膜發展進一步提供實驗依據。

綜上所述，乙酰唑胺能夠通過調節氧化應激水平，增強細胞抗氧化能力，減少氧化損傷，進而誘導圓錐角膜成纖維細胞膠原的合成，抑制膠原降解。本研究結果可為圓錐角膜的治療提供新思路。