牦牛FHL2基因的克隆、組織表達與蛋白定位分析

龔三你，蔣旭東，馬 瑤，盧建遠，字向東

(西南民族大學 動物科學國家民委重點試驗室，成都 610041)

四個半LIM結構域蛋白(four and a half LIM domains protein, FHL)家族包含5個成員：FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和ACT[1]，它們均含有4個半 LIM結構域，不同的結構域間有24%～39%的氨基酸序列相似性，但組織表達有特異性[2-3]。FHL2是其家族研究最廣泛的基因，它除了在心上高表達外，在很多組織中都有表達[3]。FHL2由279個氨基酸殘基組成，是一種完全由 LIM 結構域組成的蛋白質[2]，因為其完全單一的LIM 結構域特性，目前已經發現其參與90多種不同的蛋白相互作用過程，這些蛋白參與不同的信號通路從而參與多種生理功能的調控[4]。FHL2有很多的生物學功能，參與細胞的增殖、凋亡和轉化過程[5-6]。小鼠缺失FHL2會導致皮膚、腸、血管、心或缺血性肌肉組織的傷口愈合受損[7-11]；FHL2的表達水平與多種腫瘤、肝癌和肺癌有密切的聯系[12]；非小細胞肺癌中FHL2的高水平表達會增加腫瘤的體積和重量[13]；FHL2在骨肉瘤細胞中充當癌基因，并通過 Wnt 信號傳導促進腫瘤發生[14]。還有研究發現，FHL2對哺乳動物繁殖有重要影響，有研究者敲除小鼠的FHL2基因，結果發現，敲除型雌鼠卵巢發育滯后，閉鎖卵泡數顯著增加，且敲除型雌鼠的5個月總產仔數顯著低于野生型雌鼠，降低了約43%，窩產仔數約降低22%[15]。在綿羊上的研究發現，FHL2在卵巢中高表達，定位于卵巢顆粒細胞，影響顆粒細胞增殖、凋亡、周期和類固醇激素(雌二醇和孕酮)的分泌及相關基因的表達，可能在綿羊繁殖調控中發揮重要作用[16]。

牦牛(Bosgrunniens)是分布于我國海拔2 500～5 500 m青藏高原及其毗鄰國家和地區的重要畜種，在這樣高海拔低氧條件下很少有其它畜種能夠生產生活。牦牛具有密而長的被毛、汗腺導管少、小腸發達、胸腔大(比普通牛多1～2對肋骨)、毛細血管網發達和肺泡數量多等特征，可以適應寒冷、低氧等惡劣的高原環境條件[17]，是青藏高原畜牧業生產中不可替代的重要畜種，對青藏高原經濟社會發展具有重要的意義，但其繁殖率低，產肉、乳性能低[18]。在其它物種的研究表明，FHL2具有廣泛的生物功能，其與動物的心功能和繁殖能力也密切相關[11-13,15-16]，但目前未見有關牦牛FHL2基因的研究報道。

本研究擬采用逆轉錄PCR(RT-PCR)技術克隆牦牛FHL2基因的CDS區，并利用生物信息學分析和預測所編碼蛋白質的結構及功能，利用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、免疫組化(immunohistochemistry, IHC) 和免疫熒光(immunofluorescence, IF)技術檢測FHL2基因在不同組織的表達特性和雌性生殖器官中的定位以及在顆粒細胞的亞細胞定位，為進一步探討FHL2基因在牦牛低氧生態適應和繁殖活動中的調控作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在四川省成都市青白江唐家寺屠宰場選擇無臨床病理表現的成年母牦牛，根據屠宰后子宮內有無胎兒判斷妊娠與否。空懷：子宮內無胎兒；妊娠2個月左右：子宮內有頭頸、軀干及四肢可以清楚辨識的胎兒[19]。采集5頭空懷母牦牛的心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮、輸卵管組織和5頭妊娠2個月左右的牦牛子宮、輸卵管和卵巢組織。采集的組織用生理鹽水沖洗干凈，迅速放入液氮罐中，帶回試驗室-80 ℃保存，用于PCR和RT-qPCR檢測。顆粒細胞由實驗室前期冷凍保存。同時采集牦牛卵巢、子宮、輸卵管組織樣，用4%多聚甲醛進行固定，待固定完成后用于免疫組化試驗。

1.1.2 主要試劑 RTIzol Reagent和瓊脂糖(美國Invitrogen)， cDNA反轉錄試劑盒、DNA Marker(GenStAR)，PowerUp SYBR Green預混液(美國Thermo Scientific)，膠回收試劑盒(成都擎科梓熙生物)，FHL2抗體(DF13015, Affinity Biosciences)，RBITC二抗(上海生工生物)。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(美國Invitrogen)，PCR儀(ETC811，蘇州東盛興業)，熒光定量PCR儀(CFX96, 美國Bio Rad)，激光共聚焦顯微鏡(LSM880, 德國ZISS)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 根據RTIzol RNA提取試劑盒的說明書提取RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA(OD260 nm/OD280 nm)的濃度和純度，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。根據反轉錄試劑盒說明書合成的cDNA于-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物的設計及合成 由于未見牦牛FHL2基因序列報道，所以根據NCBI中普通牛(Bostaurus)的FHL2基因序列(NM_001046046.2)，使用PrimerPrimer 5.0軟件設計克隆引物；再根據克隆獲得的序列設計FHL2基因的熒光定量PCR引物(表1)，熒光定量內參基因DAPDH引物參照劉宇等[20]設計的引物。引物由成都擎科生物公司合成。

表1 基因克隆與定量PCR引物Table 1 Primer pairs for gene cloning and RT-qPCR

1.2.3 牦牛FHL2基因克隆與測序 以牦牛卵巢合成的cDNA為模板，根據劉宇等[20]的方法克隆FHL2基因，但是本研究采用的退火溫度為54 ℃，循環數為30個，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 牦牛FHL2基因生物信息學分析 使用ORF Finder、BLAST、ExPASy ProtParam、Signal P 5.0、PSIPRED、SWISS-MODEL、TMHMM、NetPhos3.1 Server、STRING和MEGA11.0等在線生物信息學軟件[20]分析牦牛FHL2基因及其編碼蛋白質特性。

1.2.5 牦牛FHL2基因的RT-qPCR 采用RT-qPCR技術測定FHL2基因在母牦牛各組織中的mRNA表達水平。PCR體系為15 μL：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，PowerUp SYBR Green預混液 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，40個循環；讀取熔解曲線。

1.2.6 免疫組化分析 參照鄔建飛等[21]的免疫組化方法進行牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織的FHL2蛋白定位分析，最后采用共聚焦顯微鏡采集圖片。

1.2.7 細胞免疫熒光染色 培養48 h的牦牛原代顆粒細胞(融合率為80%)，取出細胞爬片，4%多聚甲醛固定細胞， PBS輕洗3次，每次5 min；然后用0.5% TritonX-100透化處理細胞20 min；隨后以5% BSA封閉30 min；在爬片上滴加一抗(1∶250稀釋)，4 ℃過夜孵育；二抗(1∶1 000稀釋)避光孵育2 h；最后用DAPI (1∶1 000 PBS稀釋)染核，室溫避光15 min；清洗后封片，共聚焦顯微鏡采集熒光圖片。

1.2.8 統計分析 每個樣品重復檢測3次，以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算FHL2基因的相對表達量。使用SPSS26.0軟件對空懷母牦牛不同組織中FHL2基因表達量進行單因子方差分析。采用t檢驗對空懷期與妊娠期的基因表達差異進行顯著性分析。

2 結 果

2.1 牦牛FHL2基因克隆

以牦牛卵巢cDNA為模板，經PCR擴增后獲得的產物片段與目的基因大小相符(圖1)，表明成功擴增了牦牛FHL2基因。測序表明，FHL2基因全長1 041 bp，其中CDS區長840 bp，共編碼279個氨基酸。NCBI的基因序列登錄號為ON456866。

M. DNA相對分子質量標準；1～2. FHL2引物PCR擴增產物M. DL2000 DNA marker;1-2. PCR amplification products of FHL2 primer圖1 牦牛FHL2基因PCR產物的電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of yak FHL2 PCR products

2.2 牦牛與黃牛FHL2基因的核苷酸序列比較

使用DNAMAN6.0軟件將所擴增FHL2基因的CDS區與黃牛FHL2基因的CDS區進行比較，發現了2個堿基突變，其中第98位點堿基差異(G>C)導致了氨基酸的改變(E>D)，但第641位點堿基差異(C>T)沒有導致氨基酸的改變。牦牛與黃牛FHL2基因的CDS區同源性為99.76%。

2.3 FHL2基因編碼氨基酸序列的同源性

使用DNAMAN6.0軟件分析不同物種FHL2基因編碼氨基酸序列的同源性，結果顯示，牦牛與黃牛(NP_001039511.1)、綿羊(XP_004006164.1)、豬(XP_013851352.2)、馬(XP_005599839.1)、人(NP_001305824.1)、鼠(NP_034342.1)和倭蛙(XP_018418626.1)的氨基酸序列相似性分別為99.64%、98.57%、94.27%、93.55%、90.32%、88.17%和79.57%，說明FHL2基因在進化過程中的保守性較高(圖2)。

2.4 牦牛FHL2蛋白的理化性質

使用ExPASY-ProtParam在線工具分析牦牛FHL2蛋白，發現FHL2蛋白的分子式為C1386H2118N390O414S38，分子質量為32 086.71，FHL2蛋白是弱堿性蛋白，理論等電點為7.59；FHL2蛋白的氨基酸組成中半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)的所占比例較高，分別為12.5%、7.9%和7.2%；FHL2蛋白屬于親水不穩定蛋白，其脂肪族指數為50.36；平均親水性為-0.509，不穩定指數為50.99。FHL2蛋白帶正電荷，其帶負電荷(Asp+Glu)和帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸殘基總數分別為37和39個。根據TMHMM 2.0在線工具分析，FHL2蛋白沒有跨膜結構；使用Signal P 5.0預測，FHL2蛋白不存在信號肽。使用NetPhos3.1在線工具分析顯示FHL2蛋白有33個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點分別有16、10和7個。

2.5 FHL2蛋白二、三級結構預測

使用SOPMA在線工具預測FHL2蛋白的二級結構，結果顯示無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉角占比分別為55.91%、20.07%、19.35%和 4.66% (圖3)。使用SWISS-MODEL在線工具預測的FHL2蛋白三級結構與二級結構預測結果一致(圖4)。

c. 無規則卷曲；h. α-螺旋；t. β-轉角；e. 延伸鏈c. Random coil; h. α-helix; t. β-turn; e. Extension chain圖3 牦牛FHL2蛋白二級結構預測Fig.3 The predicted secondary structure of yak FHL2 protein

圖4 牦牛FHL2蛋白三級結構預測Fig.4 The predicted tertiary structure of yak FHL2 protein

2.6 蛋白相互作用分析

使用STRING11.0在線工具對牦牛FHL2蛋白進行網絡互作分析，結果顯示，FHL2蛋白與雌激素受體基因1(ESR1)、雄激素受體(AR)、叉頭轉錄因子1(FOXO1)、乳腺癌易感基因1(BRCA1)、腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)、S100鈣結合蛋白A10(S100A10)和小窩相關蛋白1(CAVIN1)等蛋白互作緊密 (圖5)。

圖5 FHL2蛋白網絡互作分析圖Fig.5 FHL2 protein interaction networks

2.7 牦牛FHL2基因系統進化樹分析

從NCBI下載黃牛(NM_001046046.2)、綿羊(XM_004006115.4)、山羊(XM_018054971.1)、小鼠(NM_001289533.1)、大鼠(NM_031677.1)、兔(XM002709708.3)、馬(XM_005599782.3)、鯽魚(XM_027743867.2)、原雞(XM_040657379.1)、線蟲(XM_034758044.1)和豬(XM_013995898.2)11個物種的FHL2基因序列，利用Mega11.0構建基因進化樹。結果表明，牦牛與黃牛的親緣關系最近，其次是與山羊和綿羊，與原雞的親緣關系最遠，說明該基因在動物進化過程中比較保守(圖6)。

圖6 用NJ法構建的FHL2基因系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of FHL2 gene constructed by NJ method

2.8 牦牛FHL2基因表達差異分析

2.8.1FHL2基因組織表達分析 RT-qPCR檢測結果顯示，FHL2基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管中均有表達(圖7)，其在心中的表達量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；肺、卵巢、輸卵管和子宮中的表達量極顯著高于肝、脾和腎(P<0.01)。

柱上大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同Columns with different capital letters denote difference at P<0.01, with different lowercase letters denote difference at P<0.05. The same as below圖7 空懷母牦牛不同組織中FHL2基因的相對表達水平Fig.7 Expression levels of FHL2 gene in different tissues of non-pregnant female yak

2.8.2 空懷期與妊娠期牦牛生殖器官中FHL2基因的表達分析 以空懷期生殖器官的表達量為參照，檢測FHL2基因mRNA在牦牛空懷期與妊娠期卵巢、子宮和輸卵管組織的表達情況，發現FHL2基因在空懷期卵巢中的表達量極顯著高于妊娠期(P<0.01)(圖8A)，妊娠期子宮中的表達量極顯著高于空懷期(P<0.01)(圖8B)，空懷期和妊娠期輸卵管中的表達量差異不顯著(P>0.05)(圖8C)。

A.卵巢；B.子宮；C.輸卵管A. Ovary; B. Uterus; C. Oviduct圖8 牦牛生殖器官中FHL2基因的相對表達水平Fig.8 Relative expression level of FHL2 gene in reproductive organs of yaks

2.9 母牦牛FHL2蛋白在生殖器官及顆粒細胞的定位

IF結果顯示，FHL2蛋白在細胞質和細胞核均有表達(圖9)，且主要存在于細胞核并從細胞核向細胞質彌散。IHC結果顯示，FHL2蛋白在牦牛的卵巢、輸卵管、子宮均有分布。在卵巢中主要表達于卵泡顆粒細胞，在輸卵管上主要表達于黏膜上皮細胞，在子宮中主要表達部位為子宮腺和子宮內膜細胞(圖10)。

圖9 FHL2 在牦牛卵巢顆粒細胞中的亞細胞定位Fig.9 The subcellular localization of FHL2 in yak ovarian granulosa cells

3 討 論

FHL2蛋白是4個半LIM結構域蛋白家族中的一個成員，它不直接調節基因表達, 而是通過與轉錄因子及其上游共調節因子相互作用來調節基因表達[2]。通過與其靶蛋白結合，FHL2蛋白調節或微調信號轉導途徑和隨后的基因調控，這對各種組織的功能及其病理很重要，特別是在繁殖相關性狀中具有重要的調控作用[15-16,22]。為了探究牦牛FHL2基因、蛋白及其表達特性，本試驗克隆獲得了牦牛FHL2基因完整的CDS區全長840 bp，編碼279個氨基酸，共有33個磷酸化位點。近期的研究發現，c-Abl 激酶通過 FHL2 蛋白磷酸化來調節細胞增殖[23]。牦牛FHL2蛋白定位在顆粒細胞的細胞核和細胞質上，這與在小鼠和綿羊上的研究結果一致[22,24]。牦牛FHL2蛋白氨基酸同源性比對和基因進化樹結果顯示，FHL2基因與黃牛的同源性最高，相似度為99.64%，在進化樹上牦牛與黃牛最先聚為一類，其次與偶蹄目的綿羊和山羊聚為一類，與禽類的關系最遠。Zhang等[24]的研究也發現，FHL2基因與有蹄動物的同源性最高，與家禽的同源性較低，與本研究結果一致，說明FHL2基因在進化過程中比較保守。本試驗發現，牦牛FHL2基因的CDS區與黃牛的CDS區相比有兩個堿基發生突變，且第98位點堿基的改變導致谷氨酸突變為天冬氨酸，這種突變是否影響FHL2蛋白的功能尚待研究。

根據蛋白互作網絡圖顯示，FHL2蛋白可能與AR、FOXO1、BRCA1、ESR1、HMCN1、CAVIN1、S100A102和TRAF2等蛋白相互作用。FHL2蛋白是 BRCA1的轉錄共激活因子，Rajan等[25]研究闡明，BRCA1可與雌激素受體 (ER) 結合，抑制雌激素受體(ER-α)的信號傳導，并阻斷ER-α的轉錄激活功能。Zhang等[26]的研究表明，BRCA1可與雄激素受體(AR)結合，并通過激活SIRT1來抑制AR表達。雄激素通過AR在雌性的生殖系統中起著重要的作用[27]，且FHL2過表達抑制排卵相關基因，部分是通過FHL2作為AR的共阻遏物調節KGN細胞中C/EBPβ的表達實現[28]。FHL2是FOXO1轉錄的共抑制子，FOXO1是氧化應激誘導顆粒細胞凋亡關鍵性的調控因子，FOXO1在卵泡顆粒細胞中的表達會誘導下游與細胞凋亡相關基因的表達，導致顆粒細胞的凋亡與卵泡的閉鎖[29-30]；還有研究發現，FOXO1與子宮內膜蛻膜化、胚胎植入與胚胎發育都有緊密的聯系[31]。有研究表明， FHL2通過誘導FOXO1與組蛋白去乙酰酶SIRT1相互作用，使FOXO1蛋白去乙?；瑥亩种艶OXO1蛋白的轉錄活性[29]。蛋白互作結果表明，FHL2蛋白可通過互作蛋白參與卵巢排卵、顆粒細胞的增殖、子宮內膜蛻膜化、胚胎植入和胚胎發育的調控，推測FHL2與雌性動物的繁殖性能有重要聯系。

RT-qPCR的結果顯示，FHL2基因在牦牛的各個組織中廣泛表達，這與在小鼠[15,22]、綿羊[16]、雞[32]和人[33]上的研究結果一致，說明FHL2基因具有廣泛的生物學功能。本研究發現，FHL2基因在心組織的表達量極高，與前人[16]在綿羊上的研究結果一致。FHL2基因對各種類型的心臟損傷恢復至關重要[2,11]。FHL2基因對心臟肥大相關的選擇性信號通路起保護作用，通過抑制MAPK/ERK信號抑制心肌細胞肥大，是 calcineurin/NFAT 信號的抑制因子[34]。FHL2已被確定為肺癌的重要生物標志物，在肺部組織纖維化和肺癌的診斷與治療中有重要作用[13,35]。本試驗結果顯示，牦牛FHL2基因在肺有顯著表達，推測FHL2在牦牛心、肺的表達量高可能與其高原低氧環境的適應性相關。RT-qPCR結果顯示，牦牛FHL2基因在卵巢、子宮和輸卵管上高表達。IHC進一步證明，FHL2蛋白主要定位在卵巢有腔卵泡的顆粒細胞、子宮內膜和輸卵管黏膜。有學者研究表明，敲除FHL2基因可抑制小鼠卵巢生長和卵泡發育，降低排卵質量和繁殖力[15]；FHL2參與調控綿羊顆粒細胞增殖、凋亡、細胞周期和類固醇激素(雌二醇和孕酮)的分泌及相關基因的表達[16]；FHL2提高膠質母細胞瘤中表皮生長因子受體(EGFR)的表達，從而促進細胞增生[36]。可以推測，FHL2可能與牦牛卵巢卵泡發育及輸卵管黏膜和子宮內膜增生密切相關。IF結果顯示，FHL2在卵巢顆粒細胞的細胞核和細胞質表達，與前人的研究結果一致[16,22]。本研究還發現，空懷期母牦牛卵巢FHL2基因表達量極顯著高于妊娠期(P<0.01)，而妊娠期子宮FHL2基因表達量極顯著高于空懷期(P<0.01)，進一步說明在空懷期FHL2可能促進卵巢卵泡生長發育，而在妊娠期促進子宮內膜增生，維持妊娠。

4 結 論

本試驗克隆得到牦牛FHL2基因CDS區全長為840 bp，編碼279個氨基酸，物種間具有較高保守性。其在牦牛各組織中廣泛表達，在心、肺、卵巢、輸卵管和子宮中高表達。FHL2蛋白主要定位在卵巢的顆粒細胞、輸卵管的黏膜上皮、子宮內膜。空懷期卵巢中FHL2表達量顯著高于妊娠期，而妊娠期子宮中的表達量顯著高于空懷期。說明FHL2可能參與牦牛低氧適應性、卵泡生長發育和妊娠維持等生理功能的調控。