奶牛NR1D1基因的真核表達載體構建、表達譜及其在卵巢組織的定位

王逸群，劉祖培，李雅婷,2，張海森,2，李 丹，靳亞平,2，陳華濤,2*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.西北農林科技大學 農業農村部動物生物技術重點實驗室，楊凌 712100)

地球的自轉帶來了光照、溫度等外界環境因素的晝夜節律性變化，生物體為預測并適應這些外界環境因素的節律性變化，在漫長的進化過程中逐漸形成了一套內源性的自主調控系統，稱為生物鐘[1]。生物鐘廣泛存在于動物、植物、細菌以及真菌等地球上的大部分生命體中，是機體晝夜節律產生的分子基礎[2-3]。哺乳動物生物鐘是一個完整的層級控制系統，位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中樞生物鐘接收并整合視網膜下丘腦束傳遞的周期性光線信號的明暗變化，通過神經與體液途徑將時間信息傳遞至肝、肺、肌肉、卵巢與睪丸等組織器官，從而協調同步化大量的外周生物鐘，共同維持機體生理穩態[4-6]。

在哺乳動物體內，幾乎所有的細胞都存在自主維持的晝夜節律振蕩器，即由多個生物鐘基因及其編碼蛋白相互作用構成的轉錄-翻譯反饋環路[7]。核受體NR1D1是晝夜節律生物鐘系統的重要組分，由于該蛋白缺乏對配體依賴性共激活因子募集和核受體轉錄激活至關重要的C端螺旋結構，因此主要表現出轉錄抑制作用[8-10]。近年來應用基因組學、生化以及藥理學技術的眾多研究證據表明，NR1D1在晝夜節律以及肝、胰腺、卵巢與睪丸等組織正常生理功能的穩態維持過程中發揮至關重要的作用[11-15]。

目前，對于哺乳動物生物鐘系統的研究多以嚙齒類動物為模型，關于反芻動物NR1D1基因生物學功能的研究則相對較少。在前期的研究中，人們發現環境因素(光照、溫度等)與飼養方式(飼糧配比、限制性飼喂等)的改變能夠通過反芻動物的生物鐘系統影響其生產性能[16-21]。然而，目前人們對反芻動物生物鐘系統分子基礎的認識相對有限，深入探究反芻動物生物鐘基因的生物學功能，或可為人們尋找提高反芻動物生產性能的新方法和新靶點提供思路。

基于前期研究基礎，本試驗旨在克隆奶牛NR1D1基因的蛋白編碼序列(coding sequence，CDS)，構建該基因的真核表達載體，同時使用生物信息學軟件對該基因編碼蛋白的理化特性進行初步的預測和分析，并利用qPCR及免疫組織化學技術(IHC)檢測NR1D1基因在奶牛不同組織的表達譜，以期為深入探究奶牛NR1D1基因的生物學功能提供前期基礎和關鍵材料。

1 材料與方法

1.1 組織與細胞

5頭成年(24月齡)健康雌性奶牛的心、肝、脾、肺、瘤胃、結腸、小腸、胰腺、肌肉及皮下脂肪、卵巢組織采自陜西省咸陽市某屠宰場，DH5α感受態細胞購自北京天根生化科技有限公司，HEK293T細胞由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

1.2 主要試劑

Trizol、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、QuickCutBamH Ⅰ均購自日本TaKaRa公司，FSQ-301反轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，DNase/RNase-Free Water購自北京索萊寶科技有限公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit、SYBR qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，無內毒素質粒小提中量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，Turbofect轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司，Anti-HA tag Antibody、Anti-NR1D1 Antibody均購自美國Abcam公司，多聚甲醛固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中的基因序列信息，在線設計可擴增奶牛NR1D1基因CDS區全長的PCR引物、可同時擴增奶牛與人NR1D1基因的實時熒光定量PCR(qPCR)引物；并設計擴增人、奶牛GAPDH基因與奶牛RPLP0基因的qPCR內參引物，引物序列信息見表1(小寫字母表示同源臂，下劃線部分表示BamH Ⅰ的酶切位點)。引物均由西安擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences information

1.4 奶牛NR1D1基因真核表達載體構建及鑒定

1.4.1 PCR擴增奶牛NR1D1基因的CDS區 使用Trizol法提取奶牛肝組織的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，使用帶有同源臂的引物進行PCR反應，反應體系50 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，cDNA模板(50 ng·μL-1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 19 μL。反應程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸56 s，共35個循環；72 ℃終延伸2 min。

1.4.2 同源重組法構建奶牛NR1D1基因真核表達載體 使用限制性內切酶BamH Ⅰ對pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體進行單酶切使其線性化，按照ClonExpress Ⅱ試劑盒說明書配制同源重組反應體系，37 ℃反應30 min后立即置于冰上冷卻。重組產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布至含羧芐青霉素的LB固體培養基37 ℃過夜培養后，挑取單克隆菌落接種至含有羧芐青霉素的LB液體培養基，37 ℃ 200 r·min-1搖床培養12 h后，使用無內毒素質粒小提中量試劑盒提取質粒。

1.4.3NR1D1基因真核表達載體的鑒定 使用限制性內切酶BamH Ⅰ對獲得的重組質粒進行單酶切，同時使用空載體作為對照；以重組質粒為模板，使用NR1D1基因CDS區擴增引物進行PCR反應。酶切及PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將結果符合預期的樣本送至西安擎科生物科技有限公司測序，比較插入片段序列與NCBI數據庫中奶牛NR1D1基因序列是否一致。

1.5 奶牛NR1D1基因序列及其編碼蛋白的生物信息學分析

在NCBI中查找不同物種NR1D1基因序列(表2)，結合測序結果，利用MegAlign軟件分析各物種間NR1D1基因CDS區的同源性，并利用MEGA7軟件構建系統進化樹；利用在線軟件分析預測奶牛NR1D1蛋白性質及生物學功能，在線軟件及網址見表3。

表2 各物種NR1D1基因CDS序列來源Table 2 The sources of NR1D1 gene’s CDS in each species

表3 所用生物信息學在線軟件Table 3 Bioinformatics online softwares

1.6 檢測奶牛NR1D1基因在HEK293T細胞的過表達

1.6.1 細胞培養與轉染 復蘇HEK293T細胞并傳代，待細胞長滿60 mm培養皿后，將其消化傳代至兩個6孔板中繼續培養，細胞密度達到60%以上時，每個6孔板分別轉染pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重組質粒(過表達組)及pcDNA3.1-Puro-N-3HA空質粒(對照組)各3孔，培養24 h后，收取一個6孔板中的細胞樣品，用于檢測NR1D1基因在mRNA水平的過表達效果；培養48 h后，收取另一6孔板中的細胞樣品，用于檢測NR1D1蛋白的過表達效果。

1.6.2 實時熒光定量PCR檢測奶牛NR1D1基因在mRNA水平的表達 提取對照組和過表達組細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA作為qPCR反應的模板。20 μL反應體系：2×ChemQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板(2.5 ng·μL-1)5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ddH2O 4.2 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火與延伸30 s，40個循環；熔解曲線95 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s，后以每秒0.2 ℃升溫至97 ℃，采集熔解曲線熒光信號。

1.6.3 Western blotting檢測奶牛NR1D1蛋白的表達水平 提取對照組和過表達組細胞的總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為15 μg；將35～100 ku區域的蛋白轉印至硝酸纖維素(PVDF)膜，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后洗膜(TBST溶液洗膜3次，每次10 min，下同)；根據目的蛋白大小將PVDF膜剪開，分別置于一抗(兔抗HA多克隆抗體、兔抗NR1D1單克隆抗體、兔抗β-Actin單克隆抗體)中，4 ℃孵育過夜，洗膜；將PVDF膜轉移至二抗(HRP共扼羊抗兔抗體)，室溫孵育1 h，洗膜；將PVDF膜置于暗室，均勻滴加適量ECL發光液，進行曝光。

1.7 qPCR檢測NR1D1基因在奶牛不同組織的表達譜

分別稱取20 mg奶牛的不同組織，加入1 mL Trizol，使用組織勻漿器將其研磨至勻漿，Trizol法提取總RNA，反轉錄合成cDNA作為模板，以奶牛GAPDH、RPLP0基因為內參，qPCR檢測奶牛NR1D1基因在不同組織的表達情況。qPCR反應體系與反應程序同“1.6.2”。

1.8 IHC檢測NR1D1蛋白在奶牛卵巢組織的分布

將固定后的奶牛卵巢組織修整為2 cm×0.5 cm×2 cm左右的小塊，注意保持較大黃體及卵泡結構的完整性。將修整后的組織塊置于梯度乙醇溶液中脫水，脫水后置于二甲苯中透明，隨后將組織浸蠟、包埋，制作石蠟切片。取奶牛卵巢組織石蠟切片，使用二甲苯將石蠟切片充分脫蠟，依次經梯度乙醇水化后，將石蠟切片放入檸檬酸抗原修復液中，使用微波爐高火加熱至沸騰后，中火繼續加熱20 min，進行抗原修復，待完全冷卻至室溫后，PBS清洗(每次5 min，共計4次)，用油筆在組織周圍3 mm處畫圈。按照免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒說明書對抗原修復后的切片進行免疫組織化學染色，使用光學顯微鏡觀察NR1D1在卵巢不同發育階段卵泡中的表達分布情況并拍照保存[22]。

1.9 數據統計分析

采用2-ΔΔCt法將qPCR中的Ct值轉化為基因相對表達量，利用GraphPad Prism 6分析定量數據。進行非配對t檢驗，比較對照組與過表達組HEK293T細胞中NR1D1 mRNA表達水平的差異性；進行單因素方差分析，以比較奶牛不同組織中NR1D1 mRNA表達水平的差異性。P< 0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 奶牛NR1D1基因CDS區全長序列的獲取

對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，奶牛NR1D1基因CDS區PCR擴增產物在接近2 000 bp處有一清晰、明亮的條帶，且條帶大小與預期一致(奶牛NR1D1基因CDS區全長序列1 842 bp，同源臂42 bp)，說明成功獲得奶牛NR1D1基因CDS區全長片段。

M. 5 000 bp DNA相對分子質量標準；1.NR1D1基因CDS區全長的PCR擴增產物M. 5 000 bp DNA marker; 1. PCR amplification product of NR1D1 gene’s full-length CDS region圖1 奶牛NR1D1基因CDS區全長PCR擴增產物的鑒定結果Fig.1 Identification results of the PCR amplification products of the cow NR1D1 gene’s full-length CDS region

2.2 奶牛NR1D1基因真核表達載體的構建

重組質粒單酶切及PCR鑒定產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，重組質粒單酶切后，分別在預期的位置出現2個條帶(5 211 bp和1 842 bp)，條帶大小與空質粒單酶切條帶及重組質粒PCR擴增產物條帶大小一致。測序結果顯示，重組質粒中插入片段序列與NCBI數據庫中牛NR1D1基因CDS區序列完全一致，表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重組質粒構建成功。

M. 10 000 bp DNA相對分子質量標準；1.空質粒單酶切產物；2.重組質粒單酶切產物；3.重組質粒PCR擴增產物M. 10 000 bp DNA marker; 1. Single digestion product of empty plasmid; 2. Single digestion product of recombinant plasmid; 3. PCR amplification product of recombinant plasmid圖2 奶牛NR1D1基因真核表達載體酶切及PCR鑒定Fig.2 Enzyme digestion and PCR identification of cow NR1D1 gene’s eukaryotic expression vector

2.3 奶牛NR1D1基因CDS區序列分析

對不同物種NR1D1基因CDS區進行同源性比對，結果如圖3所示，NR1D1基因CDS區在反芻動物間高度保守，同源性在97%以上，且牛NR1D1基因CDS區與豬、馬、大鼠、小鼠、人的同源性超過85%，說明哺乳動物NR1D1基因CDS區總體較為保守。根據同源性比對結果構建系統進化樹，結果如圖4所示，牛NR1D1基因CDS區與山羊、綿羊遺傳距離最近，與斑馬魚的遺傳距離最遠。

圖3 不同物種NR1D1基因CDS區同源性比對Fig.3 Homology comparison of NR1D1 gene’s CDS region in different species

圖4 奶牛NR1D1基因CDS區系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the cow NR1D1 gene’s CDS region

2.4 奶牛NR1D1蛋白理化性質與功能預測分析

2.4.1 奶牛NR1D1蛋白的基本理化性質 利用ProtParam預測奶牛NR1D1蛋白的基本理化性質，結果顯示，NR1D1蛋白共包含613個氨基酸，分子量為67 ku，理論等電點為8.75。利用ProtScale預測NR1D1蛋白親水性，結果如圖5所示，NR1D1蛋白第212位氨基酸分值最低(-2.822)，表明該位點親水性最強；第541位氨基酸分值最高(2.633)，表明該位點疏水性最強。且NR1D1蛋白總平均親水性(GRAVY)為-0.494，多數氨基酸表現出親水性，說明奶牛NR1D1蛋白為親水性蛋白。

圖5 奶牛NR1D1蛋白親水性預測Fig.5 Hydrophilic prediction of cow NR1D1 protein

2.4.2 奶牛NR1D1蛋白跨膜結構及亞細胞定位分析 應用DeepTMHMM對奶牛NR1D1蛋白跨膜結構進行預測，結果如圖6A所示，奶牛NR1D1蛋白為胞內蛋白，不含跨膜區。應用DeepLoc-1.0預測奶牛NR1D1蛋白的亞細胞定位，結果如圖6B顯示，奶牛NR1D1蛋白定位于細胞核中，其核定位序列位于第200位氨基酸附近。

A. NR1D1蛋白跨膜結構預測；B. NR1D1蛋白核定位序列預測A. Prediction of NR1D1’s transmembrane structure; B. Prediction of NR1D1’s nuclear localization sequence圖6 奶牛NR1D1蛋白跨膜結構及核定位序列分析Fig.6 Transmembrane structure and nuclear localization sequence analysis of cow NR1D1

2.4.3 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點預測 應用NetPhos-3.1軟件預測奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點，結果如圖7所示，奶牛NR1D1蛋白共存在86個潛在的磷酸化位點，其中包含63個絲氨酸位點、18個蘇氨酸位點以及5個酪氨酸位點。

圖中紅色表示絲氨酸位點；綠色表示蘇氨酸位點；藍色表示酪氨酸位點；紫色表示閾值In this figure, red stands for serine; green stands for threonine; blue stands for tyrosine; purple stands for threshold圖7 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of cow NR1D1 protein

2.4.4 奶牛NR1D1蛋白結構預測 利用SOPMA預測奶牛NR1D1蛋白的二級結構，結果如圖8A所示，奶牛NR1D1蛋白二級結構主要由無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉角組成，占比依次為55.30%、25.77%、13.05%和5.87%。利用SWISS-MODEL對奶牛NR1D1蛋白三級結構進行預測，并用PyMOL軟件比較奶牛、山羊、小鼠NR1D1蛋白三級結構的相似性，結果如圖8B所示，奶牛與山羊NR1D1蛋白間的原子均方根差(RMSD)為1.576，奶牛與小鼠NR1D1蛋白間RMSD為1.933，說明奶牛NR1D1蛋白三級結構與山羊、小鼠較為相似。

A. 奶牛NR1D1蛋白二級結構預測，圖中藍色表示α-螺旋，紅色表示延伸鏈，綠色表示β-轉角，紫色表示無規則卷曲；B. 奶牛(a)、山羊(b)、小鼠(c)NR1D1蛋白三級結構預測，圖中藍色表示α-螺旋，紅色表示β-折疊，紫色表示無規則卷曲A. Prediction of the secondary structure of cow NR1D1 protein, blue represents α-helix, red represents extended strand, green represents β-turn, and purple represents random coil; B. Predicted tertiary structure of NR1D1 protein in cow (a), goat (b) and mouse (c), blue represents α-helix, red represents β-sheet, and purple represents random coil圖8 奶牛NR1D1蛋白三級結構預測及比較Fig.8 Prediction and comparison of the tertiary structure of cow NR1D1 protein

2.4.5 奶牛NR1D1蛋白互作與功能分析 使用STRING對奶牛NR1D1蛋白互作進行預測分析，結果如圖9所示，與NR1D1發生互作的前10位蛋白包括芳香烴受體核轉位因子樣蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1，ARNTL)、時鐘晝夜節律調節蛋白(circadian locomotor output cycles kaput protein，CLOCK)、隱花色素晝夜節律調節蛋白2(cryptochrome circadian clock 2，CRY2)、神經元PAS結構域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2，NPAS2)、基本螺旋-環-螺旋家族成員e41(basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41)、熱休克轉錄因子2(heat shock transcription factor 2，HSF2)、磷脂酶C-β2(phospholipase C-β2，PLCB2)、核受體輔抑制因子1(nuclear receptor co-repressor 1，NCOR1)、含金屬β內酰胺酶結構域蛋白1(metallo-β-lactamase domain-containing protein 1，MBLAC1)與RAS激活劑樣蛋白3(RAS protein activator-like 3，RASAL3)。功能預測分析結果顯示，NR1D1能夠直接抑制核心生物鐘組分ARNTL(BMAL1)、CLOCK和CRY2的表達，負反饋調節晝夜節律生物鐘系統；此外，其還與脂質和膽汁酸代謝、脂肪生成、糖異生和巨噬細胞炎癥反應等生理過程密切相關；在細胞層面，NR1D1可能參與氧化還原狀態應答、類固醇激素受體及糖皮質激素受體信號通路的負反饋調節等過程。

圖9 奶牛NR1D1蛋白互作預測Fig.9 Prediction of cow NR1D1 protein’s interaction

2.5 奶牛NR1D1基因在HEK293T細胞中的過表達

重組質粒轉染HEK293T細胞后，奶牛NR1D1基因在mRNA和蛋白水平的過表達效果如圖10所示，與對照組相比，重組質粒轉染組奶牛NR1D1 mRNA表達水平升高約2 000倍(P< 0.01)；應用HA及NR1D1抗體進行Western blotting檢測，結果顯示重組質粒轉染組的奶牛NR1D1蛋白相對于對照組有顯著的過表達。

A. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1轉染后mRNA相對表達量，**P<0.01表示差異極顯著；B. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1轉染后NR1D1蛋白的表達，M表示蛋白分子量標準；CON. 空質粒轉染對照組；OVE. 重組質粒轉染組A. Relative mRNA expression after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, **P<0.01 indicates a very significant difference; B. Expression level of NR1D1 protein after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, M denotes protein molecular weight standard; CON. Control group transfected empty plasmid; OVE. Test group transfected recombinant plasmid圖10 奶牛NR1D1基因在HEK293T細胞的過表達Fig.10 Overexpression of cow NR1D1 gene in HEK293T cells

2.6 NR1D1基因在奶牛不同組織的表達譜

如圖11所示，NR1D1基因在奶牛不同組織中的mRNA表達豐度存在顯著性差異(P<0.05),奶牛NR1D1基因在瘤胃、結腸與肝中表達量較高，在小腸、胰腺、皮下脂肪與肌肉中表達量較低。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)In each set of bars, different letters mean significant difference (P<0.05)圖11 奶牛NR1D1基因mRNA在不同組織的表達豐度Fig.11 Expression abundance of cow NR1D1 gene’s mRNA in different tissues

2.7 NR1D1蛋白在奶牛卵巢組織的表達分布

如圖12所示，NR1D1表達于不同發育時期卵泡的顆粒細胞中，且該蛋白主要表達分布于細胞核內。

A.初級卵泡(400×，NR1D1抗體)；B.次級卵泡(200×，NR1D1抗體)；C.卵丘-卵母細胞(200×，NR1D1抗體)；D.顆粒細胞(200×，NR1D1抗體)；E.卵丘-卵母細胞(200×，陰性對照)；F.顆粒細胞(200×，陰性對照)A. Primary follicle (400×, Anti-NR1D1); B. Secondary follicle (200×, Anti-NR1D1); C. Cumulus-oocyte (200×, Anti-NR1D1); D. Granulosa cells (200×, Anti-NR1D1); E. Cumulus-oocyte (200×, negative control); F. Granulosa cells (200×, negative control)圖12 NR1D1在奶牛卵巢組織的表達分布Fig.12 The distribution of NR1D1 in dairy cow’s ovary

3 討 論

近年來在嚙齒類動物中的研究發現，NR1D1不僅是哺乳動物生物鐘系統的重要組分，同時也參與調控生殖、代謝與免疫等多個重要生理過程，但奶牛NR1D1基因的功能還未被深入研究。本課題組前期已成功構建了多個山羊生物鐘基因的真核表達載體，并以此為材料探究了生物鐘基因BMAL1對山羊睪丸間質細胞睪酮合成的調控作用[23-25]。BMAL1基因在山羊睪丸間質細胞過表達后，上調類固醇激素合成關鍵基因StAR和HSD17B3在mRNA及蛋白水平的表達，睪酮合成增加。此外，本課題組利用pcDNA3.1-gRORα載體在HEK293T細胞中進行了雙熒光素酶報告試驗，檢測到山羊RORα蛋白顯著上調了山羊BMAL1和NR1D1基因啟動子的轉錄活性，探究了該蛋白的生物學功能[26-27]。上述證據說明，以pcDNA3.1為骨架構建的真核表達載體是一個可靠的載體工具，可幫助研究者們深入探究反芻動物生物鐘系統相關基因在生殖與代謝等生理過程中的功能與作用機制。

NR1D1作為一種重要的核受體，主要通過結合靶基因啟動子區域的順式作用元件RORE抑制其轉錄，是哺乳動物生物鐘補充反饋環路中重要的負調控因子，同時也參與調控糖脂代謝、炎癥與免疫、繁殖等過程中關鍵基因的表達[8, 13, 28-30]。本研究利用多種生物信息學軟件預測分析了奶牛NR1D1基因及其編碼蛋白的理化性質和生物學特性，結果顯示NR1D1基因在哺乳動物間同源性較高，說明該基因在進化過程中相對保守；而牛、山羊及小鼠NR1D1蛋白的三級結構較為相似，提示NR1D1蛋白功能可能在反芻動物與小鼠之間存在相似之處。因此，有關小鼠NR1D1基因的研究結果或可為探究奶牛NR1D1基因功能提供一定的參考。

蛋白質相互作用預測結果表明，與NR1D1發生互作的前10位蛋白中，除ARNTL(BMAL1)、CLOCK、CRY2等晝夜節律生物鐘蛋白外，還包括轉錄抑制因子NCOR1，以及PLCB2、RASAL3等一些參與細胞信號轉導且與免疫過程相關的調控因子[31-32]。其中，HSF2在哺乳動物精子發生中發揮重要作用，其缺失導致睪丸體積縮小、精子數目減少并損害雄性動物生殖能力[33]；此外，一項近期的研究發現，HSF2能夠緩解腸道炎癥，在結腸炎中發揮保護作用[34]。以上結果表明，NR1D1可能在奶牛生物鐘系統以及免疫、糖脂代謝與生殖等眾多生理過程中發揮特定的作用，但這些僅為初步預測分析結果，尚需進一步的驗證。

因此，在功能預測分析的基礎上，本研究利用qPCR技術檢測了NR1D1基因在奶牛不同組織的表達分布。此前，Dai等[35]檢測到生物鐘基因NR1D1在雄性天祝白牦牛下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的不同組織中均有表達分布，且IHC結果顯示，NR1D1主要表達于牦牛睪丸組織各種生精細胞以及合成類固醇激素的睪丸間質細胞中。上述研究重點關注的是NR1D1在雄性牦牛生殖過程中的功能，而本研究檢測到NR1D1基因在奶牛多個組織中均有表達，其mRNA在瘤胃中的表達豐度極顯著高于其他組織，其次是結腸與肝，推測該基因可能參與奶牛體內營養物質的消化吸收以及能量代謝等過程。瘤胃是反芻動物特有的消化器官之一，也是其營養物質消化分解的主要部位[36]。Gao等[37]通過體外試驗研究發現，山羊瘤胃上皮細胞增殖和短鏈脂肪酸轉運蛋白的mRNA豐度與生物鐘蛋白PER2有關，提示生物鐘可能參與瘤胃中某些生物學過程的調控。那么，作為生物鐘系統重要組分的NR1D1在其中發揮了何種功能，值得進一步探究。

卵巢顆粒細胞主要分泌雌二醇(E2)，是參與哺乳動物類固醇激素合成與分泌的重要細胞類群，它能夠為卵母細胞提供營養物質和能量，對卵母細胞的發育、成熟以及正常功能的維持具有重要意義[38]。已有證據表明，NR1D1在大鼠卵巢中能夠調節類固醇激素合成和雌性生殖能力[39-40]。本研究采用IHC染色的方法，檢測發現NR1D1主要分布在卵巢顆粒細胞中。類似地，Wang等[41]通過IHC及免疫熒光染色發現，NR1D1在豬卵巢顆粒細胞中高表達，且主要分布在細胞核中，進一步研究發現，體外培養的豬卵巢顆粒細胞中NR1D1與類固醇合成關鍵基因CYP19A1、CYP11A1和StAR的表達呈現節律性。因此，推測在奶牛卵巢中，NR1D1基因可能同樣參與調控類固醇激素合成、卵泡發育等過程，但其具體作用以及調控機制還需進一步的試驗驗證。

4 結 論

本研究成功構建了奶牛NR1D1基因真核表達載體，并實現了奶牛NR1D1基因在HEK293T細胞的高效表達。對奶牛NR1D1基因及其編碼蛋白進行了生物信息學分析，并獲得了該基因的組織表達譜，該基因在奶牛多個組織中均有分布，但表達水平存在顯著差異，在瘤胃、結腸與肝中的表達量顯著高于其他組織。在奶牛卵巢組織中，NR1D1的表達具有細胞類型的特異性，主要分布在不同發育階段卵泡的顆粒細胞中。本研究結果為深入探究奶牛NR1D1基因的生物學功能提供了前期基礎與關鍵材料。