YAP1在發情期不同繁殖力湖羊子宮內膜中的表達模式及功能分析

王雅涵，鄭宇婧，鐘 沛，李曉丹,2，王 鋒,2*

(1.南京農業大學動物科技學院，南京 210095； 2.南京農業大學 江蘇省家畜胚胎工程實驗室，南京 210095)

湖羊是我國浙江嘉興和太湖流域一帶的優良綿羊品種，是我國一級保護地方畜禽品種，具有性成熟早、多胎高產、生長發育快、肉質鮮嫩等優良特性[1]，受到畜牧工作者的廣泛重視。隨著養羊業被重視程度的提高，開展良種繁育，尤其是提高雌性綿羊繁殖力已成為養羊業持續發展的一個重要決定因素。決定母羊繁殖力的兩個重要因素是排卵率和子宮容受性。子宮是胚胎著床和發育的場所，直接決定著胚胎的命運，因此子宮的發育情況與繁殖力的提升直接相關。已有研究表明，Hippo通路參與卵泡發育，但是其在子宮容受性中的作用尚未見報道。

Hippo通路的核心是一個激酶級聯反應，即Mst1/2激酶和SAV1形成復合體發生磷酸化，進而激活LATS1/2，LATS1/2和MOB1形成復合體發生磷酸化并使YAP1發生磷酸化[2]，研究發現Hippo信號通路參與調控雌性動物的生殖系統發育[3-4]。Hippo通路可通過調控細胞增殖、凋亡及干細胞自我更新來控制器官大小[5-7]。磷酸化的YAP1與細胞質中的蛋白結合并滯留在細胞質中，隨后被泛素化降解，由此抑制YAP1的促生長、抗凋亡等功能。有研究表明，YAP1的激活能夠誘導細胞增殖，并建立一個免疫抑制的局部環境，允許胎兒著床到子宮上皮，保證牛早期妊娠的正常進行[8]。建立良好的子宮容受性有利于早期妊娠的正常進行。但是，YAP1對于湖羊子宮容受性建立的影響未見報道。

子宮內膜基質細胞是子宮組織中含量最多的一種細胞，其分布于子宮腺之間，主要參與蛻膜化過程[9]。子宮內膜基質細胞蛻膜化是一個受多基因調控的子宮內膜基質細胞增殖與分化過程，對胚胎著床、胎盤功能的維持及胎兒的生長發育具有重要作用[10]。線粒體作為細胞內能量供應的重要細胞器，在細胞分化、增殖和凋亡等過程中起著重要作用。但是，YAP1基因對子宮內膜細胞增殖和線粒體功能的影響尚不清楚。

綜上所述，YAP1參與調控機體內多種生理過程的研究已廣泛開展，其能夠參與機體內多項生物學活動，但國內外卻鮮有YAP1對于家畜生殖器官發育影響的研究。因此，本試驗以高、低繁殖力湖羊為研究對象，研究Hippo通路核心因子在不同繁殖力湖羊子宮中的表達差異以及效應基因YAP1對子宮容受性的影響及可能存在的調控機制，闡明Hippo通路在不同繁殖力湖羊子宮中的表達模式及YAP1調控子宮容受性可能存在的分子機制，為高繁殖力母羊的分子培育提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

本試驗所用湖羊來源于江蘇省泰州市海倫羊業有限公司。根據系譜檔案在體況相近、健康的經產母羊中篩選出高繁湖羊群體(連續3胎產3羔)和低繁湖羊群體(連續3胎產1羔)。依據BMPR-1B基因多態性分析將候選湖羊分為3組：FecBBB基因型的高繁和低繁湖羊組(HBB/LBB,n=3)，FecBB+基因型低繁湖羊組(LB+，n=3)。3組湖羊采取單欄飼養，所有動物都被安置在相同的條件下，自由獲得飼料和水。陰道內海綿同步發情周期11 d。利用試情公羊檢測發情行為并記錄，在第二次自然發情時屠宰，并收集子宮內膜、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、松果體、心、肝、脾、肺、腎、肌肉等12個組織，在液氮中迅速冷凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2 YAP1基因的氨基酸和系統進化樹分析

利用NCBI網站獲取并下載山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠的YAP1氨基酸序列，利用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列比對，用MEGA 7.0軟件進行系統進化樹分析。

1.3 細胞培養與轉染

本試驗中子宮內膜基質細胞的分離及鑒定參照文獻[11]。在添加15% FBS的DMEM/F12培養基中培養ESC。用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后制成細胞懸液接種于6孔細胞培養板中，在光學顯微鏡下觀察到細胞密度達到70%左右時，按照Lipofectamine?3000試劑盒說明書將si-NC、si-YAP1轉染至細胞內。si-NC和si-YAP1序列由上海吉瑪公司設計與合成，其具體序列見表1。所有細胞均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，并進行各項指標檢測。

表1 YAP1基因干擾序列Table 1 Sequences of YAP1 gene interference

1.4 RNA提取和熒光定量PCR

用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取子宮組織及轉染si-NC和si-YAP1的ESC內總RNA，分光光度計檢測其純度和濃度(1.8

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequences of genes

1.5 Western blot檢測相關蛋白的表達

細胞轉染72 h后，向6孔板中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，冰上裂解30 min。用細胞刮收集細胞，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性后取10 μg蛋白采用SDS-PAGE電泳分離處理，結束后用半干轉法轉印硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(YAP1抗體，1∶1 000稀釋；Bax抗體，1∶5 000稀釋；Bcl-2抗體，1∶1 000稀釋；ACTB抗體，1∶5 000稀釋)，4 ℃過夜孵育。次日加入二抗(HRP標記的山羊抗兔/鼠IgG，1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，用化學發光法顯色，用ImageJ軟件進行灰度分析。以ACTB作為內參，分析目的蛋白的表達。

1.6 細胞凋亡檢測

利用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，即細胞轉染24 h后，棄培養液，DPBS洗3次，用細胞消化液處理并收集細胞；收集到的細胞再用PBS洗兩次，隨后加入500 μL的Binding Buffer重懸浮細胞，之后加入Annexin V-FITC與PI染液，室溫避光反應5～15 min；最后，用流式細胞術進行檢測。

1.7 統計學分析

本研究所涉及試驗均重復至少3次，試驗數據以“平均值±標準差(mean±SD)”表示。試驗數據先用Excel 2019處理，用GraphPad Prism 8.0軟件分析數據并作圖，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組及以上比較采用單因素方差分析，并且選擇LSD法進行多重比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 高繁(HBB)和低繁(LBB/LB+)湖羊組織中Hippo通路核心基因表達差異

如圖1所示，Hippo通路中的LATS1和MST1基因在高繁湖羊(HBB)子宮內膜組織中的表達量顯著低于低繁(LBB/LB+)湖羊(P<0.05)。MST2基因表達量在高繁(HBB)湖羊和低繁(LBB/LB+)湖羊組織差異不顯著。只有YAP1基因在高繁湖羊(HBB)組織中的表達量顯著高于低繁(LBB/LB+)湖羊(P<0.05)。因此，接下來YAP1基因將作為目的基因進行進一步的探究。

圖中數據為3次生物學重復的“平均值±標準差”。柱上不同小寫字母表示基因表達量在不同繁殖力湖羊間差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene expression levels were significantly different in Hu sheep with different fertility (P<0.05, one-way ANOVA)圖1 高繁(HBB)和低繁(LBB/LB+)湖羊子宮組織中Hippo通路核心基因表達量Fig.1 Relative expression levels of genes in Hippo pathway in uterus of Hu sheep with high or low fertility

2.2 YAP1序列及特征分析

氨基酸序列同源性分析結果(圖2A)顯示，YAP1氨基酸序列與山羊和牛的同源性最高，分別為95.94%和95.04%。系統進化樹分析結果(圖2B)表明，綿羊YAP1蛋白與山羊和牛聚為一組，親緣關系最近。

A. DNAMAN軟件分析綿羊、山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠YAP1的氨基酸序列相似性；B. 綿羊、山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠YAP1的蛋白同源性分析A. The similarity of YAP1 amino acid sequences of sheep, goat, cattle, pig, human, chicken, rat and mouse was analyzed using DNAMAN software; B. Homology analysis of YAP1 protein in sheep, goat, cattle, pig, human, chicken, rat and mouse圖2 湖羊與其他物種YAP1氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of amino acid sequences of YAP1 in different species

2.3 湖羊YAP1基因的組織表達譜分析

通過RT-qPCR檢測了YAP1基因在湖羊子宮、心、肝、腎、下丘腦、肌肉等12種組織中的表達情況(圖3)：YAP1基因在被檢測的12種組織中均有表達，在肌肉中表達量最高，在心中表達量最低。在下丘腦-垂體-生殖軸中，YAP1在子宮中表達僅次于松果體和輸卵管。

圖中數據為3次生物學重復的“平均值±標準差”。柱上不同小寫字母表示基因表達量在不同組織間差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene expression levels were significantly different in different tissues (P<0.05, one-way ANOVA)圖3 湖羊YAP1基因組織表達分析Fig.3 Expression analysis of YAP1 gene in various tissues of Hu sheep

2.4 si-YAP1干擾效率檢測

RT-qPCR結果(圖4A)顯示，較si-NC組，si-YAP1組中YAP1 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結果(圖4B)顯示，轉染si-YAP1后，YAP1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。以上結果顯示si-YAP1能夠有效地抑制YAP1的表達，可用于后續試驗。

圖中數據為3次生物學重復的“平均值±標準差”。柱上不同小寫字母表示基因及蛋白表達量在試驗組和對照組間差異顯著(P<0.05，獨立樣本t檢驗)。下同Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene and protein expression levels were significantly different between test group and control group (P<0.05, independent-samples t test). The same as below圖4 YAP1基因的siRNA干擾效率檢測Fig.4 Detection of siRNA interference efficiency of YAP1 gene

2.5 YAP1對子宮容受性相關基因表達的影響

如圖5所示，干擾YAP1基因能夠顯著下調FOXO1、PRL、VEGF和OPNmRNA的表達水平(P<0.05)，顯著上調COX-2 mRNA的表達水平(P<0.05)。

圖5 干擾YAP1對子宮內膜基質細胞容受性相關基因表達的影響Fig.5 Effects of YAP1 interference on receptivity related genes expression in endometrial stromal cells

2.6 YAP1對子宮內膜基質細胞凋亡的影響

如圖6所示，干擾YAP1后，子宮內膜基質細胞的凋亡率顯著上升(圖6A)。RT-qPCR結果(圖6B)顯示，干擾YAP1顯著上調了子宮內膜基質細胞中Bax、BIM、p53、caspase3、caspase8、caspase9的mRNA表達水平(P<0.05)，顯著降低了Bcl-2的mRNA表達水平(P<0.05)，且Bax/Bcl-2的比值顯著升高。Western blot結果(圖6C)顯示，干擾YAP1后Bax的蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值也顯著升高(P<0.05)。

A.流式細胞術分析干擾YAP1對子宮內膜基質細胞凋亡的影響；B.干擾YAP1對子宮內膜基質細胞凋亡相關基因表達的影響；C.干擾YAP1后Bax和Bcl-2蛋白表達情況變化。數據結果以“平均數±標準差”表示且以si-NC為對照A. Endometrial stromal cell apoptosis was detected after interfering YAP1 gene by flow cytometer; B. Effects of YAP1 interference on mRNA relative expression of apoptosis-related genes in endometrial stromal cells; C. Effects of YAP1 interference on Bax and Bcl-2 proteins expression in endometrial stromal cells. The results are expressed relative to the si-NC group as “mean±SD”圖6 干擾YAP1對湖羊子宮內膜基質細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of YAP1 interference on the apoptosis of Hu sheep endometrial stromal cells

2.7 干擾YAP1對子宮內膜基質細胞線粒體功能相關基因的影響

如圖7所示，干擾YAP1后FIS1、DNM1L的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，MFN2、PPARGC1A、OPA1的mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，MFN1的mRNA表達水平無顯著變化。

圖7 干擾YAP1對子宮內膜基質細胞線粒體功能相關基因表達的影響Fig.7 Effects of YAP1 interference on mRNA relative expression of mitochondrial function related genes in endometrial stromal cells

3 討 論

近年來，YAP1參與調控機體內多種生理過程的研究已廣泛開展，但YAP1在子宮容受性中的研究尚未見報道。本試驗首先通過對不同繁殖力湖羊子宮組織中Hippo通路的關鍵基因進行定量，篩選出在高繁殖力湖羊子宮組織中顯著高表達的效應基因YAP1；接下來對YAP1的序列特征進行分析；最后通過功能缺失試驗探究YAP1基因影響子宮容受性潛在的分子機制。本試驗發現，YAP1能夠抑制子宮內膜基質細胞的凋亡從而有利于子宮容受性的建立。

Hippo通路是一個高度保守的信號傳導通路，能夠調控細胞的增殖、分化和死亡，進而調控器官的發育。有研究表明，Hippo通路與子宮內膜重構和子宮內膜微環境調節等有關，YAP1的活化提供早期妊娠所需環境，對雌性動物生殖力的維持至關重要；且對于奶牛子宮損傷后修復有重要作用[12]。在本試驗中，檢測Hippo通路核心因子MST1、MST2、LATS1及主要效應因子YAP1在高繁和低繁湖羊組織中的表達量，發現僅有YAP1的表達量在高繁湖羊中高于低繁湖羊，因此推測，在Hippo通路中，YAP1是影響湖羊子宮發育及容受性，進而導致繁殖力差異的主要因子。

子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎的接受能力，是完成妊娠的必要條件之一[13]。胚胎植入過程中最顯著的現象是胚泡植入部位血管通透性顯著增加，一般認為，這是胚胎植入早期必備條件之一[14]。而新血管的形成是成功維持妊娠的基礎[15]，VEGF作為一種有效的血管生成因子發揮著核心作用，通過調控血管生成促進胚胎的成功植入。已證實，FOXO1通過MST1-FOXO1級聯建立內皮細胞極性，在血管生成中起關鍵作用[16]。FOXO1作為血管生成的重要調節因子，可直接調節其他組織中VEGF的表達[17]。近期有研究表明，YAP已經被確定為將VEGF/VEGFR2信號轉導到特定轉錄程序中的主要調節劑，這對血管形成至關重要[18]。在VEGF誘導的血管生成中，VEGFR-2可以與整合素αvβ3相互作用[19]。整合素αvβ3是胚胎植入過程中的重要黏附分子，糖蛋白骨橋蛋白(OPN)是其配體糖蛋白，胚胎整合素αvβ3與子宮內膜OPN的相互作用被認為參與了胚胎與子宮內膜腔上皮的黏附[20]。COX-2是胚囊著床時唯一可以在子宮內膜上皮和基質細胞中表達的環氧化酶，其可以促進著床部位的內膜血管再生以及血管通透性增加，有利于胚胎植入與妊娠的建立[21]。此外，在小鼠中，敲除COX-2后，野生型囊胚未能植入，且正常的蛻膜化反應受損，這表明COX-2在植入過程中發揮了重要作用[22]。在妊娠各期，前列腺素都可以促進子宮平滑肌收縮，COX-2的過度表達可能會導致前列腺素表達上升，降低子宮內膜容受性。分泌性子宮內膜通過黃體酮的直接作用合成PRL，在黃體晚期達到最大產量，誘導孕酮介導的基質細胞蛻膜。同時，在蛻膜過程中，子宮內膜基質細胞產生的PRL對造血細胞有顯著的促增殖和抗凋亡作用[23]。本研究中，沉默YAP1后FOXO1、VEGF、PRL和OPNmRNA水平明顯降低，而COX-2 mRNA水平明顯升高，說明YAP1可能有增加子宮內膜血管通透性、增加子宮與胚胎黏附性，減少前列腺素分泌，抑制子宮收縮，促進PRL分泌，促進子宮蛻膜化，從而維持妊娠的作用。

細胞的凋亡受到細胞內凋亡蛋白的調控，是一個極其復雜的生理過程。caspase是一組促使細胞凋亡的蛋白酶，在細胞凋亡機制網絡中處于核心地位。caspase3是caspase級聯反應下游中的一個關鍵凋亡蛋白酶，可被caspase8、caspase9等活化，能夠激活外源性細胞凋亡途徑和由線粒體調節的內源性凋亡途徑[24]。在細胞凋亡進程中，Bcl-2家族也發揮重要作用，有研究者提出Bax/Bcl-2可以體現細胞在受凋亡刺激后的存活比例[25]，比值降低，能減少細胞凋亡數量，相反則增加細胞凋亡數量。BIM是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員之一[26]，能結合并轉位凋亡蛋白Bax到線粒體上，促進細胞凋亡。p53也是重要的細胞凋亡調節因子，通過調節Bax和Bcl-2誘導細胞凋亡[27]。Bax蛋白是組成線粒體膜上離子通道的部分，能夠幫助細胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase級聯反應，促進細胞凋亡。而Bcl-2作為凋亡抑制基因，能夠阻止上述過程，抑制細胞凋亡[28-29]。研究發現，抑制YAP1能夠加快人宮頸癌Hela細胞的凋亡，這可能與激活p53及Fra-1基因相關[30]。通過靶向抑制劑CA3抑制肝癌HepG2細胞中YAP1的轉錄活性后發現，Bcl-2表達降低，Bax、caspase3表達升高，HepG2細胞增殖受到抑制、凋亡率增加[31]。本試驗中，干擾YAP1基因后細胞凋亡率明顯升高，RT-qPCR檢測發現p53、caspase3、caspase8、Bax的mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2 的mRNA水平明顯降低，Bax/Bcl-2比值明顯上升。以上結果與前人在其他不同細胞類型上的研究結果相似，說明YAP1的表達會對細胞凋亡過程產生抑制作用。干擾YAP1后線粒體的融合可能受到阻礙，從而導致線粒體紊亂，觸發凋亡級聯反應。細胞凋亡的兩種主要途徑是內在的線粒體途徑和外在的死亡受體途徑，內在和外在途徑都會受到p53的調控且這兩種途徑最終都會導致caspase蛋白酶家族的激活，YAP1的表達可在一定程度上抑制這兩種途徑的激活。

線粒體是細胞的“能量工廠”，通過不斷分裂和融合，能夠調節膜電位，間接決定著組織細胞的功能甚至存亡[32]。其中，FIS1是線粒體分裂的重要調節因子，介導線粒體分裂復合物的組裝，參與線粒體分裂，是線粒體融合分裂過程中重要的蛋白質。DNM1L也是線粒體分裂體系的重要組成成分，其可與不同物種的多種分子之間相互作用組裝成高級結構，并定位于線粒體中，引起線粒體膜的融合和分裂[33]。線粒體融合過程包括外膜融合和內膜融合兩步，外膜融合主要依靠線粒體外膜中的GTPase蛋白MFN1和MFN2來完成，內膜融合則是由OPA1來完成[34]。研究表明，YAP1通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PPARGC1A)調節小鼠血管生成[35]，PPARGC1A是介導線粒體功能的主要參與者，在線粒體增殖和呼吸等生化途徑中起著十分重要的作用[36]。本研究中，MFN2、OPA1和PPARGC1A mRNA水平明顯下調，DNM1L和FIS1 mRNA水平明顯上調，表明YAP1可能通過提高子宮內膜基質細胞內線粒體的活性調節線粒體的生物合成，進而促進子宮的生長發育和容受性。

本研究發現，YAP1基因在高繁湖羊組織中的表達量顯著高于低繁湖羊。在下丘腦-垂體-生殖軸中，YAP1在子宮中的表達僅次于松果體和輸卵管。干擾YAP1基因能夠顯著下調FOXO1、PRL、VEGF、OPN、Bcl-2、MFN2、PPARGC1A、OPA1 mRNA的表達水平，顯著上調COX-2、Bax、BIM、p53、caspase3、caspase8、caspase9、FIS1、DNM1L mRNA的表達水平。所以，沉默YAP1基因后細胞凋亡率升高，促凋亡基因和蛋白的表達增加，抗凋亡基因和蛋白的表達降低。同時，促線粒體融合基因表達降低，促線粒體分裂基因表達升高，不利于線粒體正常功能的發揮。因此，干擾YAP1可能會對胚胎著床和妊娠維持產生不利影響。

4 結 論

本研究結果表明，沉默YAP1基因后細胞凋亡率升高，增加了促凋亡基因和蛋白的表達，降低了抗凋亡基因和蛋白的表達。同時，促線粒體融合基因表達降低，促線粒體分裂基因表達升高，不利于線粒體正常功能的發揮。因此，干擾YAP1可能會對胚胎著床和妊娠維持產生不利影響，提示YAP1可以從影響子宮內膜血管生成及通透性、細胞凋亡和線粒體融合這3個途徑調控湖羊子宮的發育及容受性。抑制Hippo通路，提高YAP1基因表達量可能提高子宮容受性，有利于子宮發育，從而有利于湖羊高繁殖性能的發揮。