毛喉素對豬卵母細胞降脂及冷凍保護效果研究

蔡紹莉，徐皆歡，何孟纖，張德福，孫玲偉，張樹山，李婉君，吳彩鳳，主 性，戴建軍*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025； 2.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106； 3.農業農村部畜禽資源(豬)評價利用重點實驗室，上海 201106； 4.上海種豬工程技術研究中心，上海 201302)

自1972年Whittingham等[1]實現小鼠卵母細胞玻璃化冷凍保存以來，該技術已在牛、羊、兔、大鼠等二十多個物種上推廣應用。與之相比，豬卵母細胞因脂質含量高、滲透性差，阻礙了滲透保護劑對水分的充分置換，導致其冷凍時胞內水分形成冰晶而發生機械性損傷。目前，豬卵母細胞冷凍效率仍很低[2]，直到2014年[3]和2015年[4]才分別自GV期與MII期冷凍卵母細胞中獲得了存活后代，但冷凍效率尚不足以推廣至生產應用。已有研究證實，豬卵母細胞對低溫極其敏感，15 ℃下15 min基本喪失存活能力[5]。大量研究表明，豬卵母細胞胞內的高濃度脂肪顆粒是造成其對低溫敏感的主要原因[6]。盡管通過對卵母細胞或胚胎進行離心去脂處理，可提高凍后存活率[7]，但高速離心和顯微操作會造成透明帶受損，導致潛在的病原感染風險[8]，且成本高、技術難度大，不適用于生產應用。另外，卵母細胞內脂肪參與了氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循環等產能途徑，為細胞提供所需能量，是卵母細胞成熟及胚胎發育的重要能源物質。離心和去脂處理對脂肪顆粒分布、卵丘-卵母細胞復合體的完整性和能量供給均產生較大負面作用，嚴重影響卵母細胞減數分裂進程[9]。

一些天然化合物，如左旋肉堿[10]、毛喉素[11]等已被證實可在不影響卵母細胞成熟的情況下降低其脂質含量，但目前尚未在冷凍保存中得到應用。毛喉素是一種自毛喉鞘蕊花中分離得到的天然降脂物質，不僅能促進脂質分解，還可調節細胞生理進程與新陳代謝[12]。有研究發現，在豬胚胎培養基中加入毛喉素可降低其胚胎中的脂質含量[11,13]。基于此，本研究擬利用非侵入式的化學降脂方法，通過在卵母細胞成熟培養過程中添加毛喉素，成熟后檢測細胞內脂滴含量、超微結構、線粒體膜電位、卵母細胞活性氧水平、凍后存活率及發育潛能等多方面的變化，評價毛喉素的降脂效果和對豬卵母細胞抗凍能力的影響，促進卵母細胞冷凍保存技術在豬保種中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗分組

豬卵母細胞分組處理如下：經體外成熟培養的MII期卵母細胞組(Fresh)、成熟培養期間經毛喉素處理的MII期卵母細胞組(Forskolin)、未經毛喉素處理的MII期卵母細胞冷凍-解凍組(Vitirfied)、經毛喉素處理的MII期卵母細胞冷凍-解凍組(Vitirfied+Forskolin)。

1.2 試劑

Medium-199 with HEPES、胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)、青鏈霉素(penicillin streptomycin)及丙酮酸鈉(sodium pyruvate)購自美國Gibco。乙二醇(ethylene glycol，EG)購自美國Fluka。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)及孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)購自寧波第三激素制品有限公司。毛喉素(Forskolin)、二乙酸螢光素(FDA)、25 mL·L-1戊二醛(電鏡專用)及尼羅紅購自上海源葉生物科技有限公司。活性氧檢測試劑盒、JC-1膜電位檢測試劑盒、Annexin-V細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。豬卵泡液(porcine follicular luid，pFF)由本實驗室自制。其他試劑購自美國Sigma。

1.3 卵母細胞成熟培養與毛喉素處理

自屠宰場采集新鮮豬卵巢，39 ℃保溫，1 h內送至實驗室。利用10 mL注射器抽吸卵巢表面2～6 mm卵泡，收集卵泡液，沉淀30 min以上，棄上清，沉淀置于倒置顯微鏡下挑選卵丘-卵母細胞復合體(cumulus- oocyte complexes，COCs)，Medium-199洗滌3次，置于成熟培養液中培養44 h，培養條件39 ℃、50 mL·L-1CO2和飽和濕度。成熟培養液(IVM)配方：取1 mL FBS、1 mL pFF、100 μL 1 000 IU·mL-1PMSG、100 μL 1000 IU·mL-1hCG、100 μL雙抗、100 μL 6.9 mg·mL-1L-Cys、10 μL 10 μg·mL-1EGF溶于7.6 mL Medium-199中混勻。培養后的COCs置于1 mL·L-1透明質酸酶中反復吹打，直至顆粒細胞完全洗脫，Medium-199洗滌3次后備用。參照Prates等[14]研究報道，本研究試驗組為在體外成熟培養液中添加終濃度為10 μmol·L-1的毛喉素。

1.4 冷凍-解凍

卵母細胞于冷凍平衡液(每10 mL中含0.75 mL EG、0.75 mL DMSO和2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)中平衡5 min，移入玻璃化冷凍液(每10 mL中含1.36 g蔗糖、1.5 mL DMSO、1.5 mL EG和2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)，30 s后裝載至Cryotop載桿，立即投入液氮，于液氮下插入冷凍套管中，轉移至液氮罐凍存2周。解凍時，將Cryotop細胞裝載區提出液氮面并立即置入39 ℃解凍液I(每10 mL中含1.026 g蔗糖，2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)中，5 min后將卵母細胞移入解凍液II(每10 mL中含0.513 g蔗糖，2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)孵育5 min，再移入孵育液(100 mL·L-1FBS的Medium-199溶液)中洗滌3次后孵育2 h，獲得冷凍-解凍卵母細胞。

1.5 卵丘擴散及卵母細胞成熟率檢測

經成熟培養后，于鏡下檢測卵丘擴散程度。洗脫顆粒細胞后，觀察卵母細胞第一極體排出情況，排出第一極體視為卵母細胞成熟。

1.6 脂滴數量及面積檢測

卵母細胞置于含10 μmol·L-1尼羅紅Medium-199中39 ℃孵育15 min，Medium-199洗滌3次，壓片，封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察卵母細胞內脂滴數量及面積(激發波長410 nm，發射波長455 nm；掃描時選取卵最大橫截面進行脂滴數量及面積統計)。

1.7 超微結構觀察

卵母細胞于25 mL·L-1戊二醛中4 ℃固定2 h，預冷的PBS緩沖液洗滌2次，每次10 min。于10 mL·L-1鋨酸(4 ℃)中固定2 h，4 ℃雙蒸水洗滌2次，每次10 min；乙醇逐級脫水，環氧丙烷置換2次，每次10 min，再用Epon 812浸透，60 ℃烘箱內包埋48 h，切片，枸櫞酸鉛電子染色，自然干燥后于透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650)下觀察、拍照。

1.8 線粒體膜電位檢測

利用JC-1檢測試劑盒(碧云天)檢測卵母細胞的線粒體膜電位(ΔΨm)。卵母細胞于含2 μmol·L-1JC-1的Medium-199中39 ℃孵育20 min，洗滌3次，壓片，封片。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光強度，紅(JC-1聚合物最大激發波長為585 nm，最大發射波長為590 nm)/綠(JC-1單體最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm)熒光強度比值即為ΔΨm。

1.9 活性氧(ROS)水平檢測

利用活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(碧云天)檢測卵母細胞ROS水平，將卵母細胞置于含10 μmol·L-1DCFH-DA的Medium-199中，39 ℃孵育20 min，Medium-199洗滌3次后于熒光顯微鏡下拍照，統計熒光強度值。

1.10 細胞早期凋亡檢測

利用Annexin V細胞凋亡試劑盒(碧云天)檢測卵母細胞早期凋亡。將卵母細胞置于含50～100 μL Annexin V-mCherry的Binding Buffer中室溫避光孵育30 min，孵育結束后置于冰浴中，Medium-199洗滌3次，熒光顯微鏡觀察，紅色熒光即為發生早期凋亡的卵母細胞。

1.11 凍后存活率檢測

利用二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate，FDA)熒光探針檢測卵母細胞凍后存活率。卵母細胞于含5 μg·mL-1FDA的Medium-199中39 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察，綠色熒光即為存活的卵母細胞。

1.12 卵母細胞凍后胚胎發育能力檢測

卵母細胞于電激活液[15]中洗滌3次，移入鋪有電激活液的0.5 mm激活槽中電激活，激活參數為1.2 kv·cm-1、30 μs，一次脈沖。電激活后，卵母細胞經胚胎培養液(PZM-3)洗滌3次，移入PZM-3中39 ℃、50 mL·L-1CO2飽和濕度下培養，2 d觀察卵裂、5 d觀察桑椹胚、7 d觀察囊胚形成情況。

1.13 數據統計

每個試驗至少重復3次，每個重復使用30個卵母細胞。采用Image-Pro Plus 6.0量化熒光值，采用SPSS l7．0 (SPSS Inc，Chicago，IL，USA)對數據執行單因素方差分析，LSD多重比較，結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05代表組間差異顯著，P<0.01代表組間差異極顯著。

2 結 果

2.1 毛喉素對豬卵母細胞體外成熟的影響

圖1結果表明，經毛喉素處理后，Fresh組和Forskolin組的卵母細胞體外成熟培養后卵丘均勻擴散，且在第一極體排出率上差異不顯著(88.00%vs.92.00%,P>0.05)。

2.2 毛喉素促進冷凍豬卵母細胞脂滴降解

體外成熟卵母細胞中脂滴熒光定位及統計結果如圖2所示。與Fresh組相比，成熟培養過程中添加毛喉素極顯著降低了豬卵母細胞內脂滴數量(192.34±14.15vs.459.86±25.53,P<0.01)及相對面積(0.62±0.05vs.1.00±0.05,P<0.01)。與Fresh組相比，Vitrified組卵母細胞內脂滴數量(245.87±36.72vs.459.86±25.53,P<0.01)和脂滴相對面積(0.50±0.039vs.1.00±0.054)極顯著下降(P<0.01)。Vitrified+Forskolin組的卵母細胞脂滴數量(140.07±11.09)和脂滴相對面積(0.33±0.031)均顯著低于Vitrified組(245.87±36.72和0.50±0.039)(P<0.01)。結果顯示成熟培養過程中添加毛喉素可顯著降低冷凍前后卵母細胞內脂質含量。

A.尼羅紅染色熒光影像。尼羅紅染色后卵母細胞內的脂滴可被檢測到紅色熒光，標尺=50 μm。B.卵母細胞脂滴數量統計學分析。C.卵母細胞脂滴相對面積統計學分析。柱上不同字母代表組間差異極顯著，P<0.01，下同A. Fluorescent images stained with Nile red. Red fluorescence can be detected in lipid droplets in oocytes after Nile red staining, Scale bar=50 μm. B. Statistical analysis of the number of lipid droplets in oocytes. C. Statistical analysis of relative area of lipid droplets in oocytes. Different letters on the column represent extremely significant differences, P<0.01, the same as below圖2 卵母細胞脂滴數量與定位Fig.2 Number and location of lipid droplets in oocytes

M. 非均質脂滴；N. 均質脂滴；黑色箭頭指向線粒體；標尺=2 μmM. Heterogeneous lipid droplets; N. Homogeneous lipid droplets; Black arrows point to mitochondria; Scale bar=2 μm圖3 卵母細胞超微結構觀察Fig.3 Ultrastructural observation of oocytes

2.3 毛喉素對冷凍豬卵母細胞脂滴及線粒體超微結構的影響

超微結構觀察發現，卵母細胞內存在兩種脂滴形態，分別為非均質脂滴和均質脂滴，非均質脂滴呈球形并伴有許多透亮的線狀條紋。冷凍前，Fresh組中非均質脂滴的數量要略高于均質脂滴，且非均質脂滴的大小比均質脂滴大，線粒體均勻分布于胞質中，線粒體嵴明顯；經毛喉素處理后，卵母細胞中非均質脂滴與均值脂滴的數量比例則進一步擴大，且比均質脂滴更大，線粒體成簇分布在非均質脂滴的周圍，線粒體嵴明顯。

卵母細胞經玻璃化冷凍后，細胞內的非均質脂滴明顯增加；與Vitrified組相比，經毛喉素處理的冷凍卵母細胞非均質脂滴的比例進一步增加，均質脂滴減少甚至是消失，脂滴大小進一步下降。冷凍后的卵母細胞線粒體模糊或消失，脂滴周圍空泡化程度加劇。

2.4 毛喉素緩和豬卵母細胞凍后線粒體去極化

卵母細胞線粒體膜電位檢測結果見圖4。無論是毛喉素處理卵母細胞，還是未處理卵母細胞，冷凍后其線粒體膜電位值均極顯著低于其對應的未冷凍卵母細胞(P<0.01)，說明冷凍會導致卵母細胞線粒體膜電位顯著降低；與Vitrified組相比，Vitrified+Forskolin組的線粒體膜電位顯著提高(1.04±0.53vs.0.51±0.03,P<0.01)，說明毛喉素處理可顯著改善凍后卵母細胞的線粒體功能。

A.卵母細胞線粒體膜電位檢測。線粒體處于高膜電位時，JC-1聚合物呈紅色熒光；低膜電位時，JC-1單體呈綠色熒光，標尺=50 μm。B. 線粒體膜電位結果統計學分析A. The determination of oocyte ΔΨm. Red florescence of poly-JC-1 can be monitored when ΔΨm is high, while green florescence of mono-JC-1 is monitored when ΔΨm is low, Scale bar=50 μm. B. Statistical analysis of ΔΨm圖4 卵母細胞線粒體膜電位檢測Fig.4 Determination of oocyte mitochondrial membrane potential

2.5 毛喉素減輕豬卵母細胞凍后氧化應激

卵母細胞活性氧檢測結果見圖5。無論是毛喉素處理卵母細胞，還是未處理卵母細胞，冷凍后卵母細胞的ROS熒光強度值均極顯著高于未冷凍組(P<0.01)，表明玻璃化冷凍加劇了卵母細胞氧化應激。與Vitrified組相比，在成熟培養液中添加毛喉素極顯著降低了凍后卵母細胞ROS水平(11.57±0.58vs.22.77±2.23,P<0.01)。表明成熟培養期間添加毛喉素能減緩冷凍對卵母細胞造成的氧化應激。

A. DCFH-DA染色熒光影像。DCFH-DA染色后，含有ROS的卵母細胞可被檢測到綠色熒光，標尺=100 μm。B. 卵母細胞活性氧水平統計學分析A. Images of DCFH-DA staining. After stained by DCFH-DA, oocytes containing ROS can be monitored in green florescence, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte ROS level圖5 卵母細胞活性氧檢測Fig.5 Determination of ROS level in oocytes

2.6 毛喉素抑制冷凍豬卵母細胞早期凋亡

卵母細胞早期凋亡檢測結果見圖6。結果顯示，成熟培養過程中添加毛喉素對成熟卵母細胞早期凋亡率指標沒有顯著影響(6.00%vs.5.57%,P>0.05)；經玻璃化冷凍后，Vitrified組和Vitrified+Forskolin組的早期凋亡比例與未冷凍組相比均極顯著上升(P<0.01)，表明冷凍極易引起凍后卵母細胞凋亡。與Vitrified組相比，成熟培養過程中添加毛喉素可極顯著抑制卵母細胞冷凍后的早期凋亡率(68.30%vs.86.03%,P<0.01)。結果表明，添加毛喉素可顯著降低冷凍引起的卵母細胞早期凋亡。

A. Annexin-V染色熒光影像。Annexin-V染色后，出現早期凋亡的卵母細胞可被檢測到紅色熒光，標尺=100 μm。B. 卵母細胞早期凋亡統計學分析A. Images of Annexin-V staining. After stained by Annexin-V, early apoptotic oocytes can be monitored in red florescence, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte early apoptosis rates圖6 卵母細胞早期凋亡檢測Fig.6 Determination of oocyte early apoptosis

2.7 毛喉素提高豬卵母細胞冷凍存活率

卵母細胞存活率檢測結果見圖7。結果顯示，新鮮卵母細胞中毛喉素處理對卵母細胞的凍前存活率(98.67%vs.95.90%)無顯著影響(P>0.05)。經玻璃化冷凍后，毛喉素處理組的凍后存活率由51.47%提高至71.17%(P<0.01)。表明冷凍會導致卵母細胞死亡率升高，在成熟培養期間添加毛喉素能上調冷凍后卵母細胞的存活率。

A. FDA染色熒光影像。FDA染色后，具有細胞活性的卵母細胞可被檢測到綠色熒光，標尺=100 μm。B. 卵母細胞存活率統計學分析A. Images of FDA staining. After FDA staining, green fluorescence can be detected in living oocytes, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte viability圖7 卵母細胞存活率檢測Fig.7 Determination of oocyte viability

2.8 毛喉素提高豬卵母細胞冷凍體外發育能力

卵母細胞體外發育能力檢測結果見圖8及表1。結果顯示，新鮮卵母細胞中毛喉素處理對卵母細胞的凍前孤雌激活卵裂率(91.37% vs. 86.13%)無顯著影響(P>0.05)，而在桑椹胚率(62.21% vs. 53.19%)和囊胚率(19.57% vs. 5.05%)上差異顯著(P<0.05)。經玻璃化冷凍后，毛喉素處理組的凍后孤雌激活卵裂率由8.23%提高至16.63%(P<0.05)，毛喉素處理組的凍后孤雌激活桑椹胚率和囊胚率差異性不顯著，但有升高的趨勢。表明在成熟培養期間添加毛喉素能上調冷凍后卵母細胞的孤雌激活卵裂及凍前桑椹胚率和囊胚率。

A. 2 d卵裂圖，標尺=100 μm。B. 5 d桑椹胚圖，標尺=50 μm。C. 7 d囊胚圖，標尺=100 μmA. Image of cleavage at 2 d, Scale bar=100 μm. B. Image of morula at 5 d, Scale bar=50 μm. C. Image of blastocyst at 7 d, Scale bar=100 μm圖8 卵母細胞發育能力檢測Fig.8 Detection of oocyte development ability

表1 卵母細胞發育能力檢測Table 1 Detection of oocyte development ability %

3 討 論

豬卵母細胞內脂質含量過高，一直被認為是制約豬卵母細胞冷凍效率提高的重要原因。盡管目前冷凍豬卵母細胞復原后可獲得存活后代[4-5]，但尚不足以推廣應用。降脂或去脂已成為提高豬卵母細胞冷凍效率的一個重要途徑。毛喉素是一種自毛喉鞘蕊花中分離得到的天然降脂物質，具有促進脂質分解、調節細胞生理進程與新陳代謝的作用。因此推斷，在卵母細胞成熟培養過程中添加降脂劑毛喉素可降低卵母細胞內的脂質含量。Prates等[14]研究證實，在體外成熟過程中毛喉素可通過改變脂滴的分布與形態，降低豬卵母細胞內脂質含量。本研究通過在豬卵母細胞體外成熟培養過程中添加10 μmol·L-1毛喉素，極顯著降低了成熟卵母細胞中的脂滴數量、大小和面積，降脂效果明顯，該結果與上述研究結果相似，再次證實了毛喉素可有效降低豬卵母細胞中的脂肪含量。

毛喉素降脂處理是否會影響卵母細胞成熟和體外發育也是本研究關注的重點。毛喉素是一種引起cAMP升高的腺苷酸環化酶的激動劑，傅國棟等[16]研究發現，成熟前毛喉素短期預處理時能夠刺激豬卵母細胞體外成熟，且這種作用是與卵丘細胞的存在有關。本研究顯示，成熟過程中全程添加毛喉素可部分提高豬卵母細胞成熟率、線粒體膜電位和體外發育能力、降低氧化應激和早期凋亡率水平，但均與未添加組無顯著差異(P>0.05)。兩者的研究均證實毛喉素不影響GV期卵母細胞向MII期過渡和成熟卵母細胞質量，說明成熟培養期間添加毛喉素調節脂質含量是安全可行的。

由于體積較大，在玻璃化冷凍過程中，豬卵母細胞不可避免地會受到高濃度冷凍保護劑的滲透壓和毒性損傷，同時冷凍和解凍過程中溫度的劇烈變化，還會導致卵母細胞內多種細胞器的超微結構變化。研究表明，豬卵母細胞中的脂肪酸含量遠高于牛、羊等，且這種高的脂肪酸含量主要歸之于豐富的甘油三磷脂儲量，且其他不飽和脂肪酸儲量的種屬特異性差異可成為比較豬和反芻動物(牛、羊)卵母細胞冷凍敏感性的基礎[17]。Isachenko等[18]報道，豬卵母細胞內含有均質性和非均質性兩種形態的脂滴，且均質性脂滴可在低溫條件下轉化為非均質性脂滴。本研究發現，脂滴在一定條件下會轉化為卵母細胞在冷凍-解凍過程所需的能量，對維持卵母細胞生物學功能有一定作用。在此過程中大脂滴會被消耗及分解成小脂滴，小脂滴又會被消耗，是最終造成脂滴數量減少和脂滴相對面積降低的主要原因。同時在冷凍-解凍時細胞內的均質脂滴部分轉化為非均質脂滴，還有部分脂滴發生溶解，導致玻璃化冷凍后超微結構內的空泡化加劇，進而造成玻璃化冷凍后豬卵母細胞內的非均質脂滴數量遠遠多于凍前的均質脂滴和非均質脂滴。該結果與薛夢琦等[19]、武彩紅等[20]、王勇杰等[21]在豬冷凍卵母細胞上的研究結果相似。本研究超微結構觀察也發現，經毛喉素處理后，無論是新鮮還是冷凍卵母細胞，非均質脂滴所占比例均進一步提高，提示這種脂滴成分的變化可能是毛喉素提高豬卵母細胞抗凍能力的重要因素之一。

細胞內線粒體作為最重要的細胞器之一，與胞內能量供應、細胞呼吸、氧的代謝等有著十分密切的關系，凍后線粒體損傷將引起細胞氧化損傷、凋亡和發育能力下降[22]。本研究還發現，冷凍后出現部分線粒體固縮、線粒體嵴模糊或消失等現象，這與眾多研究結果一致[23-24]，同時，線粒體在凋亡信號的誘導下，發生膜電位的降低，隨之線粒體膜通透性轉換孔開放[25]。本研究也證實，玻璃化冷凍后的線粒體膜電位顯著降低；與此同時，與冷凍卵母細胞相比，在體外成熟培養期間添加毛喉素處理可極顯著上調冷凍卵母細胞線粒體膜電位。可能的原因是卵母細胞在冷凍前的去脂處理，導致冷凍時水分置換更充分，冰晶形成減少，減輕了線粒體受到的機械性損傷，證實了毛喉素能在一定程度上維持冷凍后線粒體穩態，保證了線粒體功能正常。ROS主要由線粒體合成并釋放。冷凍引起的線粒體去極化通過改變卵母細胞中幾種氧化還原途徑而導致ROS的生成增加[26]，本研究也證實了卵母細胞冷凍時線粒體發生去極化使這期間胞內平衡失調，導致正常的線粒體功能受到破壞，線粒體過量釋放的活性氧造成卵母細胞氧化應激，從而誘發細胞凋亡。細胞早期凋亡的現象是磷酯酰絲氨酸外翻，正常情況下其分布于細胞膜內側，本研究中卵母細胞冷凍后顯著性地誘導早期凋亡，出現了大量磷酯酰絲氨酸外翻現象；與冷凍卵母細胞相比，成熟培養期毛喉素處理極顯著的抑制凍后卵母細胞早期凋亡。凋亡是引起細胞程序性死亡的主要途徑之一，被認為是冷凍保存失敗，冷凍效率低下的直接原因[27-28]。毛喉素通過保護線粒體穩態、防止氧化應激，有效減輕了凍后早期凋亡的發生，這可能是毛喉素提升冷凍效率的關鍵原因。

本研究證實了通過非侵入式降脂法(降脂劑毛喉素)可有效降低豬卵母細胞內的脂質含量，改善了因冷凍保護劑對水分的不充分置換引起的凍后線粒體機械性損傷，降低了氧化應激與凋亡的發生，從而顯著提升冷凍效率。本研究為化學降脂劑毛喉素在豬卵母細胞冷凍中的應用提供了理論和現實依據。

4 結 論

4.1豬卵母細胞體外成熟培養期間添加毛喉素可降低其胞內脂質含量。

4.2體外成熟培養期間添加毛喉素可減輕冷凍卵母細胞氧化應激與早期凋亡。

4.3體外成熟培養期間添加毛喉素可提升冷凍卵母細胞的存活率和發育潛能。