家禽附睪功能及其對睪丸后精子成熟調控機制研究進展

韓昕彤，馬騰壑,2*，李云雷，樊世杰，陳繼蘭，孫研研*

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056000；2.河北工程大學醫學院，邯鄲 056000；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193；4.北京市華都峪口禽業有限責任公司，北京 101206)

精子運動和受精能力受垂體性腺軸調控作用、睪丸內精子發生以及附睪和輸精管的成熟作用等眾多因素影響[1-2]。研究表明，剛從睪丸排出的精子功能尚不成熟。當精子通過附睪時，在附睪管腔微環境的液體、離子、蛋白質和抗氧化劑等作用下進一步成熟，獲得受精能力。傳統觀念認為附睪對家禽繁殖的作用不大，但是近年來越來越多研究表明家禽附睪對精子功能有一定調控作用。對附睪的研究可能是提升家禽繁殖效率的重要突破點。本文對家禽附睪功能及其對精子睪丸后成熟的作用機制研究進展進行綜述，以期進一步啟發家禽繁殖性能調控機制研究。

1 家禽附睪的結構

附睪和輸精管是雄性動物除睪丸以外的管狀生殖結構。附睪又稱睪丸旁導管系統，是由一部分睪丸網管、睪丸輸出管和附睪管所組成的一個高度特異的管狀器官，連接著睪丸和輸精管。雖然家禽和哺乳動物的睪丸結構非常相似，但附睪組織形態差異較大。哺乳動物附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可以分為典型的頭部(caput)、體部(corpus)和尾部(cauda)，在小鼠和大鼠的頭部近端還有起始段(initial segment)[3]。而家禽附睪發生退化，細小，呈紡錘形，緊附于睪丸背側，因有睪丸系膜遮蔽，所以不很明顯(圖1A)。家禽附睪可分為睪丸網管(rete testis)、輸出小管(efferent ductules)、附睪管(epididymal duct)、短連接管(connecting ductules)、附睪附件(appendix epididymidis)、旁睪(paradidymis)和遠端傳出管以及管間結締組織[4-5](圖1B)，不同區域又有著不同的生理功能[6]。附睪管黏膜上皮細胞主要由主細胞(principal cells)、基底細胞(basal cells)、暈細胞(halo cells)和亮細胞(clear cells)組成。附睪上皮基膜外側還包繞有平滑肌層。附睪管很短，由附睪后端延續為輸精管，處于性活動旺盛時期的公禽附睪管內充滿精子。

圖1 成年公雞附睪外觀(A)和組織結構示意圖(B)(修改自參考文獻[4-5])Fig.1 Appearance (A) and histological structure diagram (B) of epididymis in adult cocks (modified from references [4-5])

2 家禽附睪的基本功能

2.1 精子轉運和暫存功能

轉運精子是附睪最基本的功能。附睪近端輸出管上皮由單層立方細胞和柱狀纖毛細胞排列組成，精子由睪丸輸出管進入附睪的過程與纖毛細胞的長纖毛和微絨毛結構的擺動有關[7]。附睪上皮基膜外側包繞的平滑肌層的節律性收縮也配合纖毛運動一起運送精子至輸精管中暫存。家禽精子通過附睪和輸精管的時間是1～2 d，遠低于哺乳動物[8]。研究表明，鵪鶉精子在附睪輸出管中停留約8 min，在附睪其他部位和輸精管中大約停留24 h。輸精管中儲存了90%以上的精子，精子的轉運速度約0.37 mm·min-1，與哺乳動物的轉運速度相當[9]。當公雞附睪傳出管出現囊腫或發展為結石時，精子轉運受阻，精液量和精子數量顯著降低[10]。上述研究表明，附睪是精子運輸的通道，精子的轉運受到纖毛擺動和平滑肌收縮的協同作用，同時附睪也有短暫貯存精子的功能。

2.2 激素合成和激素轉化功能

附睪與公鴨性欲的相關性已被Ouyang等[11]證實，高性欲組公鴨的附睪重量顯著高于低性欲組，推測附睪的激素合成和激素轉化功能影響了性欲。在公雞的附睪近端傳出管和附睪附件盲端，發現了明顯的類固醇激素合成的超微結構，這表明公雞附睪上皮部與哺乳動物相同，也可以分泌類固醇類性激素[12]。Akmal等[13]向公雞血液中分別注射附睪、睪丸組織以及二者混合提取物，發現血清睪酮濃度均顯著提高，這提示附睪具有睪酮合成功能。日本科學家將雞附睪組織勻漿后，分別與雄烯二酮和睪酮在含有NADPH的蔗糖溶液中混合培養60 min，發現附睪能夠將睪酮和雄烯二酮代謝為5α-二氫睪酮和5β-二氫睪酮，且睪酮底物組生成的二氫睪酮量明顯低于雄烯二酮底物組[14]；而Nakamura和Tanabe[15]用雞睪丸組織進行相同試驗時發現，睪丸組織不同于附睪，不具備激素轉化功能。此外，附睪不同部位的激素轉化能力又有所差別，例如，3β-羥基類醇脫氫酶和17β-羥基類醇脫氫酶是與類固醇類激素的代謝和轉化有關的關鍵酶。Tingari[16]以孕烯醇酮、17α-羥基孕烯醇酮、DEHA和睪酮為底物，檢測到在家禽附睪管有羥基類醇脫氫酶的活性表達，在附睪網管卻表達缺失。Akmal等[17]將山羊的睪丸和附睪提取物注射到公雞體內，發現公雞體內睪酮含量明顯上升，對公雞的精子發生有促進作用。以上研究表明，家禽附睪具有生殖激素合成和轉化功能，附睪管可能是相關激素轉化的主要部位，對于維持公禽的生殖生理功能具有重要作用。

2.3 離子轉運和重吸收功能

附睪通過分泌和重吸收水、蛋白和離子等內源性物質，維持附睪內微環境穩定[18]。附睪上皮不同組織區域的分泌和重吸收能力有一定差別。與哺乳動物類似，家禽附睪管參與了約86%的睪丸液的重吸收[19]，鈉-鉀ATP酶(Na+、K+-ATPase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase 2，CAII)和3型鈉氫交換通道(Na+/H+hydrogen exchanger 3，NHE3)在公雞附睪輸出管(efferent ductules，EFD)的非纖毛細胞中表達，這些離子轉運體在公雞的機制與哺乳動物類似，促進了附睪中的離子和水的重吸收[20]。附睪上皮細胞存在著對Na+的主動重吸收和對Cl-的被動重吸收，因此形成的滲透壓有利于對水的吸收利用[21]。附睪對管腔內K+和Ca2+也有著活躍的重吸收機制，這些物質可以影響精子的運動、獲能以及頂體反應的發生[22]。附睪內穩定的低Ca2+環境是精子在附睪中成熟的前提[23]。在小鼠中，Ca2+內流還會激活cAMP-PKA通路并導致酪氨酸蛋白磷酸化，影響精子獲能[24]。在大鼠中，當附睪中TRVP6蛋白通路缺失后，附睪尾部Ca2+濃度升高近十倍，精子活力明顯下降[23]。Oliveira等[25]研究發現，在患附睪結石的公雞中，公雞的附睪輸出管腔內形成鈣結石，TRVP6表達升高，由此猜測，附睪中Ca2+穩態的失衡可能是導致公雞患附睪結石的主要原因。因此，家禽附睪的重吸收功能被認為在精液濃度調節、精子成熟和受精過程中具有重要作用。

2.4 免疫功能

附睪的免疫功能主要依靠血-附睪屏障和免疫屏障，分別發揮免疫抑制和免疫應激功能。由于雄性動物的生殖管道中存在單倍體的生殖細胞，在睪丸、附睪和輸精管中的免疫應激與免疫抑制的平衡對于維持正常的生理功能十分重要[26]。

2.4.1 血-附睪屏障 血-附睪屏障(blood-epididymis barrier，BEB)是存在于附睪管內與管壁外結締組織中毛細血管間的結構，包括附睪上皮主細胞及其細胞連接(特別是緊密連接)、基膜、平滑肌、毛細血管內皮及其基膜。緊密連接的構成又依賴于一系列鈣依賴的黏結分子、鈣黏著蛋白和連環蛋白的作用[27]。血-附睪屏障可以隔絕抗精子抗體、限制免疫球蛋白和免疫細胞進入管腔，阻止由于管內精子自身抗原和免疫系統之間的相互作用而發生自體免疫反應，也可通過調控上皮細胞中離子、溶質和大分子的選擇性運輸來調節附睪管腔組成，保護精子免受免疫系統和細菌的攻擊。當血-附睪屏障出現滲漏時，精子頭部抗原決定簇可以引起抗精子抗體，誘導宿主不育。血-附睪屏障對維持附睪腔的酸性環境發揮作用，這對于精子成熟、附睪小體的轉移，以及在附睪轉運過程中維持精子休眠是必不可少的[28]。有研究認為附睪中特異性免疫主要成員B淋巴細胞的數量相對較少，合成抗體的能力弱，可能是為了避免產生抗精子抗體[29]。血-附睪屏障還參與調節物質進出，維持附睪微環境穩定[30-31]。

2.4.2 免疫屏障 非特異性免疫和特異性免疫是生物體內的兩種免疫機制，非特異性免疫是指不針對特定細菌或病毒產生免疫能力的反應，而特異性免疫是指針對特定的細菌、病毒產生免疫的反應。免疫屏障即附睪上皮中由大量單核巨噬細胞和T淋巴細胞等組成暈細胞，暈細胞在上皮基部呈環狀分布，對附睪上皮細胞和血-附睪屏障具有保護作用，被稱為血-附睪屏障的“衛士”[32]。且免疫屏障使睪丸獲得了特異性免疫[30-31]。家禽雄性生殖器官可被各種致病微生物感染，造成生育能力下降。在家禽上由病毒和細菌感染引起的睪丸炎和輸精管炎癥非常常見，目前已被證明的有禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，AIBV)、白痢沙門菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌等，腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌引起的睪丸炎在鴨子上也有證明，睪丸炎和輸精管炎對精液品質和受精率都有影響[33-35]。睪丸和附睪的非特異性免疫系統在預防這種感染中起著至關重要的作用。Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。不同TLR可識別的抗原對象也有所區別。有研究表明，公雞睪丸和附睪中大量表達不同的TLR，證明睪丸和附睪通過識別不同外源病原，啟動非特異性免疫來達到防御局部感染的目的。促炎細胞因子表達上調是刺激TLR后常見的反應，在Anastasiadou和Michailidis[36]的研究中，用沙門菌感染成年洛島紅公雞，解剖后發現睪丸和附睪中某些TLRs家族成員表達上調，其中TLR-4可能識別外源抗原細菌脂多糖，并進一步上調促炎細胞因子和趨化因子的表達來抵御感染，其中在睪丸和附睪中有檢測到9種細胞因子編碼基因的表達，即IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17和IL-18。陳毅等[37]通過免疫組化分析發現IL-1β和IL-6在公雞附睪，尤其是附睪輸出管大量表達，提示附睪輸出管可能是清除未射出或不成熟精子等異常精子以及來自前段生殖道脫落細胞的主要部位。

3 附睪對精子成熟的影響

哺乳動物睪丸中形成的不具備受精能力的精子，需要在附睪中的移行中發生一系列化學和物理變化并獲得運動和受精能力，這一過程稱為精子成熟[38-39]。在家禽上，Ahammad等[40-41]檢測來自白來航、日本斗雞和烏骨雞睪丸、附睪和輸精管各部分精子的運動和受精能力，發現睪丸、附睪和輸精管近端、中端和遠端的精子遷移率、精子存活時間以及子宮部人工授精后的受精率逐漸增強。說明家禽的附睪和輸精管具有與哺乳動物類似的精子成熟功能。精子在附睪中的成熟過程主要包括形態變化、精子膜成分及流動性的變化、運動能力和受精能力的獲得等。

3.1 精子形態的改變

從形態學上看，精子在進入附睪移行過程中最明顯的形態變化是原生質滴從精子頭部向尾部的遷移[42-43]，以及精子尾部卷曲程度的變化。

精子細胞在睪丸內的變形過程中，細胞核變為精子頭部，高爾基體發育成頂體，中心體演變成精子尾部，線粒體演變成線粒體鞘，細胞內的其他物質濃縮為球狀，稱為原生質滴。哺乳動物精子剛進入附睪頭時，頸部常有原生質滴，在通過附睪的過程中，其向尾部末端移動，至精子成熟時也隨之消失[43]。有研究表明，水牛附睪頭部、體部和尾部中攜帶原生質滴的精子比例逐漸降低[44]。除了家鴨，在其他家禽的射精精液中也很少檢測到原生質滴[45-46]，因此可以推測家禽精子在附睪中移行時，也伴隨著原生質滴的脫落。

除了原生質滴的移行，精子的尾部形態在通過附睪的過程中也發生變化。在靈長類動物附睪起始段和頭段,大多數精子的尾部卷曲,隨著精子在附睪內的轉運,尾部卷曲精子的數目逐漸下降。到了附睪尾,精子尾變直,即使有少量卷曲精子其卷曲程度也有所減輕[47]。但是關于具體的調控機制尚未明確。

3.2 精子膜變化

目前精子成熟過程中精子膜表面的變化是研究的熱點和難點。精子在附睪成熟過程中精子膜表面成分、形態及精子膜的理化性質發生重要的變化，主要包括膜的通透性、膜蛋白、膜上糖基成分和受體性質的改變。

3.2.1 精子膜通透性變化 精子在附睪內成熟的過程中其質膜結構發生一系列變化，膜流動性的下降使精子膜的通透性改變。張君慧等[48]用大鼠精子進行精子低滲腫脹試驗，結果顯示從附睪頭部到尾部，精子膜對滲透壓的反應能力逐步減弱，其中附睪體部到尾部的減弱程度最為明顯。精子隨著在附睪中的移行逐步獲得了排Na+的能力，因此精子膜外Na+高。同時，精子膜對于K+的通透性明顯增加，造成K+的內流，使精子內K+濃度明顯高于精子外附睪液的K+濃度[49]。精子膜通透性的這種成熟變化，影響了精子內酶的活性以及精子的代謝，對于精子在附睪成熟過程中精子運動的啟動和成熟有著重要意義。

3.2.2 精子膜表面成分變化 精子膜表面成分的變化包括膜蛋白和脂質的變化。精子表面膜蛋白主要有附著蛋白、結構蛋白、抗原和酶等，參與精子獲能、頂體反應和精卵融合等過程[49]。精子在附睪中移行并逐漸成熟的過程中，精子表面膜蛋白有增加和缺失現象的出現，Kaul等[50]發現羊的精子成熟前后的蛋白數量有明顯減少，這種現象的發生一是因為精子膜表面、內部及附睪液中蛋白水解酶造成了蛋白質的裂解，二是因為外源性復合物對原有蛋白的掩蓋。附睪液中富含氨基酸和多種蛋白質合成、轉移、糖基化所需要的酶和轉移長萜醇，可以猜測精子膜表面蛋白的形成與附睪液對精子的作用有關[51]。

精子的黏附能力也隨精子移行而發生變化，例如，未成熟豚鼠精子經簡單沖洗后即可導致表面蛋白質的脫落，而附睪上皮細胞分泌的附睪特異性蛋白在附睪液低離子濃度環境的促進下與精子結合能力上升。另外，精子表面蛋白在糖基轉移酶的作用下，糖類和蛋白質特定的氨基酸殘基形成糖苷鍵，即蛋白質的糖基化，蛋白質糖基化具有多類，大致可分為N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇；蛋白質糖基化對精子表面電荷具有影響，繼而影響精子的運動能力[52]。

3.3 精子運動能力的獲得

早在20世紀70～80年代，學者們就已發現了睪丸精子與附睪精子，特別是附睪較遠側部位精子的運動能力有明顯差別。Nixon等[53]指出，日本鵪鶉精子進入附睪后運動能力大大加強，Howarth等[54-55]在雞上的研究中也證實了這一觀點，可以認為家禽精子在附睪成熟移行的過程中獲得了運動能力。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細胞氧化還原代謝的副產物，可通過對cAMP水平的調節而影響哺乳動物精子成熟和獲能過程[56]。精子活力低可能與附睪成熟過程中線粒體蛋白的異常修飾有關，Park等[57-58]發現，牛精子線粒體蛋白的不規則表達可能導致ROS損傷和早期激活進而導致精子糖酵解能量消耗增加，精子因缺乏能量而喪失運動能力。很多研究表明，PKC信號通路(protein kinase C pathway)可能參與了精子運動能力的調節，PKC通路對鵪鶉和雞的精子鞭毛運動能力的作用相反，PKC通路對蛋白的磷酸化作用可以維持日本鵪鶉的鞭毛運動，但雞的PKC通路激活卻減弱了精子鞭毛運動，具體機制仍不清楚[55]；PKC通路的激活與Ca2+濃度息息相關，而Ca2+濃度與附睪上皮細胞的重吸收作用息息相關，這也證明了附睪具有調節精子運動的能力。精子運動能力的獲得還和附睪上特異性基因所編碼的蛋白有關，小鼠附睪除基本結構分區外，還可根據蛋白分布的不同劃分為10個部分，在分泌蛋白數量最多的附睪頭具有最強的代謝活性，也是精子獲得運動能力的主要部分[59]。附睪分泌的前向運動蛋白，在倉鼠附睪頭部可防止精子的停滯聚集，在附睪尾部則可使精子獲得前向運動能力[60]。Sowińska等[61]發現，在火雞附睪中與精子活力和鞭毛運動相關的蛋白，如鈣調蛋白激酶(calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase 1, CAMKK1)、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase ID, CAMK1D)、磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol-4-Phosphate 5-Kinase Type 1 beta, PIP5K1B)和磷脂酶A2(phospholipase A2 Group XIIB, PLA2G12b)等在精子活力差異的個體中也有顯著差異表達。半胱氨酸豐富毒蛋白X2亞型(cysteine-rich Venom Protein-like Isoform X2，CRVPX2)在火雞的附睪和輸精管的上皮細胞中大量分泌，與哺乳動物中表達的CRISP1蛋白相似，CRVPX2參與睪丸后精子成熟，對精子活力具有調節作用[62]。重要的鞭毛蛋白SPAG6在睪丸、附睪和輸精管部均有表達，但在附睪的豐度更多，且隨精子成熟其豐度也隨之升高；SPAG6與鞭毛功能密切相關，但它對精子運動能力的影響似乎和它對鞭毛的功能并不相關，因此不能將SPAG6的豐度作為精子運動能力強弱的依據[63]。TRIM36和TCP11被鑒定為影響精子運動能力的重要基因[64-65]，趙延輝等[66]在家禽附睪中也鑒定到TRIM36和TCP11的表達。精漿是前列腺、精囊腺和尿道球腺分泌產生，由前列腺液、精囊液、附睪液和尿道球腺分泌的少量液體一起組成的物質。精漿是輸送精子的必須介質，為精子提供能量和營養物質，也可調節精子的運動能力，在對體外精子的研究中，用不同劑量的精漿對精子進行清洗后發現精子的運動能力有所不同，可以猜測精漿中存在影響精子活力的物質[67]。上述研究表明，精子的運動能力隨著在附睪內的移行而增強，這一變化與附睪上皮細胞分泌的蛋白息息相關，這些蛋白作用于精子鞭毛從而影響精子運動能力，蛋白的異常表達也對運動能力有影響。蛋白作為經久不息的研究熱點，有關家禽附睪蛋白的研究仍需要深入，在蛋白層面與哺乳動物的異同也許是重要的突破點。

3.4 精子受精能力的獲得

Bedford[68]在兔子上進行結扎試驗，使精子不能在附睪內順利移行而只能停留在附睪近中段，檢測發現，該處精子雖能存活但卻沒有受精能力。隨著對多種動物附睪精子的系統研究，科學家們猜測附睪對精子受精能力的獲得有影響。精子受精能力的獲得和發育與精子對卵丘細胞層的穿越作用有關。在哺乳動物中，精子通過附睪時，附睪腔液中的精子表面特異性透明質酸酶(PH-20)即可結合于精子表面網[69]，如果PH-20被透明質酸酶抑制劑和抗氨基端活性部位的抗體封閉，精子就無法穿過卵丘細胞層。Primakoff和Myles[70]以及Seol等[71]的研究結果表明，PH-20可使卵丘細胞很快散開，促進精子穿入卵丘，此外還能促進經過頂體反應后的精子與透明帶結合，PH-20雖然是在睪丸精子發生過程中形成且分布于精子頭部[72]，但在附睪中PH-20產生了異位，主要定位于精子后部質膜和頂體內膜，這種重新分布和濃度變化可能對受精起到重要作用。目前，通過現代組學技術對家禽附睪精子獲能的機制解析提供了一定的科學證據。例如在Xing等[73]的研究中，分別對高精子活力和低精子活力公雞的附睪轉錄組進行分析，鑒定到與精子活力相關的調控基因，包括MMP9、SLN、WT1、PLIN1和LRRIQ1，其中WT1、PLIN1和LRRIQ1在高精子活力雞的表達量是低精子活力雞的表達量的4倍；并鑒定到重要調控miRNA，包括mir-146a、mir-135b和mir-205。附睪上皮分泌的蛋白也對精子受精能力有影響。小鼠附睪上皮分泌的CRISP1蛋白和精卵結合有關，當該蛋白被敲除時精卵結合能力出現明顯下降[74-75]。GPx5由附睪上皮細胞分泌，在山羊、牛、小尾寒羊和駱駝等動物的附睪中均有特異性表達，其在管腔中與精子質膜結合，調節管腔微環境的ROS水平，對維持精子活力和DNA完整性有作用，也防止精子在附睪尾部過早發生頂體反應。由附睪分泌的β-防御素126(defensin beta 126，DEFB126)，又稱附睪特異蛋白13.2(ESP13.2)，可覆蓋在精子表面，可保護精子經過雌性生殖道時不被免疫識別殺傷[76-77]，在人上的研究也證實了DEFB126的缺失會阻礙精子穿過宮頸黏液[78]。火雞附睪中連接蛋白的細微變化將影響附睪內環境的穩定，影響精子的發育和成熟從而使精液顏色從正常的白色變為病理性的黃色，即火雞黃精液綜合征(yellow semen syndrome，YYS)[79]。與哺乳動物相比，除了分泌功能型蛋白，家禽不具有副性腺，但是輸精管上皮細胞可以分泌體液加入精液。

附睪小體也是目前的研究熱點。附睪上皮細胞分泌的附睪小體內含蛋白質、RNA和脂質，當其與精子結合后，精子的蛋白質組圖譜發生明顯變化，Barrachina等[80]的研究證明了來源于附睪上皮細胞的幾種蛋白通過附睪小體轉運至精子，Nixon等[81]的試驗也驗證了附睪小體的蛋白轉運功能。這也證明了精子的功能成熟主要與附睪分泌蛋白和附睪小體作用有關。

4 總結與展望

附睪的免疫、分泌、重吸收等功能使附睪形成了穩定的內環境，對睪丸后精子功能的進一步完善具有重要作用。了解附睪對精子功能的具體作用機制，對改善精液品質、提高雄性生殖力有指導意義，有利于畜禽良種繁育。附睪的具體作用機制仍是國內外科學家研究的熱點。目前，對家禽附睪功能的研究遠不及哺乳動物，在基因和蛋白表達、遺傳修飾、附睪小體功能等層面還需要進一步深入探索。