GnIH基因克隆、表達及對幼齡公兔生殖激素的影響

桑 雷，陳冬金，孫世坤，高承芳，王錦祥，陳巖鋒，謝喜平*

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福州 350013； 2.福建省畜禽遺傳育種重點實驗室，福州 350013)

閩西南黑兔(Oryctolaguscuniculus)是福建省少數幾個進入國家畜禽遺傳資源目錄的地方肉兔品種資源，其毛色全黑，體軀短小，兩耳直立，眼大有神，主要分布于福建省龍巖市和泉州市等地區的山區。閩西南黑兔肉質鮮美，在閩西和閩南一帶常以白宰和燉酒食用，是民間酒席上的佳肴，深受當地市場的歡迎[1]。

促性腺激素抑制素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)是最早由Tsutsui等[2]發現的一種抑制鵪鶉垂體促性腺激素(gonadotropin, GTH)釋放的下丘腦RF-酰胺神經肽(SIKPSAYLPLRFa)，由GnIH前體蛋白裂解產生。不同動物的GnIH成熟肽均是由GnIH基因編碼的前體蛋白經過酶切加工產生，具有C末端LPXRFa酰胺特征基序[3]。GnIH主要分布于包括鳥類、哺乳動物以及魚類在內的脊椎動物下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)，其通過減少脊椎動物的GTH的合成和釋放，進而影響生殖激素的分泌、性腺的發育和形成以及性行為的表現[4-9]。鳥類GnIH神經元細胞體主要集中在下丘腦室旁核，其神經纖維幾乎延伸至整個前腦、中腦和間腦等區域，GnIH神經元投射最密集區域為正中隆起外層，在此區域與促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)、阿片黑皮質激素原(proopio-melanocortin， POMC)、神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)、親吻肽(kisspeptin，Kiss1)和食欲素(orexin，OX)等諸多神經元緊密聯接。哺乳動物的GnIH神經纖維的細胞體集中在下丘腦背內側核，神經纖維投射到視前核和杏仁核中部、終紋床核、室旁核、弓狀核、腹內側核以及正中隆起[9-10]。在小鼠、倉鼠、綿羊、靈長類動物的大腦內，40%～80%的GnRH細胞與GnIH纖維緊密聯系，GnIH可以通過作用于下丘腦GnRH神經元進而調控GTH的合成與分泌[11-16]。除了作用于哺乳動物下丘腦外，GnIH被報道可以通過結合垂體上受體G蛋白耦聯受體147(G-protein coupled receptor 147，GPR147)對GTH及其下游膽固醇激素進行調控[4, 17-20]。在羊、大鼠、牛的原代垂體細胞均檢測到GPR147的存在，添加GnIH都能抑制GnRH刺激的促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的釋放[5, 13, 21-23]。在羊中，GnIH還能直接降低原代垂體細胞卵泡刺激素β亞基(follicle stimulating hormone subunit beta，FSHβ)和促黃體素β亞基(luteinizing hormone subunit beta，LHβ)的合成，消除GTH細胞內GnRH激活的Ca2+活動，中和GnRH刺激的LHmRNA升高[13]。此外，將GnIH過表達質粒轉染至小鼠睪丸間質細胞中會降低睪酮合成相關酶-類固醇合成快速調節蛋白(steroidogenic acute regulatory，StAR)、P450側鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450 scc)和3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)基因的表達量進而抑制睪酮的分泌[24]。綜上所述，GnIH可以調控哺乳動物下丘腦神經元釋放GnRH以及抑制垂體GTH細胞合成和釋放LH和FSH。

目前，鵪鶉(967 bp)[25]、小鼠(818 bp)[26]、人(1 190 bp)[26]、豬(1 124 bp)[27]等物種的GnIHcDNA全長陸續被克隆和測序，家兔方面，只有劉晶[28]獲得了家兔GnIHcDNA部分序列(389 bp)，然而未獲得完整的cDNA序列。因此，本試驗以閩西南黑兔為研究對象，通過RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術克隆GnIH基因完整cDNA序列，分析其基因功能，再根據獲得序列信息設計引物，檢測GnIH基因在各個組織以及不同發育階段下丘腦中的表達水平，確定GnIH基因表達規律，并在此基礎上通過腹腔注射鵪鶉GnIH相關肽，研究其對幼齡公兔血清中生殖激素的影響，以期為下一步探究GnIH對兔生殖發育的調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗分為兔GnIH基因cDNA全長克隆與序列分析、GnIH基因mRNA表達分析以及GnIH相關肽對幼齡公兔生殖激素的影響3部分。其中：1)GnIH基因cDNA克隆與序列分析試驗主要以90日齡公兔為研究對象，通過RACE技術克隆兔GnIH基因cDNA序列，并對序列進行生物信息學分析；2)GnIH基因mRNA表達分析試驗，主要分析該基因在90日齡公兔的不同組織表達水平以及11～150日齡公兔下丘腦中的表達水平；3)GnIH相關肽對公兔生殖激素的影響試驗，主要研究腹腔注射公兔0、0.5、5以及50 μg 鵪鶉GnIH相關肽后，公兔血清中包括睪酮在內的生殖激素以及睪丸睪酮合成相關酶基因mRNA的變化。

1.2 試驗動物與樣品采集

本次試驗的樣品均采自福建省農業科學院畜牧獸醫研究所智能化兔舍試驗平臺的閩西南黑兔群體。樣品包括：1)5只90日齡健康公兔的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸、下丘腦、垂體、背肌、脂肪；2)同一批次公兔分別在11、30、60、90、120、150日齡時隨機選擇6只屠宰，采集下丘腦組織備用；3)同一批次40只公兔隨機分為4組，在80日齡時分別腹腔注射0、0.5、5和50 μg的GnIH相關肽(Quail GnIH related peptide 1， Phoenix Pharmaceuticals, 美國)，連續注射10 d，第11天早上采集耳靜脈血液，隨后屠宰，剝離睪丸組織備用。

1.3 RNA的提取和cDNA合成

利用總RNA提取試劑盒(Invitrogen, 美國)提取兔各組織的總RNA，加入DNase I(Takara，日本)進行消化，RNA的含量和純度使用凝膠電泳和Nanodrop 2000紫外分光光度計(Thermo Scientific，美國)進行檢測，并調整總RNA質量濃度至1 μg·μL-1。取出2 μL總RNA，利用SuperScriptTMII反轉錄酶(Invitrogen, 美國)和Oligo (dT)18反轉錄成cDNA，用于克隆GnIH全長cDNA序列的中間片段或熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)檢測。使用閩西黑兔下丘腦組織RNA，根據SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)說明書分別合成5′-RACE和3′-RACE的cDNA模板，用于5′和3′末端序列的克隆。

1.4 兔GnIH基因全長cDNA序列克隆

參考兔GnIH基因預測序列(GenBank：XM_002713827.2)設計保守區段的擴增引物(表1)，以兔下丘腦cDNA為模板，通過PCR擴增獲得其中間序列。PCR反應體系(50 μL)：模板(cDNA原液)1 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、1.25 U·μL-1DNA聚合酶1 μL，滅菌超純水21 μL。反應條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，35個循環。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中檢測，然后送上海博尚生物技術有限公司進行測序。根據所獲得兔GnIH基因的中間序列，設計5′-RACE和3′-RACE特異引物(表1)。5′-RACE和3′-RACE PCR反應按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)說明書進行。將擴增的片段分別切膠純化回收后，連接到T-Vector pMDTM20載體(TaKaRa，日本)，經菌落PCR篩選后挑取克隆送上海博尚生物技術有限公司進行測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

用DNAStar 8.0中的SeqMan拼接5′-RACE、3′-RACE和中間序列，得到GnIH基因的cDNA全長，并根據獲得cDNA全長序列重新設計引物，通過PCR擴增后測序驗證。驗證PCR反應體系(50 μL)：模板2 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、1.25 U·μL-1DNA聚合酶1 μL,滅菌超純水20 μL。驗證PCR反應條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，35個循環。

1.5 兔GnIH生物信息學分析

使用Expasy網站(https://web.expasy.org/)在線軟件ProtParam和Protscale分別分析兔GnIH前體蛋白的理化性質和親-疏水性。利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預測GnIH前體蛋白的二級結構以及用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)預測其三級結構。使用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進行信號肽預測。使用MegAlign軟件對閩西南黑兔、人(NP_071433.3)、獼猴(ACF58053.1)、黑猩猩(PNI40345.1)、馬(XP_001498898.1)、虎鯨(XP_004265697.1)、熊貓(XP_002912906.2)、樹鼩(XP_006162460.1)、灰海豹(XP_035953085.1)、九帶犰狳(XP_004447617.1)、北極熊(XP_008684635.1)、犬(NP_001279989.1)、綿羊(NP_001120740.1)、大鼠(NP_076442.1)、雞(BAC87781.1)、豬(ADM12803)、日本鵪鶉(BAB15932.1)以及斑馬魚(NP_001076418.1)的GnIH前體蛋白的氨基酸序列進行同源性比對，應用MEGA-X軟件中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建GnIH前體蛋白的系統進化樹，并基于Ubuka和Parhar(2017)[29]報道現有脊椎動物的GnIH前體蛋白分解產生的RF-酰胺相關肽(RFamide-related peptide，RFRPs)和GnIH序列，預測閩西南黑兔相關RFRPs序列。

1.6 GnIH在公兔不同組織的表達譜

根據克隆獲得的GnIH基因序列設計引物(表1)，使用qPCR方法檢測GnIH基因在90日齡健康公兔的不同組織(心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸、下丘腦、垂體、背肌、脂肪)以及不同日齡(11、30、60、90、120、150日齡)健康公兔下丘腦組織中的表達水平。以兔GAPDH基因(NM_001082253.1)為內參基因，引物表見表1。qPCR擴增體系：模板cDNA 1 μL，Power SYBR?Green PCR Master Mix(ABI，美國)10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌超純水8 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，40個循環；熔解曲線為55 ～95 ℃，每10 s增加0.5 ℃。每個樣本重復3次，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt法進行后續分析。

1.7 GnIH對公兔生殖激素分泌的調控

將采集的耳靜脈血4 ℃ 3 000 r·min-1離心20 min后取其上清，-20 ℃貯存。采用上海紀寧兔促性腺激素釋放激素(GnRH)試劑盒(ELISA)、兔促卵泡素(FSH)試劑盒(ELISA)、兔黃體生成素(LH)試劑盒(ELISA)、兔睪酮(T)試劑盒(ELISA)和兔抑制素B(INHB)試劑盒(ELISA)檢測血清中GnRH、FSH、LH、睪酮(testosterone，T)和抑制素B亞基(inhibin β subunit，INHB)的含量。

1.8 GnIH多肽對睪酮合成相關酶基因mRNA表達的影響

檢測兔StAR、p450scc和3β-HSD基因在睪丸中的mRNA表達量。根據NCBI提供的兔StAR(XM_017350352.1)、p450scc(XM_008253734.2)和3β-HSD(XM_002715682.3)基因序列設計引物(表1)，并以兔GAPDH基因(NM_001082253.1)為內參基因，引物表見表1。qPCR擴增體系：模板cDNA 1 μL，Power SYBR?Green PCR Master Mix(ABI，美國)10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌超純水8 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，63 ℃退火25 s，40個循環；熔解曲線為55 ℃～95 ℃，每10 s增加0.5 ℃。每個樣本重復3次，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt法進行后續分析。

1.9 數據分析

用SAS 9.4軟件GLM模型分析qPCR和激素檢測結果，結果以“平均數±標準誤”表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01和P<0.001表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 兔GnIH cDNA全長序列克隆

克隆獲得的cDNA序列片段經DNAMAN拼接后，得到兔GnIHcDNA全長序列為904 bp，其中5′UTR、cDNA和3′UTR分別為41、606和227 bp，還有一個poly(A)尾巴；編碼201個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。序列已提交到GenBank，登錄號為MK403675.1。

2.2 兔GnIH前體蛋白氨基酸序列理化性質分析

兔GnIH前體蛋白的理化性質和親-疏水性分析結果顯示，蛋白分子式為C995H1 592N294O305S11，分子量為22.9 ku，共編碼201個氨基酸，理論等電點為9.1。帶正電荷殘基總數(精氨酸+賴氨酸，Arg+Lys)為29個，帶負電荷的殘基總數(天冬氨酸+谷氨酸，Asp+Glu)為24個。在哺乳動物網織紅細胞體外半衰期為30 h。不穩定系數為74.85，親水性平均系數為-0.838，脂肪系數為61.89。

2.3 GnIH前體蛋白質結構域和信號肽預測

二級結構預測結果顯示，GnIH前體蛋白只含有α螺旋和無規則卷曲2種二級結構(圖1)。預測GnIH前體蛋白潛在的Sec信號肽(Sec/SPI)概率分值為0.686 2，裂解位點在第26位半胱氨酸和27位天冬氨酸之間，概率分值在0.400 5，此位置恰好在α螺旋與無規則卷曲連接處(圖2)。

A.二級結構預測；B.三級結構預測A. Secondary structure prediction; B. Tertiary structure prediction圖1 兔GnIH前體蛋白結構分析Fig.1 Structure analysis of rabbit GnIH precursor

圖2 兔GnIH前體蛋白信號肽預測Fig.2 Predicted signal peptide of rabbit GnIH precursor

2.4 系統進化樹構建和一致性分析

在進化上，兔GnIH前體蛋白與嚙齒目大鼠的關系最近，與雞、日本鵪鶉以及九帶犰狳和斑馬魚關系較遠(圖3)。與大鼠、人、獼猴、馬以及鵪鶉和雞等動物GnIH前體蛋白中RFRPs和GnIH短肽氨基酸序列比較，發現兔GnIH前體蛋白中可能存在RFRP1(RFamide-related peptide 1，RF氨基相關肽1)、RFRP2(RFamide-related peptide 2，RF氨基相關肽2)和RFRP3(RFamide-related peptide 3，RF氨基相關肽3)3種GnIH同源類似物，其氨基酸序列分別為MPHAAATLPLRF、SPQPVANLPLRF和IPNLPQRF(圖4)。

方框表示已知的RFRPs和GnIHs氨基酸序列；虛線表示預測閩西南黑兔RFRPs氨基酸序列The identified amino-acid sequences of RFRPs and GnIHs are boxed in solid lines；The predicted amino-acid sequences of RFRPs from Minxinan black rabbits are boxed in dashed lines圖4 兔GnIH前體蛋白的RFRPs氨基酸序列預測Fig.4 Prediction of amino-acid sequences of rabbit RFRPs in GnIH precursor

圖3 GnIH前體蛋白系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GnIH precursor

2.5 GnIH基因在公兔不同組織中的表達分析

使用qPCR法檢測GnIH基因在90日齡公兔不同組織中的表達情況，結果如圖5A所示，GnIH在下丘腦、脾、腎、垂體、背肌、肝、肺和小腸中均有表達，其中，下丘腦中的相對表達量最高，并且極其顯著高于其他組織(P<0.001)，表示GnIH基因可能在下丘腦中發揮重要的生理作用。

*.表示差異顯著(P<0.05)，**、***.表示差異極顯著(P<0.01,P<0.001)，下同。A. GnIH基因在不同組織中的表達；B. GnIH基因在出生后不同發育階段下丘腦中的表達*. indicate significant differences (P<0.05), **, ***. indicate extremely significant differences (P<0.01, P<0.001), the same as below. A. Expression pattern of GnIH gene in different tissues; B. Expression pattern of GnIH gene at different developmental phases of hypothalamus圖5 GnIH基因在公兔不同組織和不同發育階段下丘腦中表達Fig.5 Expression patterns of GnIH gene in different tissues and hypothalamus at different developmental phases from male rabbits

2.6 GnIH基因在公兔出生后下丘腦中的表達

使用qPCR法檢測GnIH基因在不同日齡公兔下丘腦中的表達，結果見圖5B，出生后GnIH基因的表達量隨著日齡增長而降低，在90日齡GnIH的表達量降至最低(P<0.01)，隨后出現拐點，表達量隨著日齡增長極顯著增加(P<0.001)。

2.7 GnIH多肽對公兔體內生殖激素分泌的影響

通過檢測血清中生殖激素的濃度發現，GnRH濃度各劑量組間差異不顯著(P>0.05，圖6A)；FSH濃度，5和50 μg劑量組均高于0.5 μg劑量組(P<0.05)，其中50 μg劑量組和0.5 μg劑量組差異極顯著(P<0.01，圖6B)；LH濃度，50 μg劑量組顯著高于對照組(P<0.05，圖6C)；INHB濃度，各劑量組間差異不顯著(P>0.05，圖6D)；T濃度，50 μg劑量組極顯著低于對照組和0.5 μg劑量組(P<0.001)，5 μg劑量組顯著低于對照組和0.5 μg劑量組(P<0.05，圖6E)。

A.GnIH對GnRH濃度的影響；B.GnIH對FSH濃度的影響；C.GnIH對LH濃度的影響；D.GnIH對INHB濃度的影響；E.GnIH對T的影響A. Effect of GnIH on the concentration of GnRH; B. Effect of GnIH on the concentration of FSH; C. Effect of GnIH on the concentration of LH; D. Effect of GnIH on the concentration of INHB; E. Effect of GnIH on the concentration of T圖6 不同注射劑量GnIH相關肽對生殖激素濃度的影響Fig.6 Effects of different injected doses of GnIH related peptide on the concentrations of reproductive hormones

2.8 GnIH相關肽對睪丸組織睪酮合成關鍵酶mRNA表達量的影響

經qPCR檢測發現，5 μg劑量組的p450scc mRNA表達量極其顯著高于其他劑量組(P<0.001)，而注射GnIH相關肽并未引起StarR和3β-HSD這兩個基因mRNA表達量發生顯著變化(P>0.05，圖7)。

A.GnIH對StAR 基因mRNA表達量的影響；B.GnIH對3β-HSD基因mRNA表達量的影響；C.GnIH對p450scc基因mRNA表達量的影響A. Effect of GnIH on the relative StAR mRNA levels; B. Effect of GnIH on the relative 3β-HSD mRNA levels; C. Effect of GnIH on the relative p450scc mRNA levels圖7 不同注射劑量GnIH對睪酮合成相關酶基因mRNA表達量的影響Fig.7 Effects of different injected doses of GnIH on the relative mRNA levels of testosterone synthetic enzyme genes

3 討 論

劉晶[28]通過RT-PCR方法克隆得到了新西蘭兔GnIH基因389 bp的 cDNA序列，且核苷酸序列與綿羊、牛、獼猴、人、豬、小鼠有較高的同源性(>75%)，可見GnIH基因在不同物種間具有一定的保守性，然而，該報道僅僅上傳了GnIH基因部分cDNA序列，影響了后續驗證。本研究以閩西南黑兔為試驗材料，利用RACE技術克隆得到了兔GnIH基因的cDNA全長(904 bp)，通過序列比對發現，一部分序列與前人上傳的序列完全一致，這填補了兔GnIH基因cDNA不完整的缺陷，從而為后續相關研究奠定了基礎。GnIH前體蛋白有較高的同源性，本研究根據已知的人、獼猴、大鼠、馬以及鳥類GnIH相關肽及RFRPs序列[29]，預測兔GnIH前體上可能存在3種同源蛋白，分別為RFRP1、RFRP2和RFRP3。

本研究通過qPCR檢測了GnIH基因在閩西南黑兔公兔不同組織中的表達，組織表達譜分析顯示，該基因在下丘腦、脾、腎、垂體、背肌、肝、肺和小腸中均有表達，在下丘腦中表達最高，與鳥類、豬及小鼠[7, 9, 12, 30-31]中的研究結果相類似。鵪鶉、家雀等鳥類免疫組化和原位雜交結果顯示，GnIH神經元主要分布于下丘腦室旁核[28, 31-32]，小嚙齒類動物下丘腦也是GnIH陽性細胞高度分布區域[4-5, 11, 16, 31, 33-37]，此外，綿羊的室旁核和恒河猴的視上核、室旁核和弓狀核以及下丘腦背側區均發現GnIH陽性纖維[13, 15]。本試驗檢測到GnIH基因在閩西南黑兔公兔下丘腦中表達水平呈現先下降后上升的趨勢，表達量隨著出生后日齡的增加逐漸降低，直至90日齡后才逐漸升高。根據《福建省地方畜禽品種資源志》上的記載，閩西南黑兔公兔在3月齡有性行為表現，通常3.5～4.5月齡達到性成熟[1]。豬和倉鼠GnIH表達量與發育狀態顯著相關[38-39]，小丑魚成熟期下丘腦GnIHmRNA表達量遠高于發育期[40]。因此，GnIH的表達量可能與閩西南黑兔公兔生殖發育有一定的相關性。

GnIH對HPG軸抑制或刺激作用取決于動物生殖發育階段和內源性膽固醇激素水平[3]。在小鼠電生理研究中，GnIH對41%的成年小鼠GnRH神經元放電有抑制作用以及對12%的GnRH神經元放電有刺激效果，其中，對發情前期18%小鼠GnRH神經元有刺激作用，但是對發情期的GnRH小鼠神經元沒有刺激作用[41]。GnRH神經元和GTH細胞上的GnRH和GnIH受體及雌激素膜受體(membrane estrogen receptor,mER)均屬于A類G蛋白偶聯受體(class A GCPRs，G-protein coupled receptor)，它們除了在細胞膜上以單體或者同源二聚體的形式存在，還能與其他GPCR組成異聚體，但是會導致與配體結合的親和力、信號傳導及受體內化發生改變[3, 42-43]。研究表明，發育前的閹割母鼠經過E2處理后，注射GnIH引起血液中LH濃度的降低；而給未經E2處理的閹割母鼠注射GnIH，血液中LH濃度則未發生變化[44]。此外，據Iqbal等[45]報道，低濃度E2能阻止GnRH誘導的綿羊垂體細胞內自由Ca2+濃度上升及LH的釋放，Rudolf和Kadokawa[46]在牛腺垂體促性腺細胞中也發現類似現象。長期注射GnRH或其拮抗劑會使金錢魚和鯧參魚垂體GTH細胞產生耐受性，下調GnRH受體，抑制血清中LH、FSH和類固醇激素的水平[47-48]。在魚類中，GnIH對垂體的刺激作用可能與給藥時間、濃度或不同種類LPXRFa多肽的拮抗作用有關[49]。長期注射GnIH的短日照西伯利亞倉鼠公鼠的睪丸重量和血清中的睪酮濃度會逐漸恢復到正常值，可能也是因為下丘腦和垂體中GnIH受體下調引起的[50]。本試驗通過給發情前期公兔注射GnIH相關肽后發現，5和50 μg劑量組血清中T濃度顯著低于對照組和0.5 μg劑量組(P<0.05)，可能是GnIH在E2的配合下短時間內對GnRH神經元和GTH細胞負調控導致的。連續10 d給藥后，外周血中的50 μg劑量組LH濃度和5 μg劑量組睪酮合成限速酶p450scc基因的表達量顯著上升(P<0.05)，可能由于長期注射GnIH會下調GnRH神經元和GTH細胞上的GnIH受體數量，導致GnRH神經元和GTH細胞對GnIH不敏感。此外，外周血中T濃度顯著降低后，腦部芳香化酶神經元合成的E2減少，導致GnIH抑制效果顯著減弱。

4 結 論

本研究克隆得到兔GnIH基因cDNA序列，全長904 bp，編碼201個氨基酸，序列比對發現該基因在進化過程中具有較高的保守性。GnIH基因在大部分組織均有表達，其中在下丘腦中表達最高，出生后隨著日齡增加逐漸減少，90日齡后則逐漸增加。在鵪鶉GnIH相關肽注射幼齡公兔后，短時間促使外周血中T濃度顯著下降，同時由于長期注射藥物，公兔對GnIH不敏感，血液中的LH濃度和睪丸中睪酮合成相關酶基因p450scc的mRNA表達量顯著上升，基于以上結果推測，GnIH基因可能與兔LH和睪酮的分泌與合成有關，并參與公兔的生殖發育調控，長期注射GnIH相關肽會導致公兔對藥物不敏感，其具體調控機制還需后續研究。