數(shù)字PCR技術(shù)在國(guó)門生物安全保障領(lǐng)域的應(yīng)用

王藝凱 齊 瑋 楊 詣 王占坤 王勝利 陳芊如 孔維恒 芮 孝 邱 燁 劉 鑫*

（1.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026；2.南佛羅里達(dá)大學(xué)，佛羅里達(dá)州 33620；3.新羿生物科技（北京）有限公司，北京 102299；4.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100084）

1 前言

國(guó)門生物安全是人民健康、社會(huì)安定、國(guó)家利益的重要保障。當(dāng)前，國(guó)門生物安全已成為我國(guó)面臨的重大安全問題和重要挑戰(zhàn)。隨著我國(guó)出入境人員和進(jìn)出口貨物的逐年增加，海關(guān)檢驗(yàn)檢疫的工作量也急劇增加。此外，對(duì)進(jìn)出口食品檢驗(yàn)、飼料中的動(dòng)物源成分檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)需求也逐年增加，同時(shí)還要求檢測(cè)時(shí)間更短、檢測(cè)結(jié)果更加精準(zhǔn)。核酸檢測(cè)以其靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短的特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛用于各種病原體的檢測(cè)和動(dòng)植物來源物質(zhì)的鑒別等領(lǐng)域，而數(shù)字PCR作為第三代PCR技術(shù)，以其靈敏度高、絕對(duì)定量、耐抑制好等特點(diǎn)受到生物檢測(cè)領(lǐng)域業(yè)內(nèi)人士越來越多的關(guān)注。

“ 數(shù)字PCR ”的概念最早于1999年由霍普金斯大學(xué)的Kenneth Kinzler 與 Bert Vogelstein 明確定義，他們?cè)谡撐闹忻枋隽送ㄟ^分割樣品于96孔板和384孔板中進(jìn)行一系列的PCR來定量檢測(cè)樣品中的Kras突變的方法[1]。數(shù)字PCR技術(shù)的核心概念是將熒光定量PCR反應(yīng)體系分割為大量獨(dú)立的PCR子反應(yīng)，每個(gè)子反應(yīng)單元中包含或不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)核酸分子，每個(gè)子反應(yīng)單元進(jìn)行平行的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)每個(gè)子反應(yīng)單元的終點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行分析。由于目標(biāo)核酸分子的分散符合泊松分布，通過統(tǒng)計(jì)陰性和陽(yáng)性子反應(yīng)單元的數(shù)目和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析就能計(jì)算出原始樣品中目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)[2]。數(shù)字PCR中最常見的微小反應(yīng)單元形式包括液滴和微孔，其中液滴數(shù)字PCR采用基于微流控的液滴技術(shù)實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)體系的分割[3]；微孔數(shù)字PCR采用基于微納米加工技術(shù)的微孔芯片形成大量獨(dú)立的反應(yīng)單元[4]。

數(shù)字PCR相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，具有絕對(duì)定量、靈敏度高、精度高、對(duì)抑制劑容忍度高的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)上述的數(shù)字PCR原理可知，此技術(shù)可以直接計(jì)算目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)，無需如熒光定量PCR一般依賴于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，因此數(shù)字PCR能夠提供更準(zhǔn)確可靠的定量結(jié)果，理論上可以達(dá)到定量單個(gè)分子的效果。此外，由于樣品被分散在大量隔離的微反應(yīng)單元中，目標(biāo)模板受到背景模板的競(jìng)爭(zhēng)和干擾減少，因此數(shù)字PCR的靈敏度更高，能夠在野生型模板的背景下檢測(cè)罕見的突變[5]。同時(shí)，大量分散也使得數(shù)字PCR對(duì)樣品中存在的抑制劑有更高的容忍度。

由此可見，數(shù)字PCR這一新興的核酸檢測(cè)技術(shù)能夠“ 滿足 ”海關(guān)檢驗(yàn)檢疫精準(zhǔn)定量的需求。本文將對(duì)數(shù)字PCR技術(shù)在國(guó)境衛(wèi)生檢疫、動(dòng)物病原菌檢疫、植物病原菌檢疫、動(dòng)物源性成分檢測(cè)及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)等方向的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景進(jìn)行介紹和論述。

2 數(shù)字PCR技術(shù)在國(guó)境衛(wèi)生檢疫中的應(yīng)用

2.1 高靈敏度新冠病毒核酸檢測(cè)

目前被廣泛用于COVID-19診斷的RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)為疫情防控提供了很大的幫助，但其存在假陰性率高的問題[6,7]。引物和探針靶區(qū)域突變、樣本中的病毒量不足、采樣過程不規(guī)范、運(yùn)輸不當(dāng)和樣本中存在擴(kuò)增抑制劑等多種因素都可能造成假陰性結(jié)果[8]。而數(shù)字PCR技術(shù)因其靈敏度高和耐抑制較好的特性，能夠有效的減少檢測(cè)SARS-CoV-2時(shí)出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。在比較基于數(shù)字PCR和RT-qPCR的 SARSCoV-2檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限（LoD）的研究工作中，科研人員發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR的方法具有更低的LoD和更高的靈敏度[9-11]。對(duì)比臨床樣本的陽(yáng)性檢出率，部分RT-qPCR檢測(cè)為疑似或陰性的COVID-19 樣本，數(shù)字PCR都成功檢測(cè)出陽(yáng)性[9,11-15]。其中，在Suo等人[9]的研究中，26例COVID-19確診患者的樣本被數(shù)字PCR成功檢 出，而這些樣本的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。此外， Falzone等人[10]的研究也顯示數(shù)字PCR對(duì)擴(kuò)增抑制劑的作用較不敏感。由此說明，數(shù)字PCR在低病毒載量樣本的檢測(cè) 中具有優(yōu)勢(shì)，能夠作為RTqPCR的補(bǔ)充。

2.2 流感病毒的定量和分型

流感病毒目前仍然是對(duì)公共衛(wèi)生具有巨大威脅的呼吸道病原體[16]。通過每年注射疫苗的方法，我們可以最大程度的降低季節(jié)性流感造成的危害，而疫苗是否有效取決于對(duì)每年流感病毒的準(zhǔn)確定型。現(xiàn)在世界范圍內(nèi)造成季節(jié)性流感的流感病毒主要有兩個(gè)型別，4種亞型，分別是甲流H1、甲流H3、乙流Victoria和乙流Yamagata[17]，在流感病毒感染者中有0.5%～3%的是雙重感染。熒光定量PCR法可以對(duì)甲乙流病毒進(jìn)行分型，也可以對(duì)乙流病毒的兩種亞型進(jìn)行區(qū)分，但還沒有用熒光定量PCR法對(duì)流感病毒的4種亞型進(jìn)行同時(shí)分型檢測(cè)的報(bào)道。香港大學(xué)Leong等人開發(fā)的數(shù)字PCR流感病毒六重聯(lián)檢方法，可以在一管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)區(qū)分流感病毒的4種亞型[18]。與多管分別檢測(cè)相比，單管多重聯(lián)檢在降低試劑成本、減少樣品消耗、縮短操作時(shí)間和降低移液誤差等方面有明顯優(yōu)勢(shì)。Leong等人開發(fā)的方法中另外兩重檢測(cè)是對(duì)甲乙流病毒分別進(jìn)行精確定量。對(duì)流感病毒的精確定量可以方便醫(yī)生評(píng)估病情和對(duì)臨床準(zhǔn)確預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。而熒光定量PCR法由于對(duì)病毒定量要依賴外部標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)信噪比有較高的要求，造成不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果存在較大差異，可重復(fù)性較差。

2.3 HIV感染者治療效果的評(píng)估

現(xiàn)在全球大約有七千萬(wàn)HIV感染者，我國(guó)的HIV感染者也有逐年增加的趨勢(shì)。隨著抗病毒藥物的發(fā)展，目前的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）通過抑制病毒復(fù)制可以有效地抑制HIV感染者血漿中的病毒量。很多感染者的血漿病毒血癥被抑制在目前可用的診斷方法的檢測(cè)限以下[19]。然而，即使在最佳治療的情況下，很大一部分患者仍處于低水平病毒血癥狀態(tài)[20,21]，在體內(nèi)形成所謂的HIV庫(kù)。量化具有復(fù)制能力的HIV庫(kù)對(duì)評(píng)估治療策略至關(guān)重要。加州大學(xué)圣地亞哥分校的Strain等人以HIV的pol基因和2-LTR為靶點(diǎn)開發(fā)了一種數(shù)字PCR檢測(cè)方法[22]。經(jīng)過對(duì)300多份臨床樣本的檢測(cè)分析，與qPCR相比，這個(gè)方法的檢測(cè)精度有顯著的提高，特別是病毒載量較低的樣本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pol拷貝數(shù)的變異系數(shù)平均下降了5倍，2-LTR的檢測(cè)精度提高了20倍。哈佛醫(yī)學(xué)院Henrich等人的研究得出了類似的結(jié)果[23]。比利時(shí)根特大學(xué)和根特大學(xué)醫(yī)院的Kiselinova等人以細(xì)胞相關(guān)HIV RNA為靶點(diǎn)，對(duì)比了數(shù)字PCR和巢式qPCR法，數(shù)字PCR在檢測(cè)病毒載量較低的樣本時(shí)有明顯的優(yōu)勢(shì)[24]。在2013年對(duì)一個(gè)因母嬰傳播而感染HIV的嬰兒進(jìn)行抗病毒治療時(shí)，采用了數(shù)字PCR檢測(cè)病毒載量[25]。嬰兒出生18個(gè)月后HIV檢測(cè)不到后停止了治療，嬰兒30個(gè)月大時(shí)復(fù)診仍保持HIV檢測(cè)不到，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HIV感染的治愈。整個(gè)治療過程中數(shù)字PCR對(duì)HIV病毒的高靈敏檢測(cè)起了至關(guān)重要的的作用。

2.4 登革熱病毒檢測(cè)

登革熱病毒是一種通過蚊蟲傳播的病毒，每年造成約3.9億人感染。它會(huì)引起登革熱、出血性登革熱和登革休克綜合征，是所有熱帶國(guó)家和地區(qū)的一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題[26,27]。目前，還沒有針對(duì)登革熱病毒的特效藥和疫苗[28]，對(duì)登革熱、出血性登革熱和登革熱休克綜合征只能進(jìn)行對(duì)癥治療。快速準(zhǔn)確的確診登革熱病毒感染可以幫助醫(yī)護(hù)工作者提供有效合理的治療措施。現(xiàn)有的基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法可以快速得到檢測(cè)結(jié)果，但靈敏度有限[29,30]，qRT-PCR法雖然有較高的靈敏度，但因?yàn)樾枰獦?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，而配制標(biāo)準(zhǔn)品和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線受人為等外界影響較大，增加了檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤的幾率，也造成不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果差別較大，無法互相參考。泰國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)發(fā)展局的Mairiang等人以登革熱病毒的保守序列為檢測(cè)靶點(diǎn)，開發(fā)了數(shù)字PCR登革熱病毒檢測(cè)方法，可以對(duì)4種亞型的登革熱病毒實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)[31]。相較于qPCR法，數(shù)字PCR法具有更低的檢測(cè)下限和定量下限，不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果的一致性也更好，為藥物和疫苗的多中心臨床實(shí)驗(yàn)提供了保障。此外，利用了數(shù)字PCR絕對(duì)定量的特點(diǎn)，Mairiang等人還發(fā)現(xiàn)登革熱病人和出血性登革熱病人樣本中病毒載量有明顯差別，證實(shí)了病毒載量與病情輕重之間的關(guān)系。由于登革熱病毒有4種亞型，所以在疫苗研發(fā)的過程中要對(duì)一個(gè)樣本中的4種登革熱病毒同時(shí)定量。法國(guó)巴斯德公司的研發(fā)人員利用數(shù)字PCR適合做多重檢測(cè)的特點(diǎn)，開發(fā)了在一管中同時(shí)定量4種亞型的登革熱病毒的方法[32]。整個(gè)方法的檢測(cè)結(jié)果與qPCR法單獨(dú)亞型檢測(cè)具有很好的一致性，但大大降低了對(duì)工作量和樣品量的要求。

3 數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用

3.1 非洲豬瘟病毒檢測(cè)

非洲豬瘟病毒（ASFV）會(huì)引起嚴(yán)重的跨界傳染病——非洲豬瘟，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為預(yù)防和控制非洲豬瘟，一旦出現(xiàn)可疑癥狀，應(yīng)立即停止動(dòng)物和豬肉制品的流動(dòng)，然后通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行診斷。鄭州大學(xué)的Jia Rui等人和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的Wu Xulong等人分別在不同的數(shù)字PCR平臺(tái)上開發(fā)了非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法[33,34]。相較于qPCR，數(shù)字PCR法展現(xiàn)了更好的可重復(fù)性和耐抑制性，其中四川農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的數(shù)字PCR方法的檢測(cè)下限達(dá)到了10拷貝/測(cè)試，檢測(cè)靈敏度是qPCR的10倍。 廣西大學(xué)的Shi Kaichuang 等人開發(fā)了一種數(shù)字PCR多重聯(lián)檢方法，可以在一管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)非洲豬瘟病毒、普通豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒。與多重qPCR相比，該方法具有更高的陽(yáng)性檢出率[35]。

3.2 豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）于1971年在歐洲首次發(fā)現(xiàn)，傳遍歐洲后又先后傳播到了東亞和美國(guó)，這種疾病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)方法包括臨床觀察，組織學(xué)觀察，中和試驗(yàn)， 免疫熒光和免疫組織化學(xué)，但這些方法都耗時(shí)太長(zhǎng)而且不適合做高通量檢測(cè)。而qPCR法因?yàn)樾枰?biāo)準(zhǔn)曲線容易引起檢測(cè)結(jié)果的偏差。暨南大學(xué)和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員聯(lián)合開發(fā)了一種數(shù)字PCR方法來檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒，檢測(cè)下限達(dá)到了0.26 拷貝/微升，檢測(cè)靈敏度是qPCR法的5.7倍[36]。

3.3 偽狂犬病毒檢測(cè)

偽狂犬病病毒[PRV]是一種常見的皰疹病毒，它可以導(dǎo)致豬的流產(chǎn)、呼吸窘迫、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和仔豬死亡，對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)影響[37]。傳統(tǒng)的偽狂犬病病毒檢測(cè)方法包括病毒的分離培養(yǎng)和抗體的血清學(xué)檢測(cè)，這些方法結(jié)果可靠但耗時(shí)長(zhǎng)而且對(duì)操作的要求高[38,39]。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的Ren, Meishen等人開發(fā)的雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)野生型毒株和注射疫苗后產(chǎn)生的基因缺陷型毒株[40]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的靈敏度是qPCR法的16倍并且具有很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。這個(gè)雙重?cái)?shù)字PCR偽狂犬病毒檢測(cè)方法不但可以高靈敏的檢測(cè)到偽狂犬病毒，而且可以準(zhǔn)確評(píng)估注射疫苗后的效果，為疫苗的開發(fā)和施打策略提供參考依據(jù)。

4 數(shù)字PCR技術(shù)在植物檢疫中的應(yīng)用

4.1 瓜類果斑病菌檢測(cè)

瓜類果斑病菌可以引發(fā)瓜類的細(xì)菌性果實(shí)斑點(diǎn)病[41]，自1987年首次在西瓜中發(fā)生細(xì)菌性果實(shí)斑點(diǎn)病以來，它已成為瓜類作物生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅[42]。瓜類果斑病菌主要通過種子傳播[43]，因此，種子的檢測(cè)對(duì)病害管理具有重要意義。北京農(nóng)林科學(xué)院的Yu Lu等人開發(fā)了基于數(shù)字PCR的檢測(cè)方法[44]，他們以培養(yǎng)的病菌和提取的DNA為樣本比較了數(shù)字PCR和qPCR法的檢測(cè)下限的，數(shù)字PCR法的靈敏度是qPCR的10倍。然后他們又以201份未知的西瓜和香瓜、商業(yè)種子為待測(cè)樣本，對(duì)比了兩種分子方法和平板培養(yǎng)法的檢出陽(yáng)性樣本數(shù)，結(jié)果顯示數(shù)字PCR是平板培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性樣本數(shù)的2.6倍；是qPCR檢出陽(yáng)性樣本數(shù)的12倍。

4.2 馬鈴薯病毒檢測(cè)

植物病毒的量化對(duì)于監(jiān)測(cè)感染的進(jìn)展，以及病毒在一個(gè)季節(jié)的時(shí)間內(nèi)不同植物組織中的滴度變化非常有用[45]，它為流行病學(xué)研究和優(yōu)化診斷抽樣提供了重要信息依據(jù)。此外，病毒量化在研究植物對(duì)病毒感染的反應(yīng)中涉及的代謝途徑的基因功能方面也很重要[46]。然而，馬鈴薯病毒這類RNA病毒有較高的突變率，造成引物探針對(duì)不同序列的模板的擴(kuò)增效率不同，這給病毒的核酸檢測(cè)特別是準(zhǔn)確定量帶來了困難。數(shù)字PCR是對(duì)單個(gè)微滴中的單個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增和終點(diǎn)法計(jì)數(shù)，定量結(jié)果不受擴(kuò)增效率的影響。基于這個(gè)原理，斯洛文尼亞國(guó)家生物研究所的Mehle等人開發(fā)了數(shù)字PCR馬鈴薯病毒檢測(cè)方法，他們以3種不同基因型的毒株為模板比較了數(shù)字PCR和qPCR法的檢測(cè)靈敏度[47]。結(jié)果顯示，這兩種方法對(duì)其中一種基因型毒株的檢測(cè)靈敏度接近。對(duì)于其它兩種基因型的毒株，數(shù)字PCR的檢測(cè)靈敏度都是qPCR的10倍。此外，研究者還以數(shù)字PCR定量的核酸為標(biāo)準(zhǔn)品，比較了3組qPCR的引物探針，結(jié)果證明數(shù)字PCR可以用來校準(zhǔn)qPCR法的檢測(cè)結(jié)果。

5 數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物源檢測(cè)中的應(yīng)用

肉類摻假已經(jīng)成為了一個(gè)世界范圍的問題，涉及食品和飼料行業(yè)，此外，皮毛、奶酪等動(dòng)物制品也是摻假的高發(fā)區(qū)。它雖然不會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康直接造成危害，但用廉價(jià)原材料進(jìn)行替代或摻假，為不法食品提供了一條誘人的捷徑并且?guī)砹藵撛诘墓步】碉L(fēng)險(xiǎn)。因此,發(fā)展一種準(zhǔn)確可靠的測(cè)定特定肉類成分含量的方法 在食品方面具有重大的經(jīng)濟(jì)意義和深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。相比蛋白，脂類等其它生物物質(zhì)，DNA更加穩(wěn)定，即使經(jīng)過加工，形態(tài)發(fā)生變化，部分樣本受損，DNA序列信息也不會(huì)改變，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果；而且DNA存在于生物的任何組織部位，取樣更加方便，也具有更高的種屬特異性，這使得包括分子雜交、PCR、熒光定量PCR（qPCR）、多重PCR、數(shù)字PCR和等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于肉類的動(dòng)物源檢測(cè)中。其中數(shù)字PCR以其精準(zhǔn)可靠、對(duì)樣本類型適應(yīng)度高、適合開發(fā)多重檢測(cè)的特點(diǎn)，不僅可以準(zhǔn)確判斷動(dòng)物源成分是否存在摻假還可以對(duì)摻假成分進(jìn)行精確定量。

5.1 區(qū)分牛、馬和豬源成分

線粒體基因CYTB廣泛存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并且有較高的拷貝數(shù)，因此在很多研究中被用來作為物資鑒定的靶標(biāo)[48-50]。德國(guó)哥廷根大學(xué)的Floren等人在開始開發(fā)數(shù)字PCR動(dòng)物源檢測(cè)方法時(shí)也選擇了CYTB基因作為靶標(biāo)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CYTB基因在不同組織（脂肪和肌肉）之間至少有5倍的差異，不適合用來作為動(dòng)物源檢測(cè)和定量的靶標(biāo)。因此，他們選擇以核基因F2為靶點(diǎn)的開發(fā)了數(shù)字PCR動(dòng)物檢測(cè)方法，以小牛肝香腸、肉制品、冷凍肉為樣本檢測(cè)了靈敏度。結(jié)果顯示，這個(gè)方法區(qū)分牛、馬和豬源成分的定量下限達(dá)到了0.01%，檢測(cè)下限達(dá)到了0.001%[51]。

5.2 開發(fā)檢測(cè)鴨源成分標(biāo)準(zhǔn)品

因?yàn)轼喨獾膬r(jià)格相對(duì)較低，經(jīng)常被不法商販摻入或者直接當(dāng)作其它肉類銷售。市場(chǎng)上非常需要靈敏可靠的檢測(cè)產(chǎn)品。浙江省農(nóng)科院和中國(guó)農(nóng)科院的研究人員以interleukin 2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，在數(shù)字PCR平臺(tái)上開發(fā)了檢測(cè)鴨源成分的標(biāo)準(zhǔn)品[52]。在標(biāo)準(zhǔn)品的開發(fā)過程中，8個(gè)獨(dú)立的診斷實(shí)驗(yàn)室通過數(shù)字PCR對(duì)這些鴨子的基因組標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行了檢驗(yàn)和認(rèn)證，結(jié)果具有很好的一致性，確認(rèn)IL2基因的平均拷貝數(shù)為5.78±0.51×103拷貝/μL。同質(zhì)性和穩(wěn)定性測(cè)試表明，在-20℃存儲(chǔ)和冷鏈交付條件下，標(biāo)準(zhǔn)品在至少6個(gè)月內(nèi)是均勻和穩(wěn)定的。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品可作為肉制品中鴨含量分析方法的驗(yàn)證和性能測(cè)試的必要工具。這個(gè)研究也為其他動(dòng)物源性參考物質(zhì)的開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。數(shù)字PCR絕對(duì)定量、重復(fù)性好的特點(diǎn)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

5.3 羊肉中雞源成分的檢測(cè)

大量的研究用qPCR法來定量動(dòng)物源成分[53-56]。然而，利用實(shí)時(shí)PCR的Ct值計(jì)算的拷貝數(shù)會(huì)受到擴(kuò)增效率和DNA溶液中雜質(zhì)的影響。與實(shí)際拷貝數(shù)的差異會(huì)導(dǎo)致不同物種重量比例的量化有較大偏差。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院的研究人員在數(shù)字PCR平臺(tái)上開發(fā)了雞源成分的檢測(cè)方法，并檢驗(yàn)了該方法在羊肉樣本中檢測(cè)雞源成分的靈敏度、精確性和穩(wěn)定性[57]。結(jié)果顯示，該方法的定量下限為1%，檢測(cè)下限為0.1%。與qPCR相比，在雞源成分比例5% ～ 80%范圍內(nèi)的偏差降低9%。此外，雞肉的部位對(duì)定量的準(zhǔn)確性沒有影響，而且在不同的壓力和溫度條件下，可以保持較高的精確度。

6 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用

農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高糧食產(chǎn)量、提高農(nóng)作物抗性、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮了巨大的作用，但同時(shí)也引起了生物安全和消費(fèi)者安全的擔(dān)心。目前qPCR被用來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物并展現(xiàn)了較好的靈敏度和特異性。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)基因靶點(diǎn)核酸在樣品中占比較小時(shí)，擴(kuò)增檢測(cè)會(huì)被大量非靶點(diǎn)核酸干擾，對(duì)轉(zhuǎn)基因靶點(diǎn)的量化會(huì)受產(chǎn)生嚴(yán)重的偏差。另一個(gè)重要的限制是qPCR對(duì)從復(fù)雜基質(zhì)中核酸提取物中抑制劑的高敏感性。數(shù)字PCR因?yàn)槭前褑蝹€(gè)核酸模板隔離后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，從而避免了其它非靶點(diǎn)核酸的干擾，同時(shí)也大大降低了核酸提取物中抑制劑對(duì)反應(yīng)的干擾。因此，人們對(duì)在數(shù)字PCR平臺(tái)上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)進(jìn)行了充分的研究和開發(fā)。轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的數(shù)字PCR 檢測(cè)方法也被寫入了我國(guó)海關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

6.1 雙重?cái)?shù)字PCR定量轉(zhuǎn)基因克螟稻

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的Li Jun等人，以水稻中的單拷貝基因磷脂酶D基因?yàn)閰⒖奸_發(fā)了檢測(cè)克螟稻的雙重?cái)?shù)字PCR方法[58]。該方法的檢測(cè)下限達(dá)到了9拷貝，定量下限達(dá)到了34拷貝。研究者還對(duì)比了qPCR和單重?cái)?shù)字PCR法，雖然三種方法都能在規(guī)定的范圍內(nèi)檢出轉(zhuǎn)基因物質(zhì)并給出合格的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，但雙重?cái)?shù)字PCR法的不確定區(qū)間最窄，精準(zhǔn)度最好。

6.2 轉(zhuǎn)基因玉米的絕對(duì)定量

各個(gè)國(guó)家判定農(nóng)產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)基本都以所轉(zhuǎn)的基因與內(nèi)源性基因之間的拷貝數(shù)比為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，因此需要一種靈敏度高并且可以精確定量的檢測(cè)方法給出評(píng)判的參考。qPCR法目前被用于轉(zhuǎn)基因生物的定量，但它在檢測(cè)低拷貝DNA靶點(diǎn)方面的局限性導(dǎo)致人們?nèi)ラ_發(fā)新的檢測(cè)方法。歐洲標(biāo)準(zhǔn)局的Corbisier等人建立了一種數(shù)字PCR檢測(cè)MON810基因和內(nèi)源性高遷移群蛋白A基因的方法[59]，數(shù)字PCR測(cè)定的絕對(duì)拷貝數(shù)之比和使用了質(zhì)粒DNA校準(zhǔn)的qPCR測(cè)定的絕對(duì)拷貝數(shù)之比相同。與qPCR法相比，數(shù)字PCR不需要質(zhì)粒DNA進(jìn)行校準(zhǔn)，具有更好的可重復(fù)性，更適合用來檢測(cè)所轉(zhuǎn)的基因與內(nèi)源性基因之間的拷貝數(shù)比。

7 總結(jié)和展望

數(shù)字PCR基于“ 模板有限稀釋 ”和“ PCR反應(yīng)體系離散獨(dú)立擴(kuò)增 ”的技術(shù)原理，為海關(guān)檢驗(yàn)檢疫提供了一種能夠絕對(duì)定量且靈敏度、精度、特異性、抗干擾性更佳的核酸檢測(cè)技術(shù)。綜上所述，數(shù)字PCR技術(shù)的使用能夠進(jìn)一步提高國(guó)境衛(wèi)生檢疫、動(dòng)物病原菌檢疫、植物病原菌檢疫、動(dòng)物源性成分檢測(cè)及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)等方向的結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

雖然數(shù)字PCR已被證實(shí)相比于傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)具有更多的優(yōu)勢(shì)，但距離其真正廣泛應(yīng)用于海關(guān)檢驗(yàn)檢疫，還有以下挑戰(zhàn)需要克服（1）由于樣本量大及檢驗(yàn)人員人數(shù)有限，海關(guān)對(duì)于操作的簡(jiǎn)便性與技術(shù)自動(dòng)化程度有一定要求，目前商用的數(shù)字PCR系統(tǒng)的自動(dòng)化程度還需進(jìn)一步提高；（2）數(shù)字PCR的儀器和耗材成本較傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)高，因此制約了其進(jìn)一步的使用，需要通過量產(chǎn)及原材料成本控制等手段來進(jìn)一步降低使用成本；（3）由于海關(guān)檢驗(yàn)檢疫的項(xiàng)目較多，這就要求數(shù)字PCR企業(yè)開發(fā)更多元的檢測(cè)試劑盒來滿足海關(guān)檢測(cè)各個(gè)項(xiàng)目的需求。

目前已有多家國(guó)內(nèi)數(shù)字PCR企業(yè)投入研發(fā)自動(dòng)化的一體機(jī)，相信隨著穩(wěn)定、高性能、低成本的數(shù)字PCR系統(tǒng)的面市，能夠進(jìn)一步推動(dòng)數(shù)字PCR技術(shù)在海關(guān)系統(tǒng)的應(yīng)用，提供更快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。