基于實驗數據分析水楊酸苯酚貼膏現行質量標準

劉曉強 蔣曉勤 潘璐艷

水楊酸苯酚貼膏又名雞眼膏，是治療雞眼的常用藥，其處方由水楊酸780 g、苯酚40 g及基質適量制成1 000 g。其中水楊酸起抗真菌、止癢及溶解角質作用，苯酚則為消毒防腐劑，起殺菌、止癢作用，常見不良反應為皮膚刺激和腐蝕[1-2]。現行質量標準《國家藥品標準》（地方標準上升為國家標準）第十一冊WS-10001-（HD-0927）-2002，檢驗項目包括性狀、鑒別（酚羥基化學反應鑒別）、檢查（5片重）及含量測定（容量分析法測定水楊酸含量），而該片芯呈淡紅色至磚紅色，其含量測定項下供試品溶液呈淡紅色至紅色，而容量分析法以0.1 mol/L NaOH為滴定劑，酚酞為指示劑，滴定終點顏色變化為無色至粉紅色，滴定終點的判定明顯受到溶液顏色的影響。同時，因不同廠家供試品溶液顏色有差異，滴定終點受到影響也有差異，導致該含量分析方法準確性也有差異。此外，該標準中未涉及該復方制劑中有效成分之一苯酚的鑒別及含量測定，導致無法判定其成品制劑中是否含有苯酚及含量。筆者擬采用自建高效液相色譜法（HPLC）對水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚含量進行檢測，并將實驗結果簡要匯報如下。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（含四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器、色譜工作站，日本島津公司），島津LC-40D X3高效液相色譜儀（含四元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器、色譜工作站，日本島津公司），賽默飛 UltiMate3000高效液相色譜儀（含三元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器、色譜工作站，美國賽默飛世爾科技公司），梅特勒XP205電子天平（瑞士Mettler Toledo），Milli-Q純水機（美國Merck）。

1.2 試劑與藥品

冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司，20220610），純化水（實驗室自制），苯酚（中國食品藥品檢定研究院，100509-202005，100%），水楊酸（中國食品藥品檢定研究院，100106-202106，99.8%），4-羥基間苯二甲酸（中國食品藥品檢定研究院，101150-201602），4-羥基苯甲酸（中國食品藥品檢定研究院，101149-202204），1,4-對苯醌（中國食品藥品檢定研究院，101197-201904）。水楊酸苯酚貼膏，生產企業A（12批次），生產企業B（21批次），生產企業C（7批次），生產企業D（7批次），生產企業E（7批次），生產企業F（3批次）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件[3-5]色譜柱：C18（Shim-Nex CS C18，4.6×150 mm，5 μm），流動相：甲醇-2%冰醋酸溶液（40∶60），柱溫：35 ℃，波長：270 nm，流速：1.0 ml/min，進樣量：10 μl。

1.3.2 溶液制備方法系統適用性溶液的制備：取4-羥基苯甲酸、4-羥基苯二甲酸、1,4-對苯醌、水楊酸、苯酚各適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋成每毫升中分別約含4-羥基苯甲酸5 μg、4-羥基苯二甲酸2.5 μg、1,4-對苯醌5 μg、水楊酸5 mg與苯酚0.25 mg的混合溶液。

供試品溶液的制備：取本品20片，研細混勻，精密稱取2片量，置100 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲使水楊酸及苯酚溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得（苯酚供試品溶液）。精密量取上述溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得（水楊酸供試品溶液）。

對照品溶液的制備：取水楊酸及苯酚各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成每毫升中約含水楊酸0.312 mg、苯酚0.16 mg的溶液。

1.3.3 含量計算方法按外標法以峰面積計算供試品中的水楊酸及苯酚含量，按標示量計算。

1.3.4 方法學驗證內容依據《中華人民共和國藥典》2020年版四部9101分析方法驗證指導原則項下要求，結合本方法應用范圍（擬用于高效液相色譜鑒別、有關物質檢查以及含量測定等），筆者擬進行專屬性、精密度（對照品進樣精密度、重復性、中間精密度）、準確度、范圍及線性、耐用性（包括流速、流動相比例、柱溫、儀器以及色譜柱等）等方法學考察項目[6-8]。

2 結果

2.1 方法學驗證結果

專屬性實驗結果表明溶劑乙醇、空白基質均未在苯酚峰及水楊酸峰處出峰，不干擾檢測；系統適用性溶液中1,4-對苯醌、4-羥基苯甲酸、苯酚、4-羥基間苯二甲酸以及水楊酸等各成分色譜峰依次出峰，峰形良好，且各峰間分離度符合規定。見圖1。苯酚供試品溶液、水楊酸供試品溶液中苯酚及水楊酸色譜峰保留時間、紫外吸收峰與對照品溶液一致。

精密度實驗結果如下：對照品進樣精密度實驗中苯酚和水楊酸峰面積的相對標準偏差（RSD）依次為0.03%和0.03%，重復性實驗中6份供試品苯酚和水楊酸含量的RSD依次為0.8%和0.4%，中間精密度實驗中6份供試品苯酚和水楊酸含量的RSD依次為1.7%和0.8%。準確度實驗中苯酚和水楊酸低、中、高濃度加樣回收率為99.5%～100.6%及99.9%～100.8%.

范圍及線性實驗結果表明苯酚在0.08～0.24 mg/ml范圍內，r=0.999 97，表明線性良好，水楊酸在0.156～0.468 mg/ml范圍內，r=0.999 93，表明線性良好。耐用性實驗中，流速依次調整為0.8 ml/min及1.2 ml/min，流動相依次調整為甲醇-2%冰醋酸溶液（35∶65）及甲醇-2%冰醋酸溶液（45∶55），柱溫依次調整為30 ℃及40 ℃，高效液相色譜儀依次更換為島津LC-40D X3及賽默飛 UltiMate3000，依次采用Shim-pack VP-ODS C18（4.6×250 mm，5 μm）及XBridge C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱時，系統適用性溶液中各色譜峰峰間分離度均滿足要求，對照品進樣精密度符合要求。

綜上所述，該方法專屬性、精密度（對照品進樣精密度、重復性、中間精密度）、準確度、范圍及線性等方法學考察項目均符合規定。

2.2 含量測定結果

從圖2中可以看出6家生產企業的水楊酸苯酚貼膏中水楊酸含量（按標示量計）均高于100%，在101%～109%之間，均落在限度（90%～110%）范圍內。苯酚含量（按標示量計）均低于10%，其中A、D、E、F 4家低于1%，均不在限度（90%～110%）范圍內。見圖3。

圖2 水楊酸含量測定結果

圖3 苯酚含量測定結果

3 討論

3.1 自擬方法

筆者基于對水楊酸苯酚貼膏質量再評價的初衷建立并驗證了水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的HPLC含量測定方法。筆者選擇以乙醇而非流動相為溶解溶劑是出于水楊酸和苯酚的溶解度原因，查詢《中華人民共和國藥典》2020年版二部水楊酸及苯酚各論項下，水楊酸在乙醇或乙醚中易溶，在沸水中溶解，在三氯甲烷中略溶，在水中微溶；苯酚在乙醇、三氯甲烷、乙醚、甘油、脂肪油或揮發油中易溶，在水中溶解，在液狀石蠟中略溶。水楊酸及苯酚在甲醇中溶解度均未知，且水楊酸苯酚貼膏現行質量標準中含量測定項下所用的溶解溶劑為中性稀乙醇，基于上述幾點因素，筆者最終選用乙醇為溶解溶劑。該方法驗證過程參考了《中華人民共和國藥典》2020年版四部9101分析方法驗證指導原則項下要求，因該方法主要用于含量測定，因此主要按含量測定項下要求進行，依次驗證了專屬性、精密度（對照品進樣精密度、重復性、中間精密度）、準確度、范圍及線性、耐用性等，所有驗證項目均符合規定。同時，需指出，該方法也可用于該品種兩種主成分水楊酸及苯酚的高效液相色譜鑒別和有關物質檢查。

3.2 原因分析

本制劑為復方制劑，此次涉及的所有生產企業的水楊酸苯酚貼膏中有效成分水楊酸含量符合規定而苯酚含量均不符合規定，基本可以排除投料原因。而苯酚屬于揮發性酚類物質，其在室溫下即可揮發。因此，筆者考慮導致所有涉及批次苯酚含量均不合格的原因可能為處方及制劑工藝。筆者查詢了上述6家生產企業的水楊酸苯酚貼膏說明書，將處方簡要羅列如下：生產企業A，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蠟、色素；生產企業B，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、色素；生產企業C，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、乙醇、色素；生產企業D，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、乙醇、色素；生產企業E，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、色素；生產企業F，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蠟、色素；色素包括堿性玫瑰紅、胭脂紅等。上述基質中凡士林、羊毛脂在室溫下呈半固態，石蠟呈固態。基于上述幾種物質的特性，生產企業在工藝投料環節可采用加熱的工藝將上述物質熔化以保證原輔料混合均勻。而苯酚屬于揮發性酚類物質，在室溫下即可揮發，加熱則會加劇苯酚揮發，進一步降低產品中苯酚含量。此外，市售產品中，部分廠家并未對該產品加用藥品包裝用復合膜袋，可導致產品中的苯酚在運輸、儲藏過程中進一步揮發，導致最終測得產品中苯酚含量極低。

3.3 思考與建議

基于上述實驗數據可知，雖上述批次水楊酸苯酚貼膏按現行質量標準檢驗均合格，但實際其已基本不含有效成分之一苯酚，因此按現行質量標準無法有效控制該產品質量[9]。因此基于嚴控已上市藥物質量的角度出發，建議修訂現行質量標準，具體建議如下：1）增訂高效液相色譜鑒別項，規定供試品溶液中苯酚與水楊酸峰的保留時間應與對照品溶液中相應主峰的保留時間一致。2）增加微生物限度檢查項，規定取本品100 cm2，按《中華人民共和國藥典》2020年版檢查，需氧菌總數不得超過102cfu/10 cm2，霉菌和酵母菌總數不得超過10 cfu/10 cm2，每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。3）修訂含量測定方法，將水楊酸含量測定方法由容量分析法改為HPLC，同時增加苯酚含量測定項（HPLC），并規定按標示量計，苯酚和水楊酸含量均應為90.0%～110.0%。

此外，筆者建議各生產企業進一步優化處方，上述處方分析中，多家企業處方中含有石蠟，石蠟在室溫下呈固態，雖有助于該制劑成品中片芯保持良好的性狀，但其溶解溫度較高，可能會導致原輔料混合階段苯酚大量揮發，建議少用或不用。有生產企業處方中含有乙醇，該輔料有助于將固態的水楊酸、苯酚及色素原料轉化為水楊酸、苯酚及色素溶液，減少原輔料混合階段加溫的溫度與時長，可有效避免苯酚的揮發，建議其他生產企業參考或使用。同時建議各生產企業改進生產工藝，盡可能采用低溫攪拌工藝或物理攪拌工藝，盡可能降低制劑工藝中苯酚的揮發量。此外，為減少儲存、運輸過程中苯酚揮發量，建議在水楊酸苯酚貼膏外加藥品包裝用復合膜袋，同時在包裝盒外加用塑料復合膜。

綜上所述，本文所建立的水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的HPLC測定方法可用于水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的高效液相色譜鑒別、含量測定，上述HPLC也可進一步用于該制劑的有關物質檢查。同時，基于采用上述方法測定的含量結果，現行質量標準已無法有效控制該產品質量，建議更新標準。此外，建議各水楊酸苯酚貼膏生產企業致力于水楊酸苯酚貼膏的處方、制劑工藝以及包裝研究，以提高市場流通環節中水楊酸苯酚貼膏中苯酚含量，保障廣大患者用藥安全。