日糧中添加植物多酚調控肉色穩定性的作用機制

趙亞亞，常 江，劇 檸，羅玉龍

(寧夏大學食品與葡萄酒學院，銀川 750021)

肌肉色澤不僅能影響消費者的購買決策，同時還反映了動物的健康及營養代謝狀況[1]。肌肉色澤與肉中肌紅蛋白(myoglobin，Mb)含量及其氧化還原狀態有關，Mb的氧化產物高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，MMb)會使肉呈現暗褐色，因此抑制肉中Mb氧化并降低MMb比例是保持色澤的關鍵。

植物多酚作為一類天然的抗氧化劑，具有很強的供氫與螯合金屬的能力，可抑制自由基形成，中斷氧化鏈式反應，能作為一種有效的護色方式添加到動物日糧中[2]。肌細胞線粒體中氧化磷酸化過程及線粒體代謝與MMb的還原有密切的聯系，已有研究顯示，線粒體中電子傳遞鏈的還原酶直接參與MMb的還原[3]。肌纖維類型也是影響肉色的重要因素，其類型不同，所含的線粒體和Mb含量也不同[4]。在日糧中添加植物多酚作為膳食補充劑，可以提高動物肌肉的抗氧化能力，調控肌纖維類型，增強線粒體功能，抑制肌紅蛋白與脂質的過度氧化，從而提高肉色穩定性。本文概括了植物多酚提高肌肉抗氧化能力、促進肌纖維類型轉化的研究進展并探尋了植物多酚調控肉色改變的分子機制，為今后動物飼料添加植物多酚改善肉色提供理論依據。

1 植物多酚概述

1.1 植物多酚的種類與化學結構

植物多酚是一類苯環上連有一個或多個羥基的次生代謝物，化學結構獨特，可以清除多種自由基，有較強的抗氧化功效。植物多酚廣泛分布于植物的根、葉、皮和果中。目前，從植物中鑒定出的多酚化合物有8 000余種。在自然界中，酚類化合物通常與糖和有機酸結合，根據芳香環的數量及位置分為黃酮類和非黃酮類兩大類[5]。黃酮類由兩個芳香環(環A和環B)通過三碳氧化雜環(環C)連接而成，根據雜環的氧化程度，黃酮類可分為花青素、異黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃酮和黃烷醇等6個亞族(圖1)[6]。黃酮類物質含有鄰二酚基團、羰基共軛雙鍵及酚羥基等結構元素，能與氧自由基反應，中斷鏈式氧化反應，發揮抗氧化作用[7]。而黃酮醇中的槲皮素能集合黃酮的所有結構元素，發揮的抗氧化功效最強[8]。非黃酮類物質種類多樣，既有簡單酚酸類(C6-C1)又有復雜芪類(C6-C2-C6)。在芪類物質中(圖2)，芳香環通過帶雙鍵的碳橋連接而成，白藜蘆醇是芪類物質的母體，存在多個酚羥基并發揮生物活性[9]。

圖1 黃酮及其部分亞族的分子結構[6]Fig.1 Molecular structures of flavonoids and some of their subgroups[6]

圖2 芪類及白藜蘆醇的分子結構[6]Fig.2 Molecular structures of stilbenes and resveratrol[6]

1.2 植物多酚的作用

1.2.1 植物多酚的抗氧化作用 植物多酚的抗氧化能力取決于化學結構中酚羥基的數量與位置，并隨羥基化程度逐漸增強[10]。Xiao等[11]研究了4種黃酮醇的羥基數目，發現羥基數目與抗氧化能力排序一致，依次為楊梅素>槲皮素>山奈酚>高良姜素；羥基的取代位置也會影響植物多酚的抗氧化作用，鄰位和對位二酚的抗氧化能力較強。Brown和Kelly[12]發現，植物多酚中矢車菊素和原兒茶酸抗氧化活性最強，其所含羥基多為鄰位取代；沒食子酸羥基數最多，但活性反而降低。

機體中的脂質氧化屬于自由基鏈式反應[13]。鐵、銅等金屬離子是脂質氧化的啟動劑，能催化H2O2的分解并產生羥基自由基，植物多酚可螯合金屬離子形成穩定絡合物，減少羥基自由基的產生，并阻斷脂質過氧化反應[2]。螯合反應的作用位點來源于植物多酚的鄰位酚羥基及羥基與羰基的組合部分。目前，黃酮與鐵螯合作用的研究較為完善(圖3)，普遍存在“鐵螯合位點”為3-羥基-4-羰基、4-羰基-5-O羥基和3’-4’-羥基部位，也有研究發現，黃芩素的6-7號位羥基也是鐵的螯合位點[14-15]。這些螯合位點能直接作用于活性氧，維持機體的內源性防御系統。

灰色和虛線區域是鐵螯合位點The gray and dashed areas are iron chelation sites圖3 黃酮類抗氧化的結構特征[6]Fig.3 Structural characteristics of flavonoid antioxidants[6]

1.2.2 植物多酚抗氧化作用在動物中的作用 植物多酚可以提高動物的抗氧化潛力，降低動物屠宰后肌肉氧化損傷的風險，對肉的色澤、風味等會產生積極影響[13]。在母豬日糧中添加白藜蘆醇，可降低胸長肌丙二醛水平，提高SOD酶活性[16]。Andrés等[17]發現，在羔羊飼料中添加槲皮素可降低肉中不飽和脂肪酸和脂質氧化的比例。在育成豬飼料中添加鱷梨廢料(類黃酮)，豬肉在貯藏期間具有較低的脂質和蛋白氧化速率[18]。因此，日糧中添加多酚類物質是一種通過抑制脂質和蛋白質氧化來改善動物肉質的新策略。

2 日糧添加植物多酚對肉色穩定性的影響

在畜禽營養領域，植物多酚作為一種天然的飼料添加劑，在豬、雞、羊、牛上都得到了廣泛應用。通過添加不同種類的植物多酚，可對肉色產生積極影響(表1)。影響肉色穩定性的因素包括蛋白和脂質的氧化狀態、骨骼肌的纖維類型及機體內源的抗氧化能力等，當動物攝入植物多酚后，在胃腸道菌群的作用下實現部分吸收利用，不僅能調控肌纖維類型、影響機體內的氧化狀態，還能沉積于動物肌肉組織并提升抗氧化能力，最終達到改善肉色穩定性的目的。

表1 日糧中添加植物多酚對畜禽肌肉肉色的調控Table 1 Regulation of muscle colour in livestock by dietary addition of plant polyphenols

2.1 植物多酚對肌紅蛋白氧化狀態的影響

肌肉組織中肌紅蛋白的主要作用是輸送和儲存氧氣，以脫氧肌紅蛋白(deomyoglobin，DMb)、氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin，OMb)和高鐵肌紅蛋白3種形式存在，它們之間可按照以下順序進行可逆轉化：DMb?OMb?MMb[26]。肌肉組織中肌紅蛋白易氧化為無生理活性的MMb，而MMb積累可引起肉色的劣變，因此，阻止MMb的產生以及提高其還原能力是控制肉色變化的關鍵[27]。線粒體可通過酶促和非酶促途徑實現MMb還原。線粒體內存在著完整的高鐵肌紅蛋白還原酶系統，依賴NADH通過酶促途徑介導MMb的還原[28]。NADH作為電子供體，將電子傳遞至細胞色素b5還原酶，后者將電子轉移給細胞色素b5，還原態的細胞色素b5再將電子傳遞到MMb的血紅素輔基中，從而使正3價鐵離子還原為正2價，實現MMb的還原[29-30]。非酶促途徑也能實現MMb的還原，在氧化呼吸鏈中，線粒體膜中的復合物I、復合物II分別催化NADH和琥珀酸脫氫，并將脫下的H+傳遞給輔酶Q，后者將H+釋放到介質中，電子進一步經復合體III、細胞色素c和復合體IV傳遞給MMb，最終實現MMb的還原[31-32]。

植物多酚可在腸道消化后轉化為可吸收的苷元等，進一步沉積于肌肉組織中，這對動物肉色產生積極影響[33]。這些物質不僅能提高機體的抗氧化性能，還會激活線粒體呼吸鏈，增強MMb還原酶系的活力。Luciano等[22]在飼料中添加單寧后，發現肌肉中酚類化合物提高，減緩了肌細胞內線粒體的氧化進程，有效保護了線粒體膜的完整性及其活性；酚類物質還延緩了MMb生成速率，提高了肉色穩定性。劉策[21]研究發現，苜蓿皂苷能增強綿羊肌肉中高鐵肌紅蛋白還原酶(MetMbase)、琥珀酸脫氫酶(SDH)及細胞色素c氧化酶(COX)的活力，推斷苜蓿皂苷激活并促進了線粒體呼吸鏈的電子傳遞速率，使MMb發生還原反應，有效改善了肉色。因此，植物多酚可通過改變肌紅蛋白的氧化還原狀態達到調控肉色的目的。

2.2 植物多酚對脂質氧化程度的影響

動物肌肉中脂肪十分豐富，其中不飽和脂肪酸(UFA)極易發生脂質氧化產生自由基(L·、LOO·、O2-等)和氧化代謝產物，包括丙二醛(malondialdehyde，MDA)、4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，HNE)，會對肉色產生不利影響[34]。動物宰后，肌細胞膜的完整性被破壞會增加脂質氧化的風險，而Mb更容易與UFA接觸并催化脂質氧化，脂質氧化終產物的積累也會加劇Mb的氧化。自由基能奪取肌紅蛋白中Fe2+的電子，使其氧化為Fe3+；脂質氧化產物既能氧化OMb，又能影響MMb的還原能力，最終導致脂質氧化與肌紅蛋白氧化耦合發生[30,35]。

植物多酚是天然氧化抑制劑，可通過清除自由基、螯合金屬離子等途徑來抑制脂肪氧化。Natalello等[23]在羔羊飼料中添加石榴副產物，發現羔羊肌肉中的脂質氧化受到了抑制，推測是植物多酚阻斷了鏈式反應的進行，及時清除了脂質氧化產生的自由基，減少MMb的積累。Emami等[36]發現，膳食中補充植物多酚可使山羊肌肉組織中TBARS值線性下降，這與石榴中含有鞣花酸等酚類物質有關，鞣花酸含有酚羥基，能結合脂質氧化產物并阻斷后續鏈式反應。植物多酚除了能提供氫自由基來阻斷脂質氧化進程外，還能螯合過渡金屬形成惰性絡合物，從源頭阻止脂質氧化的發生。Morel等[37]建立了鐵誘導的細胞脂質氧化模型，在鐵處理的肝細胞培養物中加入楊梅素，發現細胞中丙二醛和脂質氧化初級代謝物的生成速率明顯降低。同時，Cimmino等[38]在日糧中添加植物多酚發現，羔羊血漿中鐵濃度及MDA生成量降低，說明植物多酚能螯合金屬鐵，抑制芬頓反應的發生，降低脂質氧化水平。Maggiolino等[24]研究發現，飼料中添加木質素可發揮抗氧化作用，降低牛肉脂質氧化程度并提高肉色穩定性。

2.3 植物多酚對肌纖維類型的影響

骨骼肌的基本組成單位是肌纖維，通常排列成束，周圍環繞著結締組織。肌纖維可劃分為慢速收縮氧化型(Ⅰ型)、快速收縮氧化型(Ⅱa型)、中間型(Ⅱx型)和快速收縮酵解型(Ⅱb型)4種類型[39]。Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維主要進行有氧代謝，需要大量的肌紅蛋白和線粒體來攜氧供能，因而肌肉中氧化型肌纖維比例越高，肉色越好；相反，Ⅱb型肌纖維的能量代謝以糖酵解為主，肌紅蛋白含量較少，肌肉顯得蒼白，因此，肌纖維類型組成與動物肉色密切相關。動物出生后肌纖維數量基本固定，但類型會受環境、年齡及營養等因素的影響發生Ⅰ?Ⅱa?Ⅱx?Ⅱb的表型轉化[40]。Gagaoua等[41]試驗證明，飼養方式可能是肉色和肌肉纖維之間關聯的根源。Dunne等[42]早期研究發現，放牧飼養的動物中氧化型肌纖維比例較高，肌紅蛋白含量豐富，這也為后續通過改變飼養方式進而改善肉色奠定了研究基礎。

動物飼糧中添加植物多酚，可提高過氧化物酶受體增殖激活受體輔助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha，PGC-1α)的表達，實現肌纖維類型的轉化，進而改善動物的肉色[43]。Zhang等[20]研究表明，在飼料中添加白藜蘆醇可提高豬背最長肌的a*值和Mb含量，究其原因是白藜蘆醇提高了肌球蛋白重鏈MyHC Ⅱa以及PPARs基因表達水平，增強了線粒體功能，提高了氧化型肌纖維的比例。越來越多的研究致力于闡明植物多酚影響肌纖維類型轉化的機理。有研究表明，PGC-1α與Ⅰ型肌纖維的形成關系密切，敲除小鼠PGC-1α基因，會誘導小鼠骨骼肌從氧化型向酵解型轉化[44]。Mizunoya等[45]研究發現，在小鼠飼料中添加5%蘋果植物多酚，可通過上調PPAR-γ從而激活PGC-1α相關途徑，增加Ⅰ型肌纖維的比例。

3 植物多酚介導的肉色穩定性作用機制

3.1 Nrf2/Keap1-ARE信號途徑

Nrf2/Keap1-ARE信號通路是增強機體抗氧化功能的保護性信號途徑[46]。如圖4所示，在Nrf2/Keap1-ARE信號通路中，核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)活性受Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)調控[47]。機體正常狀態下，細胞中的Nrf2與Keap1結合，處于非活性狀態[48]；而氧化應激會導致Keap1構象發生改變并與Nrf2分離，Nrf2進入細胞核，識別核內小Maf蛋白并結合抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)從而啟動Ⅱ相脫毒酶和抗氧化酶相關基因的表達和蛋白的合成，從而提升細胞的抗氧化能力[49]。

圖4 植物多酚影響抗氧化能力的信號通路[45-46]Fig.4 Signaling pathways of plant polyphenols affecting antioxidant capacity[45-46]

植物多酚能通過促進不同途徑激活上述信號通路，增強內源性抗氧化能力，降低肌肉組織中脂質過氧化并抑制肌紅蛋白氧化，具有保護肉色及其穩定性的作用[46,50]。細胞中負責活化Nrf2的蛋白激酶系包括蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PIK3)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及p38等[50]。植物多酚能通過激活Nrf2酶系來誘導Nrf2磷酸化參與對轉錄活性的調節，促使Nrf2/Keap1復合物中釋放出Nrf2，并進一步結合到ARE上調節抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達從而提高細胞抗氧化能力。Chen等[51]發現，在細胞中添加PIK3和MEK1/2的抑制因子LY294002和U0126后，下游的Akt和ERK1/2失活，這減弱了白藜蘆醇誘導細胞HO-1表達的能力，由此證明白藜蘆醇是通過磷酸化ERK和Akt來激活PC12細胞中的Nrf2。Tsai等[52]用鼠尾草酸(迷迭香酚)處理細胞，發現鼠尾草酸可激活MAPKs中p38的活性，并隨劑量的增加，Nrf2、ARE和醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)活性也隨之增加。李黎云[53]研究發現，飼糧中添加0.01%阿魏酸能有效提高豬背最長肌中抗氧化酶基因的表達水平，推斷阿魏酸可能是通過蛋白激酶PI3K和ERK途徑致使Nrf2磷酸化，激活Nrf2/Keap1-ARE信號通路。Sun等[54]在1日齡肉雞飼料中添加槲皮素，發現可促進Nrf2從細胞質到細胞核的易位，這激活了Nrf2信號通路，增加了Nrf2下游基因水平的表達；此外，槲皮素還削弱了脂多糖對ERK、JNK和p38磷酸化的抑制作用，說明槲皮素對脂多糖誘導的肉雞腸道氧化應激具有的潛在保護作用。

Keap1包含5個不同的功能區，其中插入區(intervening region，IVR)富含半胱氨酸殘基，是整個蛋白的功能調節區。植物多酚可以通過修飾Keap1中IVR區的半胱氨酸(Cys)位點，使Keap1蛋白的構象發生改變而與Nrf2解偶聯，激活Nrf2/Keap1-ARE通路[55]。Tanigawa等[56]發現，槲皮素會使HepG2細胞中Keap1半胱氨酸殘基被修飾引起構象變化，這降低了Keap1蛋白水平，提高了Nrf2/Keap1比例。有研究發現，在氧化應激條件下，茶多酚的B環會被氧化成半醌自由基，醌類物質可與IVR區的半胱氨酸的巰基反應形成2’-半胱氨酸茶多酚，破壞Keap1結構；同時，茶多酚自身氧化產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可以氧化Keap1的半胱氨酸硫醇，導致Nrf2對Keap1的親和力下降[46]。Shin等[57]發現，小鼠表皮細胞轉染突變體Keap1蛋白(其中Cys151被絲氨酸取代)后，姜黃素誘導HO-1及Nrf2的能力降低，質譜分析表明，姜黃素可作用于Keap1且與Cys151位點結合，說明Cys是姜黃素修飾Keap1的關鍵靶點。

植物多酚還可通過調控其他轉錄因子和核蛋白表達來介導Nrf2/Keap1-ARE通路。Liu等[58]研究發現，核因子-κB(NF-κB)在轉錄水平抑制Nrf2信號通路。周莎莎等[59]通過腎損傷小鼠模型發現芹菜素能激活NF-κB相關通路，上調Nrf2表達，使小鼠機體抗氧化性能增強。也有研究發現，膳食中的白藜蘆醇能增加沉默信息調節因子1(SIRT1)表達，SIRT1過表達會促進Nrf2的核積累，調節Nrf2介導的II相解毒酶來提高細胞的抗氧化能力[60]。綜上，植物多酚可通過多種途徑調節Nrf2/Keap1-ARE通路，增強抗氧化相關基因表達，進一步調控肌紅蛋白的氧化狀態及脂質氧化進程來提高肉色穩定性。

3.2 PGC-1α信號途徑

PGC-1α是核受體輔助激活因子，相關通路是肌纖維類型轉化的關鍵信號途徑。PGC-1α作為肌纖維類型轉化信號網絡的中心樞紐，由細胞信號級聯系統控制其激活、表達及信號傳遞，其上游調控因子主要包括脂聯素(adiponectin，AdipoQ)、沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等；下游效應物為過氧化物酶受體增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)、肌細胞特異性增強結合因子2(myocyte-specific enhancer-binding factor 2，MEF2)及雌激素相關受體γ/β(estrogen-related receptor γ/β，EERγ /β)等[61]。機體受到氧化刺激時，細胞內與PGC-1α相關的通路激活后可誘導肌纖維類型的轉化(圖5)。

圖5 植物多酚影響骨骼肌纖維類型轉化的信號通路[39, 62-64]Fig.5 Signaling pathways of plant polyphenols affecting skeletal muscle fiber type conversion[39, 62-64]

植物多酚可作用于PGC-1α信號途徑上游調控因子，包括AdipoQ、AMPK及SIRT1等，激活下游效應物，參與調節骨骼纖維類型的轉換。AdipoQ是脂肪組織分泌的一種活性物質，不僅可調節脂肪沉積，還與肌纖維的類型密切相關。Chen等[62]為探究飲食補充槲皮素誘導小鼠肌纖維類型轉化的分子機制，以C2C12細胞體外模型為研究對象，敲除C2C12細胞肌管中AdipoQ受體，結果發現氧化型肌纖維顯著降低，這表明槲皮素介導的骨骼肌纖維轉化依賴于AdipoQ信號通路。AMPK是細胞的能量感受器，除對肌肉能量代謝起關鍵調節作用外，還參與調控肌纖維類型轉化[65]。Chen等[66]發現，在小鼠飼料中添加阿魏酸可提高AMPK磷酸化水平，AMPK經磷酸化激活后會調控其下游通路PGC-1α，從而上調PPARs等下游靶基因的表達，進而影響MyHC基因表達，促進骨骼肌慢肌纖維形成。除AMPK之外，SIRT1是另一能量感受器，在骨骼肌組織的能量代謝中發揮重要作用。當SIRT1活性增強，會導致其下游靶點(PGC-1α)的去乙酰化，促進紅肌纖維的形成[67]。Ljubicic等[68]給6周齡小鼠喂食白藜蘆醇可誘導骨骼肌向紅肌纖維轉化，并確定此過程與AMPK-SIRT1-PGC-1α信號通路密切相關。Price等[64]發現，白藜蘆醇可顯著降低PGC-1α 乙酰化水平，誘導紅肌纖維的生成，但在缺乏SIRT1的條件下，這種影響消失，說明白藜蘆醇可能是通過SIRT1來間接調控 PGC-1α 表達的。Akashi等[69]給小鼠飼喂橙皮素5周后，觀察到小鼠骨骼肌中PGC-1α蛋白水平、線粒體含量及氧化型肌纖維比例增高，表明橙皮素可介導PGC-1α誘導線粒體生物發生及紅肌纖維的形成。此外，研究還發現，隨著橙皮素的增加，SIRT3和AMPK的表達增強，暗示橙皮素可能刺激了SIRT3、AMPK和PGC-1α相關信號通路。

miRNAs是一類保守性極高的非編碼RNA，此前已有研究證實miRNA 在控制骨骼肌發育、肌球蛋白表達和肌纖維表型等方面有重要作用[70]。多種miRNAs作用于PGC-1α信號通路調控因子上，發揮調控肌纖轉化的作用。每種miRNA調控肌纖維轉化的作用機制不同，其與肌源性調控因子的互作復雜交錯，且存在負反饋回路。Fnip1是負反饋AMPK的關聯蛋白，miR-499靶向抑制Fnip1后，經過AMPK-PGC-1α通路來誘導肌纖維類型轉化。miR-23a可直接靶向MEF2C，miR-143則通過HDAC4-MEF2通路來調控慢型肌纖維基因的表達[70-72]。余親平[73]發現，復方中草藥的活性成分6-姜酚可通過調控 miR-27b/PPAR比例，影響豬慢肌纖維基因和蛋白的表達水平，改變肌纖維類型。植物多酚會激活胞內與肌纖維轉化相關的PGC-1α信號通路，通路中各調控因子互相影響，共同完成酵解型向氧化型肌纖維的轉化，改善動物肉色及其穩定性。

4 小結與展望

肉色及其穩定性與肌紅蛋白氧化狀態、脂質氧化程度和骨骼肌纖維類型密切相關。植物多酚能夠通過激活Nrf2/Keap1-ARE途徑上調內源性抗氧化能力，調控肌紅蛋白與脂質的氧化狀態；還可以誘導與輔助活化因子PGC-1α相關的信號通路，調節肌纖維類型的轉化，為改善肉色提供新的途徑。

植物多酚在體內的活性及效用取決于多種因素，包括多酚的多樣性、腸道微生物體系的復雜性及宿主的健康和免疫狀態。植物多酚的代謝與吸收離不開腸道菌群的參與，其代謝產物能夠發揮出對腸道微生物群和機體更有益的作用。腸道微生物體系和多酚代謝物之間存在著緊密的相互依賴關系，兩者在維持宿主腸道內環境平衡方面起著關鍵作用。但是，完全闡明腸道微生物體系、多酚以及與腸-腦功能之間的相互作用是一項還未解決的難題。因此，進一步的研究應該集中在機體攝入多酚后的代謝途徑上，因為具體的作用途徑是揭開背后機制的關鍵。此外，通過使用組學方法，可以獲得關于腸道微生物組成、多酚及其結腸發酵產物和其他微生物體系代謝物更準確的信息，更好地了解它們在宿主中的作用效應[74-76]。