基于線粒體NADH1基因對棘胸蛙養殖群體的遺傳多樣性分析

章海鑫，丁國棟，吳子君，習宏斌，史小元，張燕萍*

(1.江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039；2.峽江縣農業農村局，江西 吉安 331400)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石蛙[1]。棘胸蛙是蛙類的主導養殖品種中價格最高的種類之一，棘胸蛙在長期的養殖過程中由于近親繁育，出現個體小、體質弱、畸形的現象，種質有所衰退，其生長速度慢。急需對養殖群體開展遺傳多樣性分析。

NADH1脫氫酶亞基Ⅰ是一種位于線粒體內膜催化電子從NADH傳遞給輔酶Q的酶[2]，基因變異大、進化速率快，其作為分子標記已在多頭帶絳蟲、獵豹線、四川黑熊、文昌魚等物種鑒定和分子進化分析等方面應用廣泛[2-5]。

本研究應用線粒體NADH1脫氫酶亞基Ⅰ作為分子標記，對江西省內5個棘胸蛙養殖群體的遺傳結構和變異進行了比較分析，了解群體之間的遺傳分化和種群歷史動態，為我省棘胸蛙的品種選育與改良工作提供理論基礎，為保護并合理開發利用棘胸蛙種質資源提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 棘胸蛙樣品采集

138只棘胸蛙樣本分別采自峽江(XJ，21尾)、明月山(MY，30尾)、靖安(JA，32尾)、于都(YD，25尾)、金溪(JX，30尾)。采樣地點詳見圖1。剪取適量腿部新鮮肌肉用95%乙醇保存，運回實驗室，- 20 ℃冷凍保存備用。

圖1 棘胸蛙采樣圖

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組 DNA 的制備

取少量棘胸蛙的肌肉，按照生工生物工程(上海)有限公司提供的動物基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA，核酸蛋白檢測儀測定溶度后，-20℃冷凍保存備用。

1.2.2 PCR擴增

根據Genbank 數據庫中棘胸蛙的線粒體基因組(Genbank NC_013270.1 )，采用Primer 5.0軟件設計擴增2對NADH1 基因的引物，送至生工生物工程(上海)有限公司合成，具體引物序列信息見表1。PCR 擴增體系的總體積為50 μL，其中10 mM MgCl25 μL、 10 mM dNTPs 2 μL、10 mM引物各 2 μL，模板DNA(50 ng /L)4 μL，Taq 聚合酶0.4 μL，加超純水至50 μL。PCR反應程序：95 ℃變性 40 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s ，35個循環；72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃保存。

表1 棘胸蛙NADH1基因擴增引物信息

1.2.3 PCR產物檢測和測序

PCR產物取5 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的長度和濃度合格后，將PCR產物送往生工生物工程(上海)有限公司純化與雙向測序，測序引物同上。

1.3 數據分析

將獲得棘胸蛙NADH1的基因序列應用DNAMAN軟件進行拼接并手工校對。Clustal W(1.83)軟件[6]分析比對；利用DNAsp 5.0[7]軟件統計單倍型及變異位點(S)、計算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(K)等多樣性參數。用MEGA 6.0 軟件[8]中的 Kimura 雙參數法計算各單倍型間的遺傳距離；采用鄰接法NJ(Neighbor-joining)，Bootstrap 置信值估算重復次數 1000 次，對基因序列數據進行系統分析。用Ariequin 3.11[9]軟件進行 Tajima's D 和 Fu's Fs 中性檢驗，計算群體內和群體間的遺傳分化指數(Fst)，并通過分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)對遺傳變異進行分析。

2 結果與分析

2.1 棘胸蛙NADH1基因序列PCR 擴增

PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測，棘胸蛙NADH1序列條帶電泳圖譜條帶清晰、明亮，線粒體NADH1序的片段大于1000 bp。這可說明提取的棘胸蛙肌肉DNA 質量較高，能夠用于后期的群體遺傳學研究。

2.2 棘胸蛙線粒體NDAH 1序列特征

序列經比對后，獲得的棘胸蛙樣品的線粒體NDAH1序列長度為1187 bp，未檢測到插入和缺失位點，檢測到變異位點105個，其中簡約信息位點96個，單突變位點5個(圖2)。堿基平均含量：A (28.3%)、T(30.1%)、G(13.6%)和 C(28.1%)，A + T 含量(58.3%)高于 G + C 含量(41.7%)，與大多數脊椎動物線粒體DNA序列特征基本一致。

圖2 棘胸蛙養殖群體單倍型線粒體NADH1基因的變異位點圖

圖3 5個棘胸蛙養殖群體線粒體NADH1序列的核苷酸不配對分布

2.3 單倍型分析

基于5個棘胸蛙養殖群體138條NADH1序列，共界定出41種單倍型，各單倍型分布情況見表2。其中Hap_13和Hap_5出現頻率最高，由峽江、明月山、于都以及金溪4個群體共享。5個群體中，于都群體分布的單倍型最多(13種)、金溪群體分布的單倍型最少(10種)。Hap_1、Hap_6、Hap_8、Hap_11為峽江群體的特有單倍型；Hap_14、Hap_15、Hap_21、Hap_26、Hap_28為明月山群體特有單倍型；Hap_17～Hap_20、Hap_22、Hap_24、Hap_25、Hap_27、Hap_29為于都群體特有單倍型；Hap_30～Hap_38為靖安群體的特有單倍型；Hap_39～Hap_41為金溪群體的特有單倍型。

表2 棘胸蛙單倍型在群體中的分布

2.3 遺傳多樣性分析

群體內的遺傳多樣性可以通過單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數等數據來體現。通過DnaSP 5.0軟件對本研究中江西省5個棘胸蛙養殖群體138條NADH1 序列進行核苷酸多態性分析，結果見表3。138個樣本總體單倍型多態性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.956±0.007和0.0232±0.00156。從總體上來看，單倍型多態性高則核苷酸多態性也較高，成正比關系。平均核苷酸差異數(K)為27.514，各群體平均核苷酸差異數在3.326～32.987。

表3 棘胸蛙群體的遺傳多樣性參數

2.4 遺傳結構

通過利用MEGA 6.0軟件中的Kimura 2-parameter模型，計算出5個棘胸蛙群體之間以及群體內部的遺傳距離(D)，結果如表4所示。5個棘胸蛙養殖群體內的遺傳距離在0.003～0.034之間分布，群體間的遺傳距離為0.024～0.035，平均遺傳距離為0.031。在5個養殖群體中，遺傳距離最近的為XJ與MY、XJ與JX、MY與JX，遺傳距離最遠的為XJ與JA。

表4 江西棘胸蛙養殖群體間遺傳距離(對角線下)、群體內遺傳距離(對角線)和遺傳分化系數FST值(對角線上)

2.5 遺傳差異及遺傳分化

遺傳分化指數FST值是反映各群體間遺傳分化程度高低的重要指標。通過運用Arequin 3.5軟件計算5個棘胸蛙養殖群體的遺傳分化，結果見表4。結果表明棘胸蛙兩兩群體間遺傳分化系數(FST)值在0.03594～0.55798之間，峽江群體(XJ)與于都群體(YD)間遺傳分化很小(00.25，P<0.001)[10]。

利用AMOVA軟件進行棘胸蛙群體間和群體內的遺傳變異分析，分析結果如表5所示。結果顯示群體間的變異為36.94%，群體內的變異為63.06%，群體內的變異明顯大于群體間的變異，表明遺傳變異主要來自棘胸蛙群體內部。

表5 棘胸蛙養殖群體間分子變異分析(AMOVA)

2.6 單倍型系統進化樹

基于NADH1基因序列的棘胸蛙群體的單倍型數據，構建NJ系統發育樹，見圖4。從構建的自展值50%可知，41種單倍型分成3個分支，自展值為99%。

圖4 5個棘胸蛙養殖群體單倍型的NJ系統發育

2.7 種群歷時動態分析

利用Ailequin 3.11軟件對江西省5個棘胸蛙養殖群體進行Tajima'sD與Fu'sFs檢驗，預測歷史上種群是否發生擴張。中性檢驗結果表明，宜春地區明月山群體Tajima'sD與Fu'sFs值均為負值，除明月山群體的Tajima'sD值達到極顯著水平(即P<0.01)，其他4個群體P值未達到顯著水平(P>0.05)，提示這5個群體未經歷過擴張時期(表6)。對5個棘胸蛙養殖群體NADH1序列的錯配分析發現，堿基歧點分布的期望值成典型的多峰分布，進一步支持江西省5個棘胸蛙養殖群體歷史上未經歷過種群擴張(圖3)。

3 討論

遺傳多樣性是衡量種群適應環境變化的關鍵指標，也是種質遺傳資源開發利用的物質基礎[11]。本研究采用NADH1序列對江西省5個養殖群體進行了遺傳學差異分析，結果表明江西省的棘胸蛙養殖群體具有較高的遺傳多樣性，XJ與YD群體間遺傳分化很小、JX與MY群體間存在低度的遺傳分化、其他群體之間存在高度遺傳分化。而運用COI基因對這5個養殖群體的遺傳多樣性分析中，FST指數也表明JX與MY群體遺傳分化較低，而XJ與YD及JX群體間存在顯著的較高水平的分化差異，表明NADH1比COI適于分析棘胸蛙的遺傳結構，選擇多個分子標記進行對比分析可以彌補單一標記研究種群遺傳多樣性的局限性。

江西省5個養殖群體間平均遺傳距離較小(0.024～0.035)，AMOVA分析結果顯示其遺傳變異主要來自于種群內部(63.06%)，群體間變異較小。根據NADH1 序列變異得到的NJ聚類樹形成明顯的三個單系，江西省各個縣區棘胸蛙養殖群體的單倍型呈現出一種混雜的分布格局，錯綜交織。

采用 Tajima'sD和 Fu'sFs對NADH1 序列進行種群中性檢驗，明月山群體的Tajima'sD為顯著負值，表明該基因偏離了進化的中立性，其他群體均為不顯著正值。Fu'sFs檢驗結果顯示明月山群體為不顯著負值，其他群體均為不顯著正值，顯示江西省棘胸蛙養殖群體沒有近期擴張的跡象。同時，對江西5個群體NADH1 序列的錯配分析發現，堿基歧點分布的期望值成典型的多峰分布，說明江西省棘胸蛙養殖群體歷史上未經歷過種群擴張。