CRISPR/Cas9系統在寄生原蟲基因編輯中的應用

鄧敏兒，李 娜，郭亞瓊，馮耀宇，肖立華

(華南農業大學，嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣州 510642)

原生動物包含許多人獸共患和重大動物疫病寄生蟲，嚴重影響人類和動物健康。由于生活史復雜，不少寄生蟲缺乏完成整個生活史的體外培養技術，原蟲的功能基因組學和分子生物學研究因此受阻。1993年，弓形蟲[1-2]和瘧原蟲[3]被報道可以利用同源重組實現報告基因的表達，此后其他原蟲的反向遺傳學工作平臺也逐步建立。最近20年，原蟲的反向遺傳學研究取得長足進展。通過設置同源臂的方法，同源重組技術為原蟲的基因定位、功能研究、抗原篩選等研究提供有力支持[4]。但同源重組的基因編輯系統存在轉染效率較低、需要的同源臂較長、篩選過程時間長的問題。有的原蟲(如隱孢子蟲)基因組小，缺乏同源重組修復系統，較難開發同源重組基因編輯體系。

CRISPR(成簇的規則間隔的短回文重復序列)是在細菌和古細菌中發現的一種天然存在的適應性免疫系統，其作用是破壞噬菌體和質粒等外源DNA序列[5-7]。最早研究的源自化膿鏈球菌的Cas9蛋白(SpCas9，最初被命名為CSN1)是目前最常用的Cas9蛋白。此外，2017年報道源自金黃色葡萄球菌的SaCas9蛋白在克氏錐蟲基因編輯中達到幾乎100%的基因敲除效率。2012年2個實驗室的工作證明優化后的CRISPR/Cas9系統可用于生物的基因編輯，并將該系統工作所需的2條RNA進一步簡化為一條向導RNA(gRNA)，實現人工設計靶向不同基因區域的gRNA和Cas9蛋白，完成定向高效的DNA雙鏈切割[6-7]。CRISPR/Cas9系統被《Science》雜志評選為2013年度最重要的科學突破之一，自應用以來在生命科學領域大放異彩，在寄生蟲研究上也從瘧原蟲和弓形蟲，逐步推廣到在利什曼原蟲、隱孢子蟲和艾美耳球蟲等的應用。CRISPR/Cas9系統在人工設計的前提下，完成定向DNA雙鏈斷裂(DSB)，供體的模板質粒只需更短的同源臂，即可完成準確高效的基因編輯。該系統還可針對多基因家族[8]，利用少量的gRNA完成高通量全基因組篩查工作，是寄生蟲的基因功能研究強有力的工具。本文將從CRISPR/Cas9系統的工作原理和目前在寄生原蟲中的主要應用進行介紹。

1 CRISPR/Cas9系統工作原理

在CRISPR/Cas9系統出現之前，原蟲的基因編輯主要通過同源重組的方式實現。將帶有一定長度(一般至少400 bp)同源臂的目的基因的質粒轉入寄生蟲，利用同源重組讓目的基因插入原蟲基因組同源臂中，從而實現基因編輯[9]。該方法所需時間長，轉染效率低(雙質粒共轉染的效率更低)，藥物篩選耗時較長，一般只能進行單基因的研究。

CRISPR/Cas9系統分為I型、II型和III型，其中III型在基因編輯上應用最廣泛——主要通過Cas9蛋白對目標DNA雙鏈切割。2013年，CRISPR/Cas9系統被簡化為只需要Cas9蛋白和20 bp的gRNA即可完成定向DNA編輯[6-7]。CRISPR/Cas9系統工作原理及修復機制如圖1所示，其中DNA雙鏈斷裂修復主要通過3個機制：1)同源直接修復(homologous direct repair，HDR)。當存在具有斷裂位點上下游同源臂的DNA時，以此為模板進行修復。2)非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。當缺少供體模板時，在兩個斷口直接連接。3)微同源末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)。利用微同源小片段切除非同源的單鏈DNA，斷口處直接連接。

圖1 CRISPR/Cas9系統工作原理及修復機制Fig.1 Principle and repair mechanism of the CRISPR/Cas9 system

除常用的電轉含有Cas9和gRNA質粒的方法外，還可以將Cas9蛋白和gRNA復合物直接轉入寄生蟲體內。后者在克氏錐蟲中達到轉染效率接近100%的效果[10]。CRISPR/Cas9系統顯著提高原蟲的轉染效率，并且可通過建立gRNA文庫的方式，完成雙基因、甚至多基因的研究，為多基因家族功能研究提供高通量快速篩查的高效準確工具。

2 CRISPR/Cas9系統在原蟲中的應用

寄生原蟲基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術開展較早，可追溯到20世紀80年代末、90年代初[1-3, 11-16]。2014年Shen等[17]和Zhang等[18]分別將CRISPR/Cas9技術引入弓形蟲和克氏錐蟲的反向遺傳學研究，自此CRISPR/Cas9系統逐漸在研究原蟲的基因定位、基因敲除、基因家族高通量篩選等方面嶄露頭角[19-60](部分原蟲基因編輯技術發展情況見圖2)。與傳統的同源重組技術相比，CRISPR/Cas9系統不僅具有轉染效率更高、周期更短、準確性更高等優點，并且可在較短的時間內對同源性高的基因家族進行高通量篩選。此外，CRISPR/Cas9系統可結合多種反向遺傳學研究策略，如利用CRISPR/Cas9系統標記關鍵基因[19]、結合類植物生長素誘導條件性降解系統(auxin-inducible degron，AID)[20]研究必需基因的功能和表型、利用改良的CRISPR/dCas9系統進行表觀遺傳學研究[21-22]等，顯著擴展其應用領域，為假定基因的功能研究提供高效工具。

月亮、太陽和星星標記分別代表瞬時轉染、穩定轉染和CRISPR/Cas9技術[1-3,9,11-13,15-19,23-24,49-63]Moon, sun, and star shapes indicate transient, stable transfection, and CRISPR/Cas9-based editing, respectively[1-3,9,11-13,15-19,23-24,49-63]圖2 部分原蟲基因編輯技術發展時間線Fig.2 Timeline of the development of genetic manipulation methods in some parasitic protozoa

2.1 瘧原蟲

2014年，2個研究團隊分別報道了CRISPR/Cas9系統在瘧原蟲上的應用。Wagner等[23]利用T7 RNA聚合酶產生的sgRNA和Cas9蛋白對惡性瘧原蟲的基因組進行編輯，分別靶向富含組氨酸的疣狀突起相關蛋白基因(kahrp)和紅細胞結合抗原175基因(eba-175)，證實該系統在惡性瘧原蟲上具有較高的基因編輯效率(50%～100%)。惡性瘧原蟲缺乏NHEJ途徑，CRISPR/Cas9系統可顯著提高瘧原蟲的基因編輯效率。

同年，Ghorbal等[24]同樣構建對惡性瘧原蟲基因編輯的CRISPR/Cas9系統，利用Cas9質粒及含sgRNA和人二氫葉酸還原酶藥篩基因(hdhfr)的供體模板質粒共轉染的方案，敲除表達綠熒光的NF54株的egfp基因。此時Cas9蛋白為瞬時表達。3周內得到的WR耐藥蟲株PCR和熒光檢測均證實egfp基因被成功敲除。供體模板質粒線性化后轉染，證實與環形質粒幾乎一致的轉染效率，而且具有轉染4 d后線性化模板自動丟失的優點，避免供體模板對整合效果檢測的影響。除了靶向egfp基因，同樣的方案應用在內源性的非必需基因kahrp上得到了相似的效果。后續研究利用該系統對orc1基因完成不帶標簽的定點突變，發現基因敲除的克隆株具有青蒿素抗性。

CRISPR/Cas9系統作為強大的基因編輯工具，為瘧原蟲的基因編輯研究提供有力支持。如2015年Nacer等[25]利用該系統鑒定PfVAP1(毒力相關蛋白1)是惡性瘧原蟲細胞黏附的關鍵因素。Mogollon等[26]2016年改良Ghorbal等團隊的研究方法，重新設計sgRNA和供體質粒，證實PfVAP1在FCR3瘧原蟲的黏附過程中的作用。Bryant等[27]在2017年使用該系統完成惡性瘧原蟲var2csa基因編輯，發現缺失內含子不影響該基因對正常調控。2019年Xiao等[22]應用改良的 CRISPR/dCas9 系統對寄生蟲入侵相關基因的轉錄進行表觀遺傳調控，并證明dCas9可以將融合的表觀遺傳調節因子[如組蛋白乙酰轉移酶(HAT)或去乙?；?HDAC)結構域]，完成惡性瘧原蟲基因過表達或轉錄敲低。同年Mohring等[28]實現CRISPR/Cas9系統在諾氏瘧原蟲基因組編輯上的應用，但存在同源重組修復效率低的問題。2021年Boltryk等[29]報道利用CRISPR/Cas9建立NF54誘導的配子體產生蟲株，實現大規模同步產生定向分化的配子體，為瘧疾傳播階段研究提供寶貴工具。

2.2 弓形蟲

弓形蟲具有較為成熟且容易的體外培養和遺傳研究系統，突變誘導、基因標記、基因敲除和基因替換等較其他原蟲容易[8]。同時弓形蟲具有活躍的NHEJ途徑，DNA隨機整合效率高，因此降低同源重組的精確性。

Shen等[17]早在2014年對CRISPR/Cas9系統進行改造，將含有靶向尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(UPRT)基因的sgRNA和Cas9-NLS-GFP的質粒電轉入I型RH株中，有20%～30%的弓形蟲為Cas9-GFP陽性。UPRT失活可產生氟脫氧核糖(FUDR)抗性，故FUDR耐藥性的噬斑試驗證實約有10%的Cas9-GFP陽性弓形蟲UPRT失活。FUDR耐藥的單克隆蟲株目標區域的基因測序結果證實UPRT存在短缺失或插入突變。重復上述轉染試驗時共轉包含乙胺嘧啶耐藥基因DHFR的供體質粒，同時用乙胺嘧啶篩選，觀察到70%～100%的乙胺嘧啶抗性寄生蟲同樣抗FUDR。乙胺嘧啶抗性蟲株的單克隆的PCR結果證實超過45%的蟲株為DHFR的正確整合，說明該系統能有效增強gRNA靶向區域的局部重組，提高基因敲除頻率。改變供體質粒后重復試驗，成功刪除UPRT基因，說明該系統可同樣應用于較大基因區域的敲除。為研究該系統是否與同源重組的基因編輯相同、存在需要相對較長同源臂的局限性，該團隊將長同源區域(750～900 bp)、20 bp側翼區域和缺乏同源性的dhfr的靶向效率做比較，發現三者均顯示高于50%的正確整合效率，表明該系統可用于提高特定位點的非同源整合效率。該團隊用靶向絲氨酸蘇氨酸激酶(ROP18)的質粒對I型的GT1株的敲除及敲除蟲株的回補試驗，證實該系統可廣泛地應用于弓形蟲基因編輯。2017年該團隊優化CRISPR/Cas9系統，通過引入突變降低Cas9蛋白毒性，并提供弓形蟲CRISPR/Cas9系統應用操作指南[30]。

Sibley團隊在2017年報道2篇CRISPR/Cas9系統和類植物生長素誘導的降解因子(AID)系統在弓形蟲基因功能研究中的應用：Long等[31]檢測類鈣調蛋白(CaM)的功能，證實CaM與肌凝蛋白(MyoH)共定位，且與弓形蟲入侵密切相關；Brown等[32]檢測蛋白激酶(PKGs)的功能，證實PKG I為弓形蟲生長必需蛋白，而PKG I存在的前提下，PKG II為弓形蟲的非必需蛋白。

Sidik等[33]在2014年構建包含靶向速殖子表面蛋白基因(sag1)的嵌合體RNA(chiRNA)和帶flag標簽帶Cas9蛋白的質粒。在未經篩選的情況下，RH株的sag1敲除效率約為20%。用缺少NHEJ修復機制的ΔKU80株重復上述試驗，寄生蟲數量與RH株相比減少10倍，而轉染效率相當。根據轉染替換Cas9成dhfr的相似質粒的2種蟲株的噬斑試驗對比，進一步證明弓形蟲在DNA雙鏈斷裂后依賴NHEJ修復。該研究還利用較短的同源臂(40 bp)定點插入模板DNA，實現對內源性基因cdpk3的標記。該團隊在2016年設計gRNA文庫，對弓形蟲基因組進行高通量篩選[8]。

Cas9蛋白在弓形蟲中存在內在毒性，傳代過程中該基因頻繁丟失，Markus等[34]在2019年發現優化表達載體和gRNA的設計能顯著降低Cas9蛋白的毒性，認為gRNA同時具有基因組靶向、促進Cas9蛋白的整合和降低Cas9毒性、提高適應性的功能。

CRISPR/Cas9系統在弓形蟲研究中應用以來，已成為弓形蟲高通量篩選[8,35-37]、基因功能驗證[38-39]、致病機制[40-41]、免疫互作[35, 42-44]、代謝分析[45]、藥物機制[36, 46]、疫苗開發[47]等研究必不可少的工具，并在此基礎上開發的AID系統[20]、轉錄抑制(基因條件性敲低)[48]等新工具，為寄生蟲研究提供更廣闊的研究前景。

2.3 艾美耳球蟲

Tang等[57]報道CRISPR/Cas9系統在柔嫩艾美耳球蟲高效基因編輯的應用。首先通過瞬時轉染His4啟動子介導的含有黃熒光基因(yfp)標記的Cas9質粒進入子孢子，體外培養24 h觀察到球蟲細胞核發黃熒光，證實His啟動子介導的Cas9基因可在細胞核內表達。然后構建靶向黃熒光基因的sgRNA的質粒轉染已有同時發黃熒光和紅熒光的EtER蟲株，在CRISPR/Cas9系統作用下，轉染成功的球蟲內因為黃熒光基因發生斷裂而失去黃熒光。經過4次傳代和流式細胞術篩選，發現黃熒光陽性比例減少到89.5%，說明缺少供體質粒的情況下，球蟲偏向于利用NFEJ途徑進行自我修復。另外還構建靶向mic2基因末端的sgRNA質粒和帶有紅熒光基因和藥篩基因的供體質粒，對野生型球蟲子孢子共轉染，并利用PCR和IFA進行驗證。試驗證明CRISPR/Cas9系統可用于球蟲內源性基因和外源性基因的基因編輯，但效率遠低于弓形蟲或瘧原蟲，推測可能是雙質粒共轉染或轉染效率低所致。

Hu等[19]利用同源重組技術成功構建在生活史各階段均能穩定表達Cas9蛋白的柔嫩艾美耳球蟲株。該蟲株轉染不同sgRNA質粒，能進行高效的球蟲單基因編輯。向該蟲株轉染含有靶向外源的黃熒光基因的sgRNA的質粒，證實該系統切割效率可達29%。接著轉染針對內源性蛋白EtGRA9的sgRNA和供體質粒，為EtGRA9加上熒光標記，在共聚焦顯微鏡下發現EtGRA9標記信號存在于囊泡中而不是致密顆粒中，說明EtGRA9屬于分泌蛋白。同時設計靶向AP2家族33個基因的sgRNA，經過6次轉染試驗，發現只有10個AP2家族的基因被靶向破壞，其中可檢測9個gRNA(另一個有效讀數較低，表明破壞該基因引起蟲體生長缺陷)。該試驗證明球蟲AP2家族中，23個基因在球蟲生長繁殖必不可少，為球蟲AP2家族研究奠定基礎，也證明該工具蟲株可以對球蟲進行高效的單基因編輯。

2021年Cheng等[64]報道FnCas12a/crRNA和RNP技術可用于柔嫩艾美耳球蟲的基因編輯。該團隊成功靶向組蛋白H4基因導致其DNA雙鏈斷裂，另外還利用eYFP標記內源性EtActin蛋白，觀察不同時期肌動蛋白的定位情況。同年Mohsin等[65]報道體外試驗中Cas9 mRNA與sgRNA結合可降低卵囊的孢子化率和存活率，為抗球蟲試劑研發提供新思路。

2.4 錐蟲

克氏錐蟲由于缺少RNAi的機制，故在功能遺傳學研究中受到限制。因此，克氏錐蟲的研究需要更強大的反向遺傳學研究工具。

2014年Peng等[49]報道CRISPR/Cas9系統在克氏錐蟲的首次應用。構建穩定表達綠熒光(GFP)和Cas9(源自化膿鏈球菌)的蟲株后，再分別轉入3種靶向gfp的sgRNA。在沒有模板的情況下，克氏錐蟲的Cas9誘導的DSB的修復缺乏NHEJ途徑，只能通過MMEJ進行，產生各種大小的基因缺失。在提供模板tomato標記的情況下，CRISPR/Cas9的基因編輯效率比僅用模板質粒的同源重組方式更高。除外源性基因gfp的破壞外，還利用CRISPR/Cas9分別成功敲除內源性的α-微管蛋白基因、組氨酸裂合酶(HAL)基因和脂肪酸轉運蛋白(FATP)基因。此外，還利用CRISPR/Cas9系統對同源性高的多基因家族進行研究，僅設計3個sgRNA即可靶向β-半呋喃糖基糖基轉移酶(GAL)家族的65個基因，3次轉染后，63%的gal基因獲得至少1個靶位點突變，顯著敲低該酶基因家族的表達，且未觀察到脫靶現象。最后，該研究利用靶向Cas9的sgRNA對Cas9基因破壞，挽救表達Cas9的蟲株生長缺陷。上述研究證明CRISPR/Cas9系統可快速高效敲除單拷貝或多拷貝基因，但存在蟲株生長速度慢和Cas9活性隨時間降低的問題。

Lander等[66]在2015年報道CRISPR/Cas9編輯系統對鞭毛桿蛋白1和2敲除研究，試驗結果亦反映出該系統存在藥物篩選時間長(數周)和無法研究必需基因的問題。

Soares等[10]在2017年采取源自金黃色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9蛋白和gRNA復合物電轉的方式，建立接近100%轉染效率的克氏錐蟲快速基因編輯的系統。首先利用SaCas9/eGFP sgRNA復合物對表達綠色熒光的克氏錐蟲進行轉染，7 d即達到超過97%寄生蟲的敲除，且對照組gfp自發損失極小。其中基因敲除效率與gRNA選擇、RNP復合物濃度及電轉次數有關。接著構建具有SaCas9-egfp/gRNA復合物，該復合物大小與SpCas9大致相同且具有Cas9活性，用SaCas9-egfp復合物轉染低于7%，遠低于SaCas9/gRNA復合物轉染效率(大于75%)，證實轉染SgCas9/gRNA復合物無法進行基因敲除與Cas9-RNP較大有關。通過分別轉染不同品系和生活史階段的錐蟲，證實SaCas9/gRNA復合物可轉染錐鞭毛體，轉染不同表型和基因型的蟲株效率相當。單次轉染靶向2個基因的RNP復合物，單敲除效率可高達90%，雙敲除效率為55%。利用含有終止密碼子的修復模板和RNP，可以使galf這類克氏錐蟲必需單基因敲除時完成單等位基因敲除。利用RNP和修復模板分別對NTR和CYP進行敲除，再用對應的抗性藥物處理，發現RNP介導的必須基因敲低可應用于寄生蟲藥物基因的研究。此外，還可以用RNP和攜帶表達標簽(如HA)的修復模板對內源性基因標記，在標記的抗體染色和流式細胞術的配合下不需藥物篩選，快速高效完成內源基因標記。SacCas9/sgRNA復合物可同樣適用于布氏錐蟲和利什曼原蟲的研究。同年，Beneke等[67]報道建立穩定表達Cas9蛋白的布氏錐蟲蟲株，結合PCR擴增產物可用于基因高效快速的編輯。該技術亦可應用于利什曼原蟲反向遺傳學研究：該團隊利用CRISPR/Cas9建立鞭毛突變體文庫[68]，研究利什曼原蟲鞭毛蛋白組功能和真核生物的鞭毛運動。

CRISPR/Cas9基因編輯技術在克氏錐蟲上成功應用，極大加快錐蟲反向遺傳學研究進展。1993年用傳統基因編輯技術成功敲除克氏錐蟲[12]，此后20年僅20篇關于克氏錐蟲的基因編輯報道。自CRISPR/Cas9基因編輯技術成功應用后至今，克氏錐蟲完成基因編輯的基因超過67個[69]。

2.5 利什曼原蟲

Zhang等[18]在2015年利用杜氏利什曼原蟲的rRNA啟動子和肝炎三角洲病毒(HDV)核酶構建gRNA表達載體，與Cas9蛋白轉入杜氏利什曼原蟲中，靶向米替福新(MLF)轉運蛋白(LdMT)。LdMT的兩個等位基因均突變時，寄生蟲表現為MLF耐藥。從MLF耐藥率可以看出，含有HDV核酶的gRNA質粒讓gRNA質粒轉染效率從0.5%增至12%。對轉染后表現MLF耐藥的利什曼原蟲進行測序，發現利什曼原蟲以MMEJ而不是NHEJ途徑修復DSB。對比轉染含有終止密碼子的模板質粒，發現轉染效率提高2～6倍，說明HDR途徑可以顯著改善定點插入的基因編輯能力。用該系統將ble基因定點替換Ldbpk_241510.1基因(一種多藥抗性蛋白樣基因)，博來霉素藥物篩選的陽性蟲株的PCR結果證明該系統可以定點插入外源蛋白和敲除非必需基因。用同樣的方法靶向必需基因TOR1基因時，發現轉染效率較低，并只能破壞其中一個等位基因，說明該系統能部分敲除利什曼原蟲的必需基因。還利用該系統成功在LdMT蛋白的基因位點加上gfp標簽，以精確標記內源性基因。最后，該研究利用錘頭核酶和HDV核酶構建效率更高的雙gRNA表達載體，提高利什曼原蟲基因編輯效率。2017年該團隊優化原有基因編輯技術，構建Cas蛋白和gRNA共表達載體，成功對杜氏利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲及墨西哥利什曼原蟲完成基因編輯，并且利用多靶向gRNA實現對杜氏利什曼原蟲AP2家族的11個基因敲除[70]。

Sollelis等[51]在2015年構建穩定表達Cas9的碩大利什曼原蟲株(命名為M756株)，再向M756株轉入同時包含靶向鞭毛桿2基因pfr2(位于鞭毛桿，屬于非必需基因)的gRNA和作為供體的DHFR-Ts藥篩基因。PCR和FISH檢測結果表明，轉染后的M90株屬于陽性和陰性蟲株混合群體。從M90株篩選的8個克隆種，2個克隆被鑒定為成功轉染的蟲株。為分析CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，接著對2個陽性克隆株進行全基因組測序，軟件評估出的排名前十的潛在脫靶位點的20 nt內均未發現插入缺失標記，證明未出現脫靶現象。

雖然RNAi技術在利什曼原蟲中已有廣泛應用，但CRISPR/Cas9系統亦可作為與之互補的基因編輯工具，二者為不同目的和應用的研究提供重要技術支持。2019年Shrivastava等[71]利用CRISPR/Cas9系統建立LeishIF4E-3(+/-) 突變體，該突變體對巨噬細胞的感染性嚴重降低，且形態發生改變。2021年Baker等[72]用 mNeonGreen 熒光蛋白標記蛋白激酶以進行定位研究，同時建立ePK以及PIKK兩種蛋白激酶突變蟲株，評價蛋白激酶調節寄生蟲的復制、分化等的作用。

2.6 隱孢子蟲

Vinayak等[53]在2015年報道CRISPR/Cas9系統在微小隱孢子蟲的應用，該團隊在2017年提供隱孢子蟲轉基因技術的詳細試驗方法[73]。首先在感染HCT-8細胞體外培養的條件下，利用同源重組將熒光素酶基因(nluc)插入烯醇酶基因(一種持家基因)后，利用熒光強度作為寄生蟲計數指標。向野生蟲株轉染nluc缺陷質粒(在nluc基因中插入終止密碼子)，在轉染靶向nluc缺陷片段的gRNA和一小段DNA雙鏈模板后表達熒光，證實CRISPR/Cas9系統可應用在微小隱孢子蟲的基因編輯研究。為提高轉染效率，選擇氨基糖苷磷酸轉移酶NEO(對巴龍霉素有抗藥性)作為藥篩基因，通過Nluc-Neo融合表達的方式，在巴龍霉素作用下篩選轉染的寄生蟲。通過對比試驗可以發現，同時共轉Nluc-Neo和Cas9質粒的寄生蟲排卵囊量迅速恢復到與無藥野生型組小鼠相似水平，而只轉染Nluc-Neo或nluc的小鼠逐步被巴龍霉素治愈，這說明CRISPR/Cas9系統基因編輯效率高于同源重組。對小鼠傳代后的Nluc-Neo的寄生蟲分別加巴龍霉素進行小鼠體內培養和細胞體外培養，小鼠傳代與野生型蟲株排卵囊量對比，可明顯看出Nluc-Neo蟲株對巴龍霉素耐藥，免疫印跡、IFA和熒光素試驗均證實轉染蟲株是穩定的轉基因蟲株。同時，因為微小隱孢子蟲具有兩條合成dTMP的途徑，其中一條為TK酶利用EdU合成dTMP。因此設計針對tk基因的gRNA和Nluc-Neo作為報告基因的供體模板，對隱孢子蟲的內源性基因tk完成敲除。該報道中還優化電轉程序和緩沖液體系，達到提高10倍電轉效率的效果。此外，該團隊根據基因組測序結果認為隱孢子蟲缺少非同源末端連接的DNA修復途徑，在使用CRISPR/Cas9系統時，必需要提供供體DNA。2020年該團隊在雙環氮雜環丁烷治療隱孢子蟲病的研究中，利用CRISPR/Cas9系統在隱孢子蟲中插入苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(pheRS基因)并使之產生藥物抗性，證實苯丙氨酰-tRNA 合成酶被鑒定為雙環氮雜環丁烷的靶標[74]。同年，Choudhary等[75]報道基于大腸桿菌二氫葉酸還原酶降解結構域 (DDD) 和甲氧芐啶 (TMP)和 CRISPR/Cas9系統建立第一個隱孢子蟲條件性敲降技術，并完成cdpk1基因進行條件性敲除，有助于隱孢子蟲的必需基因功能研究。

2021年Xu等[76]在INS1蛋白功能研究中使用CRISPR/Cas9系統標記或敲除ins1基因，發現INS1蛋白參與大配子體形成或成熟。同年，Hasan等[77]利用CRISPR/Cas9系統對隱孢子蟲耐藥性進行研究。該團隊證實Cp MetRS合成酶發生突變后隱孢子蟲能正常生長并對MetRS抑制劑2093藥物產生抗性。

2.7 其他原蟲

CRISPR/Cas9系統在新孢子蟲(Neosporacaninum)的應用首次報道出現在2018年。Arranz-Solís等[63]首次在犬新孢子蟲利用CRISPR/Cas9系統實現基因編輯，另外Nishikawa等[78]在同年也報道應用CRISPR/Cas9系統進行犬新孢子蟲NcGRA7蛋白的敲除及功能鑒定。前者報道中利用原本用于弓形蟲的質粒系統，成功應用于新孢子蟲研究。該研究一方面設計2個針對Nc-1-GFP表達蟲株中的GFP蛋白的gRNA，實現外源基因的敲除；另一方面針對新孢子蟲的gra7基因設計2個gRNA及相應的供體質粒，完成內源基因gra7的敲除。此外，該團隊證實CRISPR/Cas9系統可應用于犬新孢子蟲的基因編輯。該團隊在2022年報道弓形蟲的生長素誘導條件性降解系統(AID)可在新孢子蟲中成功應用[79]。

2019年Hakimi等[60]利用單個表達 Cas9、gRNA 和供體模板DNA的質粒，成功用于牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)的基因編輯。該團隊用單質粒系統對牛巴貝斯蟲SBP3蛋白末端融合表達myc標簽實現蛋白定位，并在感染巴貝斯蟲的紅細胞表面呈現斑塊狀染色。該報道還設計針對細胞質抗氧化酶過氧還蛋白基因tpx-1實現單質粒的點突變，將49位的過氧化半胱氨酸突變為絲氨酸。另外，該團隊還構建敲除tpx-1基因并替換為gfp基因的蟲株。通過tpx-1的突變株和敲除株與原有的野生型的對比發現，前兩者均表現出對藥物硝普鈉(SNP)敏感的特性。

3 展 望

CRISPR/Cas9系統可以對單基因甚至多基因進行高效、精確和快速的編輯，但在寄生原蟲基因編輯的應用上仍存在部分問題。第一，CRISPR/Cas9系統應用時可能存在脫靶效應，應進一步完善gRNA的設計方法，在試驗過程中注意對潛在脫靶位點的檢查。第二，Cas9蛋白較大，整合到寄生蟲基因組中較為困難，對于寄生蟲穩定表達Cas9蛋白帶來挑戰。第三，Cas9蛋白對寄生蟲有一定毒性，如克氏錐蟲的Cas9蛋白表達株存在生長缺陷[49]，弓形蟲表達的Cas9蛋白自發丟失[34]。可在表達Cas9蛋白的同時加入“陷阱sgRNA”的方式降低毒性[34]，或對Cas9蛋白優化，選擇更高效安全的Cas9蛋白(如金黃色葡萄球菌的Cas9蛋白[10])。第四，與瘧原蟲和弓形蟲相比，隱孢子蟲、球蟲等部分原蟲可用轉基因蟲株篩選的抗性基因較少，限制轉染效率的提高及基因編輯策略的發展。

CRISPR/Cas9系統在基因編輯應用的不到十年里中，已經在生命科學領域占有重要地位。除了高效的單基因編輯、精確的點突變外，在弓形蟲等原蟲中出現利用不同策略實現多基因家族編輯、全基因組編輯篩選的報道，展示CRISPR/Cas9系統功能的多樣性。雖然仍存在上述的問題，但相信通過科研人員的努力，將來CRISPR/Cas9系統可作為高效便捷的遺傳操作工具，可應用在多種寄生性原蟲的基因家族功能研究、全基因組功能分析、數量性狀研究、藥物篩選與耐藥基因研究、表觀遺傳學調控等深入研究之中，并具有應用在往日較難開展反向遺傳學操作的寄生性原蟲中的潛力，可以為原生動物的反向遺傳學、基因功能和疫苗開發等研究提供強有力的技術支持，有望在寄生性原蟲的基礎研究與防控開展上大放異彩。