雞骨骼肌中天然反義lncRNA VGLL2-AS的鑒定及其與VGLL2的關系研究

李文雅，牛欣然，任團輝，蔡含芳，韓瑞麗，田亞東，劉小軍，康相濤，李轉見

(河南農業大學動物科技學院，鄭州 450046)

生物體內在自然狀態下形成的，能夠與其正義鏈RNA互補的轉錄產物叫做自然反義鏈轉錄本(NATs)。以往對NATs的研究結果表明，NATs大多分布在其正義鏈基因的啟動子區域與外顯子區域，既包含了具有編碼功能的mRNA，也包含了非編碼RNA(如lncRNA)，根據轉錄的方向不同，又可以分為cis-NATs和trans-NATs[1]。

早期有研究者認為NATs屬于一種轉錄異常副產物，因而其本身沒有調控任何基因表達的功能[2]，近年來的研究則推翻了這一觀點。研究發現，NATs能通過與其正義鏈轉錄本序列以重疊或互補配對，以此而實現可以在包括轉錄或者轉錄后等多個水平參與到對正義鏈轉錄本基因的表達調控[2-3]。已逐步證實NATs廣泛的存在于人類[4-5]、小鼠[6]、豬[7]、雞[8]等多個常見物種的轉錄組中，暗示著它們可能在參與這些物種的基因表達以及在調控功能等方面具有重要的作用。而與人類和小鼠NATs的研究相比，在家禽中相關的研究相對滯后。

雞的VGLL2基因(vestigial like family member 2,VGLL2)位于3號染色體，在GenBank數據庫中，雞VGLL2 mRNA有4個外顯子，而X1、X2和X3均因內含子3的部分滯留而多形成一個外顯子。在分析的所有脊椎動物物種中，VGLL2表達主要定位在早期胚胎及以后的骨骼肌的體細胞分裂中，這與在C2C12成肌細胞的肌肉分化期間觀察到VGLL2表達的上調相一致[9-10]。這些數據表明，VGLL2在骨骼肌生長發育過程中可能發揮著非常重要的作用，但VGLL2在家禽中的表達和調控還尚不清楚。

本課題組基于前期對6 周齡地方雞(固始雞)和商業肉雞(AA雞)肌肉組織的轉錄組測序(RNA-Seq)鑒定出一個在雞肌肉組織中特異性表達，由VGLL2基因序列逆向轉錄而來的lncRNA，命名為VGLL2-AS(GenBank登錄號: KY126094)，猜測VGLL2-AS可能在雞的肌肉發育中發揮重要作用，但具體機制尚不清楚[11]。為此，本研究對VGLL2-AS的生物學功能展開進一步的探索，以期為NATs調控家禽骨骼肌生長提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用動物均來自于河南農業大學家禽種質資源場，包括11胚齡固始雞胚蛋若干枚、1日齡(1 d)、6周齡(6 W)、16周齡(16 W)、22周齡(22 W)、30周齡(30 W)固始雞各6只。

本試驗所用的核酸染料(DNA Green)以及2×Taq PCR Master Mix分別購自TIANDZ公司和CWBIO公司；試驗用到的DNA Marker，包括Ladder 100 和D2000，分別購自上海萊楓以及北京中科瑞泰生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Trizol、RNA反轉錄試劑盒、SYBR Premix和DH5α感受態細胞均購自日本TaKaRa公司；試驗中用到的有機溶劑包括無水乙醇、三氯甲烷等均購自天津市富宇精細化工有限公司；PBS、PRMI-1640細胞培養基和質粒小提試劑盒購自Promega公司；細胞培養試驗中用到的細胞消化液(0.25% EDTA)、青鏈霉素混合液和胎牛血清(FBS)購自于Gibco公司；放線菌素D和PARISTM Kit分別購自于Sigma和Invitrogen公司。

1.2 引物設計

根據NCBI在線網站所提供的基因序列，利用NCBI在線設計引物網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Sangon Biotech公司分別設計和合成表1所示的引物序列。

表1 本研究所使用的引物Table 1 The primers used in this study

1.3 RNA抽提、反轉錄和實時熒光定量PCR

利用組織(細胞)裂解液Trizol來提取不同時期固始雞不同組織樣品(包括肺、心、腎、肝、皮脂、腹脂、腿肌、胸肌和下丘腦)或者細胞樣品的RNA，按照反轉錄試劑盒使用說明書對質量合格的RNA進行反轉錄，以反轉錄而來的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)，具體操作及分析參考任團輝[11]的方法。

1.4 RT-PCR驗證VGLL2-AS與VGLL2基因的雙向轉錄

分別以VGLL2的正義鏈第3個外顯子設計引物GF1和GR1，以VGLL2-AS的反義鏈第1個外顯子設計引物DL-F和DL-R，GAPDH作為內參基因。引物序列見表1。

用于特異基因逆轉錄cDNA的合成步驟如下：以固始雞胸肌總RNA(1 μg)為模板，去除模板中的基因組DNA污染后，于反轉錄反應中分別以DL-R和GAPDH-R或GR1和GAPDH-R特異引物進行反轉錄，得到的鏈特異cDNA為接下來Touchdown PCR擴增的模板。反應體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、ddH2O 3 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL。反應程序為： 95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，退火65 ℃～50 ℃(-1 ℃/cycle) 30 s，72 ℃ 40 s；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，分別為15和26個循環。擴增所得產物于核酸染料預染的1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳(120 V，110 mA，30 min)，最后在凝膠成像系統下成像。

1.5 細胞培養

雞原代成肌細胞的分離和培養詳見戴巍等[12]的研究。

1.6 核酸酶保護試驗

向固始雞胸肌總RNA(1 μg)中加入2 μL DNase Ⅰ和1 μL RNase A以消除基因組的DNA及單鏈RNA，用反轉錄試劑盒將消化產物反轉錄，反轉錄產物作為模板進行下一步的PCR檢測。反應體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、ddH2O 3 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，反應條件同RT-qPCR。

1.7 放線菌素D添加試驗分析VGLL2-AS與VGLL2半衰期

將雞原代成肌細胞接種至12孔板中，待其細胞匯合度達到70%左右時，收取3個孔的細胞培養品，設置為0 h樣品；將最終濃度為2 μg·mL-1的放線菌素D加入細胞中，之后每1 h收集3個孔細胞樣品，提取細胞RNA后檢測靶基因的表達。

1.8 雞原代成肌細胞VGLL2和 VGLL2-AS 亞細胞定位

雞成肌細胞細胞核與細胞質的分離使用PARISTM Kit試劑盒進行，細胞質和細胞核的內參基因分別為GAPDH和U6基因，通過RT-qPCR方法檢測成肌細胞中VGLL2-AS和VGLL2基因的表達，進而確定兩者的細胞定位。

1.9 統計分析與作圖

本試驗采用相對定量2-ΔΔCt計算方法對所得qRT-PCR的原始數據進行分析，以2-ΔΔCt值來代表不同基因在不同樣品中的相對表達水平。2-ΔΔCt方法具體計算過程如下：

ΔCt= Ct(目的基因)-Ct(內參基因)；

ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(對照組均值)；

目的基因在某一樣品中的相對表達量=2-ΔΔCt。

本研究所有的定量數據均是通過羅氏實時熒光定量軟件LightCycler 96進行收集，再經Excel等軟件進行整理；用SPSS 20.0對整理后的數據進行顯著性分析，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，多重比較采用新復極差法(SSR)，設置顯著性水平為0.05。最后用作圖軟件GraphPad Prism 6進行制圖，數據表示的形式為“平均值±標準差”[10]。

2 結 果

2.1 雞肌肉組織中VGLL2-AS的驗證

為了驗證VGLL2-AS是否真實存在，在VGLL2-AS的特異區(與VGLL2相比，VGLL2-AS缺少第3外顯子，故選取VGLL2-AS跨第2外顯子與第4外顯子區域作為VGLL2-AS特異區)設計引物F1/R1并進行PCR擴增和測序檢測。結果如圖1所示，特異區PCR產物測序結果與目的基因VGLL2-AS序列完全一致，證明VGLL2-AS在雞的轉錄組中真實存在。

A. VGLL2-AS的瓊脂糖凝膠電泳圖；B. VGLL2-AS的測序圖A. Agarose gel electrophoresis of VGLL2-AS; B. DNA sequencing map of VGLL2-AS圖1 VGLL2-AS的驗證Fig.1 Verification of VGLL2-AS

2.2 VGLL2與VGLL2-AS均在肌肉中特異表達

為了驗證VGLL2與VGLL2-AS是否在肌肉中高表達，qRT-PCR檢測VGLL2與VGLL2-AS在固始雞不同時期的肺、心、腎、肝、皮脂、腹脂、腿肌、胸肌和下丘腦組織之間的表達差異。結果如圖2所示，可以看出VGLL2與VGLL2-AS表達趨勢一致，即均在肌肉組織中特異高表達，而在其余組織中幾乎不表達。且在6 w和16 w肌肉組織中的表達量與1 d相比，表達量均顯著降低(P<0.05)，說明VGLL2和VGLL2-AS參與了雞的肌肉發育進程。

A. VGLL2時空表達譜；B. VGLL2-AS的時空表達譜。經單因素方差分析檢驗，*表示差異顯著(P<0.05)A. The spatio-temporal expression pattern of VGLL2; B. The spatio-temporal expression pattern of VGLL2-AS. Tested by one-way analysis of variance, * means significant difference(P<0.05)圖2 VGLL2與VGLL2-AS的表達規律Fig.2 Expression patterns of VGLL2 and VGLL2-AS

2.3 VGLL2-AS與VGLL2可以進行雙向轉錄

為了驗證VGLL2-AS與VGLL2是否可以進行雙向轉錄，通過設計特異引物，以胸肌cDNA進行Touchdown PCR檢測。結果如圖3所示，VGLL2和VGLL2-AS都可以擴增出目的條帶，表明VGLL2-AS與VGLL2均可以進行雙向轉錄。

圖3 鏈特異引物鑒定雞VGLL2-AS與VGLL2雙向轉錄Fig.3 Identification of bidirectional transcription of chicken VGLL2-AS and VGLL2 by strand specific primers

2.4 VGLL2-AS與VGLL2可以形成雙鏈RNA

為了探究VGLL2-AS的作用機制，利用核酸酶保護試驗在VGLL2-AS與VGLL2的重疊區(第二外顯子)設計了引物F2/R2(圖4A)，之后擴增重疊區的目的片段以檢測VGLL2-AS與VGLL2之間是否形成了RNA二聚體。如圖4B所示，可以看到在F2與R2之間可以擴增到大小132 bp的目的片段，證明VGLL2-AS與VGLL2間形成了RNA二聚體。

A. VGLL2和VGLL2-AS之間重疊和非重疊區域的引物示意圖；B. 消化產物擴增的瓊脂糖凝膠電泳A. Schematic illustration of primers in overlapping and non-overlapping region between VGLL2 and VGLL2-AS; B. Agarose gel electrophoresis of amplification of digestion products圖4 核酸酶保護試驗Fig.4 Ribonuclease protection assay

2.5 VGLL2-AS與VGLL2的半衰期檢測

既然VGLL2-AS與VGLL2可以形成 RNA雙鏈，而兩者之間形成的雙鏈是否可以增加其在雞原代成肌細胞增殖過程中的穩定性還不可知。為此，本研究進行了放線菌素D處理成肌細胞試驗。結果如圖5所示，與VGLL2的2 h左右的半衰期相比較，VGLL2-AS的半衰期可以達到5 h左右，表明VGLL2-AS半衰期較VGLL2長，證明其穩定性高于VGLL2基因。

A. VGLL2半衰期檢測; B. VGLL2-AS半衰期檢測A. The stability assay of VGLL2; B. The stability assay of VGLL2-AS圖5 VGLL2和VGLL2-AS的半衰期檢測Fig.5 The stability assay of VGLL2 and VGLL2-AS

2.6 VGLL2及其反義鏈轉錄本VGLL2-AS亞細胞定位

為了更進一步探究VGLL2-AS的作用機制，對VGLL2-AS和VGLL2進行亞細胞定位。分離的RNA產物用GAPDH(細胞質內參基因)和U6(細胞核內參基因)進行RT-qPCR檢測，確定核質分離是否成功。如圖6所示，VGLL2-AS和VGLL2基因都主要表達于細胞質中，說明在成肌細胞中，VGLL2-AS和VGLL2主要定位于雞成肌細胞的細胞質中。

GAPDH和U6分別為細胞質和細胞核內參基因。經單因素方差分析檢驗，***表示差異極顯著(P<0.001)GAPDH and U6 are cytoplasmic and nuclear reference genes, respectively. Tested by one-way analysis of variance, *** means extremely significant difference (P<0.001)圖6 雞原代成肌細胞中VGLL2-AS與VGLL2亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of hepatic VGLL2-AS and VGLL2

2.7 VGLL2-AS與VGLL2各轉錄本結構分析

利用NCBI在線網站查詢VGLL2基因發現，VGLL2具有4個轉錄本，分別為：VGLL2-mRNA、VGLL2-X1、VGLL2-X2和VGLL2-X3。為了闡明VGLL2-AS與VGLL2各轉錄本的異同，首先利用PCR擴增及單克隆測序對VGLL2的轉錄本進行驗證。如圖7所示，利用VGLL2各轉錄本的共有引物VBF和VBR進行擴增后發現胸肌組織中VGLL2實際不存在VGLL2-X1轉錄本，只存在VGLL2-mRNA、VGLL2-X2和VGLL2-X3轉錄本。

圖7 VGLL2不同轉錄本的凝膠電泳Fig.7 The agarose gel electrophoresis of VGLL2 transcripts

通過NCBI和USCS(http://genome.ucsc.edu/)數據庫以及驗證得到的各轉錄本序列信息，對VGLL2各轉錄本序列進行分析。結果如圖8所示，VGLL2-X2和VGLL2-X3均含有5個外顯子，而VGLL2-mRNA和VGLL2-AS分別含有4個和3個外顯子；觀察各個轉錄本之間的序列信息發現，與VGLL2的3種形式轉錄本相比，VGLL2-AS缺少外顯子E3；此外，相比于VGLL2-X2和VGLL2-X3轉錄本，VGLL2-AS缺少VGLL2-X2的外顯子I3a和VGLL2-X3的外顯子I3b。

雙斜線代表起始和終止密碼子The double diagonal represents the initial and terminal codons圖8 VGLL2-AS與VGLL2各剪切體結構分析Fig.8 Schematic comparison of transcripts of the VGLL2-AS and VGLL2 genes

2.8 VGLL2-AS與VGLL2在胸肌中的時序表達特征

前面的試驗證明VGLL2-AS與VGLL2都在肌肉組織中高表達，但兩者之間的相關性尚不清楚。為此，本研究利用RT-qPCR檢測了它們在固始雞胸肌組織中的時空表達規律(由于VGLL2-X2的表達量在各個組織中均較低且在其序列中沒有找到合適的引物進行檢測，因此本試驗中只對VGLL2-mRNA和VGLL2-X3進行了檢測)。結果如圖9所示，VGLL2-mRNA和VGLL2-X3與VGLL2-AS表達趨勢一致，且VGLL2-mRNA、VGLL2-X3和VGLL2-AS的表達呈現極強的正相關(r分別為0.943和0.935)，且差異極顯著(P<0.01)。

圖9 VGLL2-AS和VGLL2-mRNA (A)、VGLL2-X3 (B)在胸肌中的表達Fig.9 Expression patterns of VGLL2-AS, VGLL2-mRNA (A) and VGLL2-X3 (B) in breast muscle

3 討 論

NATs可以直接與其正義鏈轉錄本相互作用，通過轉錄和表觀遺傳學水平來調節正義鏈基因表達，從而參與到各種生物學過程，對生物體的生長發育具有重要意義[13-16]。目前，在哺乳動物中關于NATs與其正義鏈轉錄本之間的研究較多，如DHRS4-AS[17]、p15AS[18]，而在家禽中的相關研究較少，如bFGF[19]、IGF-II[20]、Collagen[21]和Pdcd2[22]。因此，對NATs在家禽肌肉發育過程中的調控作用進行解析，既能補充lncRNAs在動物肌肉中的調控作用理論，又能為雞肌肉發育和開發家禽的分子標記提供理論基礎。

研究報道，半衰期可以衡量NATs的穩定性[23-24]。此外，與正義鏈轉錄本相比，大部分NATs的半衰期更長，這也意味著大多數NATs的穩定性更高，表明NATs有可能比其正義鏈轉錄本承擔著更多的生物學功能[25-26]，而VGLL2-AS半衰期較VGLL2長，證明其穩定性高于VGLL2基因。同時，lncRNAs的功能與所處的細胞定位相關，而不同細胞定位的lncRNAs發揮的調節機制也不一樣。根據細胞定位，lncRNAs又可分類為細胞質lncRNAs以及細胞核lncRNAs[27-30]。研究發現，大多數存在于細胞質中的lncRNAs可以通過與雙鏈RNA之間的相互作用，進而參與到對mRNA穩定性和表達的調節。例如，主要存在于細胞質中的lncRNA MD1可以通過ceRNA的調控機制從而參與骨骼肌的分化進程[31]。而位于細胞核內的lncRNAs可能通過與靶基因的結合從而激活或者抑制靶基因表達，除此之外，還可能通過參與表觀調控作用介導基因表達的調節[11, 32-34]。此外，已有研究表明，位于細胞核內的lncRNAs比細胞質中的lncRNAs的穩定性弱[35]。VGLL2-AS主要表達于雞原代成肌細胞的細胞質中，暗示VGLL2-AS可能通過轉錄水平以及轉錄后水平來調控VGLL2。

基因的可變剪切能夠改變轉錄本的結構和其編碼的蛋白，同時也可以使基因產生多種結構不同的mRNA以及多肽序列，是基因表達多樣性的一種重要的表現形式[36-39]。反義lncRNAs可以通過與其正義鏈轉錄本形成雙鏈RNA以覆蓋其順式元件，從而直接調節前體mRNA的可變剪切。例如，NATs Zeb2補充了其正義鏈轉錄本的剪接位點，并導致其內含子的滯留，最終促進Zeb2的表達以及翻譯[40]。內含子滯留是基因形成不同剪切體的方式之一，而分析VGLL2不同的剪切體信息，推測可能是VGLL2-AS與VGLL2通過堿基互補配對形成雙鏈RNA，造成了VGLL2的內含子滯留，使之產生了3種剪切體，但VGLL2-AS是否影響VGLL2基因的可變剪切，仍待進一步的研究。

轉錄起始點之間的距離在1 kb堿基范圍內的相鄰的兩個轉錄方向相反的基因被稱為雙向轉錄基因對，原核生物和真核生物的基因組中都存在雙向轉錄基因，它們的表達大多是正相關的，并且在進化上保守[41-42]。VGLL2-AS和VGLL2-mRNA、VGLL2-X3在不同時期的胸肌組織中的表達具有很強的正相關，這與前期證明VGLL2-AS與VGLL2可以雙向轉錄的結果一致。而VGLL2-AS的表達水平隨著胸肌的發育而下調，這個基因是否負向調控肌肉發育，或者只在肌肉發育前期起作用有待進一步解析。

4 結 論

綜上所述，VGLL2-AS作為VGLL2反義鏈編碼的lncRNA定位于細胞質中，可能通過與VGLL2形成的雙鏈RNA之間的相互作用，然后參與調節VGLL2的表達并維持其穩定性，最終在雞的早期肌肉發育中發揮重要作用。本研究的結果擴展了雞中關于NATs的研究，并為雞VGLL2基因與其天然反義鏈轉錄本VGLL2-AS在雞骨骼肌發育中的生物學功能奠定了基礎，對于提高禽類的生長性能具有一定的意義。