N-乙酰-L-半胱氨酸抗1型糖尿病模型比格犬晶狀體上皮氧化損傷的作用

周水蓮，白雨曼，謝文婷，黃健佳，邱文粵，龐曉玥，章心婷，唐兆新，蘇榮勝*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.廣州醫藥研究總院有限公司，廣州 510642)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種慢性代謝性疾病[1]，近年來隨著生活水平和醫療水平的改善，老齡寵物越來越多，寵物糖尿病的發病率亦呈逐年上升的趨勢。眼病、心臟病等是糖尿病最常見的并發癥。目前，白內障摘除和人工晶體植入手術是糖尿病性白內障的主要治療方法，然而，手術可導致許多嚴重的術后并發癥，尤其是老年和高血糖情況下[2]。臨床流行病學和基礎研究均表明氧化應激在糖尿病發病機制中占有重要地位[3]，白內障的形成與脂質過氧化和自由基產生過多有關，從理論上講，抗氧化劑的應用應成為防治此病，提高機體健康水平的重要途徑；迄今為止，盡管人們圍繞抗氧化劑進行了長期大量的研究和探索，但尚沒有一個單純的抗氧化劑被臨床證實可以用于有效治療疾病，抗氧化治療并未獲得預期的效果。

N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一種常見的小分子抗氧化劑，易進入動物機體進行細胞代謝，在體內可脫去乙酰基生成半胱氨酸，最終合成谷胱甘肽，是機體生理代謝的重要物質[4]。NAC作為一種經典的抗氧化劑，能降低機體細胞的活性氧，減輕機體異常的過氧化反應[5]，最終有助于維持細胞正常的生理功能和細胞形態。秦淑蘭等[6]探討了NAC對糖尿病模型小鼠氧化應激的影響，研究結果表明NAC可有效改善糖尿病模型小鼠的氧化應激狀態，減輕糖尿病引起的多個臟器的氧化損傷[7]。但NAC在機體眼部疾病，特別是糖尿病引起的白內障中的作用鮮有報道。鑒于此，本試驗擬將NAC作用于STZ聯合ALX誘導的1型糖尿病模型比格犬，探討NAC是否參與改善糖尿病犬晶狀體的氧化損傷，為NAC的臨床應用提供又一理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用40只健康2～3歲比格犬，雌雄各半，體重9～13 kg，由廣州醫藥研究總院有限公司提供。本批次實驗動物已獲得實驗動物使用許可證(編號：SYXK 粵 2019-0196)，所有動物試驗程序均經實驗動物倫理委員會批準，在試驗前已通過華南農業大學動物倫理審查備案。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素購自上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶、NAC購自美國Sigma公司；精蛋白生物合成人胰島素注射液，商品名為諾和靈N(中效)，購自諾和諾德(中國)制藥有限公司。

常規生化復合校準品、生化復合定值質控品均購于深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；Trizol試劑盒、熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMII)和反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser)均購自TaKaRa公司；脂質氧化物(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶(GR)檢測試劑盒(DTNB法)、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(NADPH法)均購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 試驗設計與動物飼養管理

試驗犬造模前先適應性飼養1周，將比格犬隨機分為5組，每組8只，分別為對照組(CON組)、糖尿病模型組(DM組)、胰島素治療組(INS組)、NAC聯合胰島素治療組(NAC+INS組)和NAC治療組(NAC組)。

根據預試驗的結果，確定造模所需的鏈脲佐菌素和四氧嘧啶的劑量。于試驗開始當日(第1 天)和第4天，通過靜脈注射的方式每組均給予20 mg·kg-1鏈脲佐菌素和20 mg·kg-1四氧嘧啶。此外，對照組靜脈注射相應體積的生理鹽水。此后連續兩周監測空腹血糖值，并于試驗第10天進行胰島素釋放試驗，如果連續兩周測得血糖空腹血糖濃度≥8.30 mmol·L-1或隨機血糖濃度>11.1 mmol·L-1，則可判定為糖尿病[8]。據上述兩種試驗結果確定已成1型糖尿病模型后，INS組、NAC+INS組在試驗第11天開始給予胰島素，胰島素用量參照說明書，每天2次，于早上09：00和晚上21：00進食后進行。NAC+INS組和NAC組亦在試驗第11天開始，每日早上09：00按30 mg·kg-1的劑量給犬口服NAC。每月記錄犬只體重和空腹血糖。

1.4 胰島素釋放試驗

在空腹狀態下，給每只試驗犬按照10 mL·kg-1劑量灌喂10%葡萄糖溶液，使血糖升高刺激胰島β細胞釋放胰島素，通過ELISA的方法測定空腹及服糖后0.5、1、2、3 h的血漿胰島素水平。

1.5 樣品采集與處理

將試驗犬只安樂死后，迅速吸取雙眼房水，取200 μL待檢測葡萄糖含量，其余分裝凍存于-80 ℃冰箱待檢。用眼科器械行眼球摘除術，取出完整的眼球，然后迅速切取少量右眼晶狀體組織用于分子生物學檢測；切取左眼晶狀體進行組織病理學分析。

1.6 比格犬晶狀體白內障的等級測定

在造模第120天時，使用手持裂隙燈顯微鏡，檢查眼晶狀體，評估晶狀體的分級狀況分別拍攝記錄。

晶狀體混濁的分級如下：透明正常晶狀體(0級)；外周囊泡(1級)；外周囊泡和皮質混濁(2級)；彌漫性中央混濁(3級)；和成熟的白內障(4級)[9]。記錄每只眼睛等級，每級對應相應的分數。

根據裂隙燈檢查結果，并參照晶狀體混濁分類系統Ⅲ(LOCSⅢ)和Kador等國際分級標準來確定白內障分期[9]，共分為Ⅰ～Ⅴ期。分期標準分別為①白內障Ⅰ期：散瞳后裂隙燈下可見晶狀體周邊皮質出現小囊泡或細小囊泡群；②白內障Ⅱ期：散在小囊泡群開始從赤道部向前極部蔓延，從而在鏡下形成細環狀或戒指狀混濁；③白內障Ⅲ期：皮質部前極有放射狀混濁，呈灰白色，從“Y”形縫蔓延。④白內障Ⅳ期：皮質部的混濁開始融合，有水裂或新月形投影，混濁區眼底細節不可見；⑤白內障Ⅴ期：皮質和晶體核均完全變成灰白混濁，眼底完全被遮蔽，細節不可見。

1.7 病理切片

將犬晶狀體組織浸泡于4%的多聚甲醛中固定24 h以上，梯度酒精脫水處理，石蠟包埋，待石蠟凝固后修塊，然后進行晶狀體組織切片(3～7 μm)，之后將置于37 ℃烘片機上平放烘干8～10 h后備用。將烘片機溫度調高至55 ℃烤片2 h，37 ℃復溫后使用蘇木精和伊紅(H&E)染色、中性樹脂封片，晾干后于顯微鏡下觀察并取圖像記錄。

1.8 抗氧化能力檢測

稱取20 mg晶狀體組織于EP管中，加入0.2 mL裂解液，混勻2 min后勻漿，12 000g離心10 min，取上清用于后續測定；上清和眼房水用于MDA含量、GSH/GSSG、GSH-Px活性和GR活性的測定。測定過程嚴格按照說明書進行。

1.9 實時熒光定量PCR技術檢測晶狀體氧化損傷相關基因轉錄表達情況

使用Trizol法提取晶狀體組織總RNA，并反轉錄制備cDNA。以β-actin作為內參基因，采用實時熒光定量PCR技術檢測晶狀體上皮細胞氧化損傷相關基因的轉錄表達水平，根據NCBI的GenBank中犬β-actin、SOD2和GRmRNA的基因組序列，應用Primer 6.0軟件進行引物設計。設計成功后進行合成，引物序列見表1。按SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒說明書進行操作。

表1 引物序列Table 1 Reference sequences

1.10 數據處理

2 結 果

2.1 胰島素釋放試驗和血糖圖變化

試驗期間空腹血糖曲線如圖1A可見，試驗15 d內，與CON組血糖一直在正常范圍，而DM組連續兩周測得血糖空腹血糖濃度≥8.30 mmol·L-1。

A.血糖；B.胰島素。CON.對照組；DM.糖尿病模型組A. Blood glucose；B. Plasma insulin. CON. Control group；DM. Diabetes model group圖1 血糖和血漿胰島素含量曲線Fig.1 Blood glucose and plasma insulin content curves

試驗犬血漿胰島素含量變化見圖1B，可見CON組犬血漿胰島素水平在服糖后0.5 h達高峰，隨后2 h內回降至空腹水平；而DM組犬血漿胰島素曲線一直呈低平，無明顯高峰狀態。

2.2 NAC對1型糖尿病模型犬房水及血液中糖含量的影響

如圖2A所示，與CON組對比，DM組房水中葡萄糖含量有大幅升高，差異顯著(P<0.05)；與DM組對比，NAC+INS組房水中葡萄糖含量呈顯著降低(P<0.05)，而INS組和NAC組房水中葡萄糖含量僅有輕微降低。

A.NAC對房水GLU含量的影響；B.各組不同時間點血清GLU含量。CON.對照組；DM.糖尿病模型組；INS. 胰島素治療組；NAC+INS. NAC聯合胰島素治療組；NAC. NAC治療組。同一時間點中，與CON組相比,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；與DM組相比,#.P<0.05，##.P<0.01，###.P<0.001。下同A. Effect of NAC on aqueous humor GLU content；B. Serum GLU content at different time points in each group. CON. Control group；DM. Diabetes model group；INS. Insulin treatment group；NAC+INS. NAC combined with insulin treatment group；NAC. NAC treatment group. At the same time point，compared with CON group, *.P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001; compared with DM group, #.P<0.05，##. P<0.01; ###. P<0.001. The same as below圖2 NAC對房水和血清葡萄糖含量的影響Fig.2 Effect of NAC on aqueous humor and serum glucose content

各組試驗犬血糖含量變化見圖2B，試驗犬在造模前各組間血糖含量無統計學差異；試驗30 d時，與CON組相比，DM組血糖含量極顯著升高(P<0.001)，與DM組比較，NAC+INS、INS及NAC組中血糖含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，其中，NAC+INS組下降幅度最大；試驗120 d時，與CON組相比，DM組血糖含量極顯著升高(P<0.001)，與DM組比較，NAC+INS、INS及NAC組中GLU含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，其中，NAC+INS組下降幅度最大。

2.3 NAC對白內障程度的影響

各試驗組犬在造模120 d時對晶狀體進行裂隙燈檢查照片，圖3為從試驗組犬中挑選1只最具代表性的進行展示。造模4個月后，CON組和NAC+INS組晶狀體呈清晰、正常狀態為0級；DM組和INS組試驗犬皮質部的混濁開始融合，有水裂，混濁區眼底細節不可見，彌漫性中央混濁，可分為白內障Ⅳ期，3級；NAC組試驗犬散瞳后皮質部前極有放射狀混濁，呈灰白色，從“Y”形縫蔓延外周囊泡和皮質混濁，可分為Ⅲ期，2級。

圖3 裂隙燈檢查圖片Fig.3 Slit-lamp examination pictures

綜合兩種分級標準對病變進行描述，記錄結果如表2。DM組白內障評分顯著高于CON組(P<0.01)；NAC+INS組評分顯著低于DM組(P<0.01)。

表2 白內障等級評估表Table 2 Cataract grade assessment table

2.4 NAC對眼睛病理組織學的影響

從圖4可以看出，CON組和NAC+INS組的晶狀體上皮細胞(LECs)排列整齊，大小均一，細胞間連接緊密，胞間空隙均勻，核呈圓形又大，且染色均勻，與前囊膜連接緊密；然而，DM組LECs間隙不均勻，細胞大小不均，細胞核數量減少且部分出現核固縮，有壞死小體(箭頭所示)，且前囊膜連接疏松，染色過程中前囊膜脫離，圖中所見為厚切之后多層LECs裸露在表面；經NAC或胰島素單獨治療的組中LECs胞間連接較為緊密，病變情況有所改善，但細胞核形態不均一，且與前囊膜連接也出現縫隙，治療效果不及NAC+INS組。此外，5個組的晶狀體內部淺皮質區和深皮質區，成熟的晶狀體纖維排列和走向均整齊，無明顯病變，INS組和NAC組由于染色過程出現裂紋，其纖維結構未出現明顯變化。

左列為HE染色，200×；中間列為左列的放大；右列為晶體深皮質區。箭頭指示細胞核The left column is HE staining, 200×; The middle column is a larger version of the left column; The right column is the deep cortex of the crystal. The arrow indicates the nucleus圖4 晶狀體組織病理學切片圖(HE染色，200×)Fig.4 Histopathological section of lens (HE staining，200×)

2.5 NAC對晶狀體上皮細胞抗氧化指標的影響

NAC對晶狀體上皮細胞抗氧化指標的結果如圖5所示，與CON組相比，DM組的晶狀體上皮細胞內MDA含量顯著升高(P<0.05)、GSH/GSSG和GSH-Px活性均顯著下降(P<0.05)、GR活性下降(P>0.05)；而與DM組相比，NAC+INS組中晶狀體上皮細胞內MDA含量顯著下降(P<0.05)、GSH/GSSG和GSH-Px活性顯著上升(P<0.05)、GR活性極顯著上升(P<0.01)，表明NAC聯合胰島素治療可抑制DM犬晶狀體上皮細胞氧化應激。

圖5 NAC對晶狀體上皮細胞抗氧化指標的影響Fig.5 Effect of NAC on antioxidant index of lens epithelial cells

2.6 NAC對房水中抗氧化指標的影響

NAC對房水中抗氧化指標的結果如圖6所示，在造模第120天，與CON組相比，DM組的房水中MDA含量極顯著升高(P<0.01)，而GSH/GSSG、GR活性和GSH-Px活性均極顯著下降(P<0.01)；與DM組相比，NAC+INS組房水中MDA含量下降(P>0.05)、GSH/GSSG極顯著上升(P<0.001)、GR活性和GSH-Px活性極顯著上升(P<0.05)，表明NAC聯合胰島素治療可降低DM犬房水中氧化應激水平。

圖6 NAC對房水中抗氧化指標的影響Fig.6 Effect of NAC on antioxidant indexes in aqueous humor

2.7 NAC對晶狀體上皮細胞氧化損傷相關基因表達的影響

NAC對晶狀體上皮細胞氧化損傷相關基因表達量變化如圖7所示，與CON組對比，DM組的GR和SOD2mRNA表達水平明顯上調，且差異顯著(P<0.05)；而與DM組對比，NAC+INS組GR和SOD2mRNA表達水平上調，但差異不顯著(P>0.05)，表明NAC聯合胰島素治療可進一步增加抗氧化相關基因的表達量。

圖7 NAC對晶狀體上皮細胞氧化損傷相關基因表達量的影響Fig.7 Effect of NAC on expression of oxidative damage-related genes in lens epithelial cells

3 討 論

為了研究糖尿病性白內障發病機制，篩選保護藥物并探索其作用機理，建立合適的試驗性糖尿病白內障動物模型具有重要意義[10-11]。運用對胰島β細胞有毒性的化學物質ALX和STZ對試驗比格犬進行造模。在本試驗結束時，5個組呈現的血清和房水的GLU變化趨勢是一致的，表明用血清和房水中任何一種來作為測量房水葡萄糖含量都是可行的，但是血清中測量的葡萄糖含量變化差異性要高于房水，說明臨床中如果要為眼部患畜做診斷，若選擇檢測血清去推測房水葡萄糖，那么房水中的葡萄糖含量會被高估。張志鵬[12]研究表明，犬糖尿病性白內障模型分級形成時間分別為C1：30 d左右；C2：60 d左右；C3：150 d左右；C4：180 d左右；C5：240 d左右。本試驗中所監測到的空腹血糖水平均表明已建成1型糖尿病模型。成模120 d后進行散瞳，可見DM組中犬晶狀體皮質部的混濁開始融合，有水裂，即為白內障Ⅳ期，與張志鵬[12]研究結果相一致。有研究表明，與非糖尿病患者相比，即使血糖水平降低至機體正常范圍內，波動也較小，DM患者的白內障發生可能性還是沒有顯著降低[13-14]。本試驗中INS組血糖水平較NAC組控制更好，但是裂隙燈結果中INS組比NAC組白內障等級要更高，說明只用胰島素，可以有效控制血糖，但不能延緩糖尿病性白內障的發展。本研究結果表明，NAC聯合胰島素治療，可以有效延緩晶狀體混濁的發生發展。

有研究表明，氧化應激是白內障的致病因素，與正常個體相比，從復雜性白內障患者獲得的房水樣品的脂質過氧化產物濃度增加[15]。據報道STZ和ALX是通過氧化應激對β細胞造成損傷[16]。Boarescu等[17]研究表明，1型糖尿病可降低機體的總抗氧化能力。另有研究表明，STZ誘導的DM大鼠氧化應激水平升高，提示高糖可觸發氧化應激，與對照組相比，DM組大鼠的血清，MDA含量明顯增加[18]。本試驗中首先采用ELISA試劑盒對各組試驗犬的房水、晶體組織進行機體氧化應激指標的檢驗，研究結果與上述學者所得一致。與CON組對比，在兩種樣本中DM組的犬晶體上皮的MDA含量升高，GSH-Px活性、GR活性和GSH/GSSG含量均呈不同程度的增加。說明運用SLX聯合STZ造模會使試驗犬機體氧化應激水平升高。房水中各氧化應激指標降低幅度很大，與CON組對比差異極顯著，而同樣條件下，在晶體組織中檢測結果差異顯著性更小。可能是晶狀體酶類抗氧化劑從細胞內核糖體被制造，通過細胞膜擴散至細胞外液，分布在全身各個組織中，所以細胞代謝功能越活躍的器官，抗氧化酶濃度越高，越容易檢測到，而房水是由睫狀體某些上皮細胞產生，而晶狀體上皮細胞只有單層，數量較少，且晶狀體囊膜形成一層屏障，房水中與晶狀體上皮細胞的抗氧化酶濃度與活力存在梯度，所以房水中比晶體組織中檢測的氧化應激指標顯著性差異更大。

黃酮苷可以抑制糖尿病性白內障小鼠中LECs的氧化應激水平，顯示GSH-Px、T-SOD活性全部都低于陰性對照組(P<0.05或P<0.01)，提示高糖對LECs表現出明顯的氧化應激[19]，而高劑量黃酮苷治療組與高糖組對比GSH-Px、T-SOD活性顯著升高[20]。DL-丁基苯酞對STZ誘導的糖尿病性白內障大鼠血清MDA含量比模型組顯著降低[21]。本試驗對DM組和其他治療組犬房水和晶體組織中的各氧化應激因子水平進行了對比，研究結果顯示，與DM組相比較，NAC+INS組的MDA含量在兩種樣本中均降低；所有已測的抗氧化酶活力和GSH/GSSG在兩種樣本中均呈不同程度的升高，與前人研究結果相一致，表明NAC聯合胰島素治療可抑制DM犬氧化應激，其中，晶體組織中GSH-Px、GR活力和GSH/GSSG的升高程度與DM組對比有顯著差異，且MDA含量也顯著升高，同時在房水中僅有GSH-Px、GR活力的升高程度與DM組對比有顯著差異，說明在晶狀體酶系抗氧化劑中以GSH-Px和GR為主。而且通過比較兩種樣本，INS組和NAC+INS組可改善氧化應激水平，且NAC+INS組比INS組表現更佳，說明NAC聯合胰島素治療與單獨使用胰島素治療相比，在抑制糖尿病性白內障犬氧化應激方面可取得更好的效果。Takahashi等[22]研究表明，T1D患者中與氧化應激有關的基因為上調，本研究中，DM組的SOD2和GR基因相對表達水平相較于CON組也有顯著性升高，與Takahashi等[22]的研究結果相一致。而各治療組相較于DM組均有不同程度上調，其中，NAC組的SOD2基因相對表達水平與DM組對比有顯著性上調(P<0.05)；與INS組相比，NAC+INS組和NAC組上調程度更高，說明只要發生糖尿病，那么機體內氧化應激基因均出現上調，而NAC作為抗氧化劑，也可能對氧化應激有關的基因有激活作用，其具體機制有待進一步探究。

4 結 論

NAC聯合胰島素治療能改善1型糖尿病犬的血糖、晶狀體功能，比單獨使用胰島素組的效果更好。NAC聯合胰島素治療對糖尿病犬晶狀體上皮損傷的保護作用，可能和抑制晶狀體的氧化應激有關。