捻轉血矛線蟲重組磷脂酰肌醇轉移蛋白對山羊外周血單個核細胞模式識別受體和細胞因子轉錄水平的影響

謝欣然，張 玥，陸明敏，徐立新，宋小凱，李祥瑞，嚴若峰

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)寄生于反芻動物第四胃，以吸食宿主血液為生，破壞胃黏膜，引發貧血等臨床癥狀，導致動物生長緩慢，重癥可致死亡，廣泛分布于全球各地，給畜牧業發展帶來嚴重危害[1-2]。

磷脂酰肌醇轉移蛋白(phosphatidylinositol transfer protein， PITP)是一類能夠在膜之間轉移磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)的脂質轉移蛋白[3]，參與質膜上普遍存在的由G蛋白偶聯受體介導的磷脂酰肌醇信號通路，該信號通路中4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)是由PI依次通過磷脂酰肌醇4-激酶(phosphatidylinositol 4-kinase, PI4K)和磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase, PI4P5K)兩種脂質激酶的磷酸化而產生，最終磷脂酶C(phospholipase C, PLC)消耗的是PI，而PI是在內質網上轉化而成，這2種激酶又都位于質膜上，因此將PI運送至質膜至關重要，通常認為可以通過PITP來進行運輸[4-5]。已有研究證明PITPα亞型能夠維持PIP2的水解以支持該通路的信號傳導[6-7]，并與催化PIP2生成的PI4P5K一起發揮作用[8-9]，還發現其為胞吐過程所需的關鍵因子[9-10]。目前已發現定位于感覺神經元突觸的秀麗隱桿線蟲PITP同源物能夠通過轉運PI使該通路成功合成二酰基甘油(diacylglycerol, DG)，從而調節突觸傳遞，調節味覺、嗅覺等多種感覺刺激產生的效應行為[11]，同時該蛋白能夠通過磷脂酰肌醇-4-磷酸(phosphatidylinositol 4-phosphate，PI4P)和磷脂酸(phosphatidic acid，PA)控制DG的產量，限制蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的活性，引起缺氧后邊緣行為的快速恢復等神經效應[12]。

實驗室前期從捻轉血矛線蟲外泌體蛋白質譜分析結果中鑒定出了磷脂酰肌醇轉移蛋白，但對其分泌原因與作用機制尚不清楚。本文根據NCBI上發布的HCPITP的核苷酸序列，克隆表達了該基因，并對重組蛋白的功能進行了初步研究，以期為深入了解蟲體與宿主間的相互作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與蟲體 山羊，6～8月齡，購自江蘇省海門市，飼養于南京農業大學實驗動物中心。捻轉血矛線蟲(南京分離株)保存于南京農業大學獸醫寄生蟲病學研究室。6周齡SPF雌性SD大鼠(約200 g)購自北京維通利華實驗動物公司，飼養于南京農業大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與材料 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)工程菌與pET-28a(+)原核表達載體保存于本實驗室；RNA isolater、HiScript III 反轉錄試劑購自南京諾唯贊公司；限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、PrimeSTAR高保真DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司；HRP標記Rabbit Anti-Goat IgG、HRP標記Goat Anti-Rat IgG購自南京巴傲得公司；DAB顯色試劑盒購自天根生物公司；qPCR試劑盒購自北京全式金公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司；RPMI 1640培養基、雙抗溶液購自Gibco公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)為美國GlpBio公司產品；Cy3標記山羊抗大鼠IgG購自碧云天公司。引物由通用生物公司合成。

1.2 HCPITP基因的克隆與表達

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI中HCPITP的CDS序列(CDJ90012.1)設計引物，選擇酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ，引物如下：5′-CG-GAATTCATGATTGTCAAAGAATATCGTGT-CGTT-3′(HCPITPF)，5′-CCCTCGAGTTATGTAGCGGTCATTCCTCGCA-3′(HCPITPR)，下劃線部分的序列表示酶切位點。

1.2.2 目的基因的擴增與原核表達質粒的構建 TRIzol法提取捻轉血矛線蟲成蟲總RNA，反轉錄合成cDNA，用引物HCPITPF和R進行PCR擴增，反應程序設置為98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環35次。膠回收PCR產物，用EcoR Ⅰ和XhoⅠ將該產物和pET-28a(+)質粒分別進行雙酶切。酶切產物4 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α。重組菌培養12～16 h，雙酶切與測序鑒定。陽性質粒命名為pET-28a-HCPITP。

1.2.3 重組蛋白HCPITP的表達及純化 將pET-28a-HCPITP轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單菌落37 ℃，180 r·min-1振蕩培養7～8 h至菌液OD600 nm值為0.4～0.6，加入IPTG至其終濃度為1 mmol·L-1，繼續振蕩培養5 h，SDS-PAGE分析蛋白分布情況。用鎳柱純化重組蛋白。

1.2.4 重組蛋白HCPITP多克隆抗體的制備 將500 μg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化，對2只雌性SD大鼠多點皮下注射進行初次免疫；兩周后，將400 μg重組蛋白與等體積弗式不完全佐劑混合乳化，進行第二次免疫；此后每周免疫一次，直至四免，方法與二免一致。四免10 d后，心臟采血，收集血清。

1.2.5 重組蛋白HCPITP的Western blot分析 將重組蛋白進行SDS-PAGE，轉印至PVDF膜，50 g·L-1脫脂奶37 ℃封閉1 h，分別將感染捻轉血矛線蟲的山羊血清與未感染的山羊血清作為一抗(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，將Rabbit Anti-Goat IgG作為二抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，DAB試劑盒顯色。

1.3 HCPITP基因階段性轉錄水平分析

篩選并優化引物，使目的基因與內參基因引物擴增效率一致，如表1所示。TRIzol法分別提取捻轉血矛線蟲雌蟲、雄蟲、第三期幼蟲、蟲卵等階段蟲體的總RNA，反轉錄合成cDNA，進行qPCR，反應程序設置為94 ℃預變性30 s，之后94 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，循環40次。用2-ΔΔCt法分析HCPITP基因在不同發育階段的轉錄情況。以雌蟲轉錄水平為參照分析數據。

表1 qPCR引物Table 1 The Primers of qPCR

1.4 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs功能的影響

1.4.1 山羊PBMCs的分離 山羊頸靜脈采集抗凝血，按照淋巴細胞分離液說明書分離山羊PBMCs，臺盼藍染色觀察活細胞占95%以上，用含1%雙抗和10%胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞濃度至106個·mL-1，用于后續試驗。

1.4.2 重組蛋白HCPTIP與山羊PBMCs的結合 細胞懸液中加入重組蛋白(終濃度10 μg·mL-1)作為試驗組，加等量PBS作陰性對照組，37 ℃，50 mL·L-1CO2孵育2～3 h。離心收集細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，用50 g·L-1BSA于 37 ℃封閉1 h，以大鼠抗HCPITP血清為一抗(1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，以Cy3標記的山羊抗大鼠IgG為二抗(1∶500稀釋)37 ℃孵育1 h，DAPI染色，滴加抗熒光淬滅封片液后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.4.3 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs增殖的影響 設置陽性組、陰性組和試驗組，在陽性組與試驗組中加入ConA溶液(工作濃度10 μg·mL-1)，37 ℃，50 mL·L-1CO2條件下孵育24 h刺激細胞。然后，在試驗組中加重組蛋白HCPITP(終濃度分別為10、20、40、80 μg·mL-1)，在陰性組中加入和終濃度為10 μg·mL-1的蛋白相同體積的PBS，繼續孵育24 h。加CCK-8后再孵育4 h，測定OD450nm，計算增殖指數。

1.4.4 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs模式識別受體轉錄水平的影響 選擇山羊模式識別受體中屬于Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)家族的Toll樣受體1～10(Toll-like receptors1 ～ Toll-like receptors 10，TLR1～TLR10)，屬于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors, NLRs]家族中的NLR家族含CARD結構蛋白4(NLR family CARD domain-containing protein 4, NLRC4)，屬于C型凝集素受體(C-type lectin receptor, CLRs)家族的C型凝集素結構域家族4成員D(C-type lectin domain family 4, member D, CLEC4D)、C型凝集素結構域家族4成員E(C-type lectin domain family 4, member E, CLEC4E)和屬于維甲酸誘導基因-I樣受體(retinoic-acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors, RLRs)家族的黑色素瘤分化相關基因5 (melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)，按照GenBank中這14種PRRs的基因與β-肌動蛋白(β-Actin)基因的核苷酸序列，設計qPCR引物并優化，引物信息見表2。

表2 山羊模式識別受體qPCR引物Table 2 The Primers of Goat Pattern Recognition Receptor for qPCR

設置試驗組與陰性對照組，在試驗組中加重組蛋白(終濃度分別為10、20、40、80 μg·mL-1)，陰性對照組中加入和終濃度為10 μg·mL-1的蛋白等量的PBS，37 ℃、50 mL·L-1CO2孵育24 h。TRIzol法分別提取各孔細胞總RNA，合成cDNA，進行qPCR反應，反應程序同“1.3”。

1.4.5 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs細胞因子轉錄水平的影響 選擇本實驗室早期篩選的山羊細胞因子白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)編碼基因以及內參基因β-Actin的qPCR引物，優化后進行后續試驗。引物信息見表3。

表3 山羊細胞因子qPCR引物Table 3 The Primers of Goat Cytokine for qPCR

以“1.4.4”中合成的cDNA為模板進行qPCR，反應程序同“1.3”。

2 結 果

2.1 HCPITP蛋白預測分析

根據該蛋白氨基酸序列，在線預測其理論等電點為6.14，分子量31.1 ku，無跨膜區與信號肽，以僅含一個PITP結構域的單域蛋白質存在，主要運送磷脂酰肌醇(非囊泡形式)，該蛋白與磷脂酰肌醇(PI)復合物的三級結構如圖1B所示。選取了其他10個物種的PITP用MEGA11軟件構建進化樹(圖1A)，顯示與秀麗隱桿線蟲PITP的親緣關系最相近。

A.HCPITP進化樹分析；B.PITP與磷脂酰肌醇復合物的三級結構，掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖A. Phylogenetic tree of HCPITP; B. Tertiary structure of PITP and phosphatidylinositol complex, the color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖1 HCPTIP進化樹分析及PITP與磷脂酰肌醇復合物的三級結構Fig.1 HCPTIP phylogenetic tree analysis and tertiary structure of PITP and phosphatidylinositol complex

2.2 HCPITP基因的克隆與表達

瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物，觀察到816 bp處有單一條帶(圖2A)，雙酶切鑒定重組質粒pET-28a-HCPITP，在相應位置分別觀察到載體與目的基因條帶(圖2B)，重組蛋白主要分布于上清(圖2C)，蛋白純化效果良好，大小約為35 ku(圖2D)。

A.HCPITP基因PCR擴增；B. 重組質粒pET-28a-HCPITP的雙酶切鑒定；C. 重組蛋白HCPITP的分布情況；D. 重組蛋白HCPITP的純化效果。M1. DL5000 DNA相對分子質量標準；1. PCR擴增產物；2. 重組質粒經EcoR I和Xho I雙酶切；M2. 蛋白質相對分子質量標準；3. HCPITP在上清的分布情況；4. HCPITP在包涵體的分布情況；5. HCPITP主要分布于上清；6. HCPITP的純化結果A. PCR amplification of HCPITP gene; B. Identification of pET-28a-HCPITP digested by restriction endonuclease; C. Distribution of recombinant protein HCPITP; D. Purification of recombinant proteins HCPITP. M1. DL5000 DNA marker; 1. PCR amplification product; 2. The recombinant plasmid was digested by EcoR I and Xho I; M2. Protein marker; 3. Distribution of HCPITP in supernatant; 4. Distribution of HCPITP in inclusion bodies; 5. HCPITP is mainly distributed in the supernatant; 6. Purification results of HCPITP圖2 HCPITP基因克隆表達及蛋白表達純化Fig.2 HCPITP gene cloning and expression and protein purification

2.3 重組蛋白HCPITP Western blot分析

Western blot結果顯示在35 ku左右有一特異性條帶，而陰性對照無條帶(圖3)，說明該重組蛋白具有良好的反應原性，能夠被感染山羊免疫系統所識別。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.重組蛋白HCPITP與山羊陽性血清的Western blot分析；2.重組蛋白HCPITP與山羊陰性血清的Western blot分析M. Protein marker; 1. Western blot analysis of recombinant proteins HCPITP with goat positive serum; 2. Western blot analysis of recombinant proteins HCPITP with goat negative serum圖3 重組蛋白HCPITP Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of recombinant proteins HCPITP

2.4 HCPITP基因在蟲體不同發育階段轉錄水平

反應體系中HCPITP引物濃度為0.21 μmol·L-1時，其擴增效率與內參基因一致，以ΔCt(HCPITPCt值-內參基因Ct值)為縱坐標，蟲體cDNA濃度梯度的lg值為橫坐標，制作散點圖，趨勢線方程為y=-0.092x+4.525 3，R2=0.284 6，|斜率|<0.1(圖4A)，確定引物符合2-ΔΔCt法的應用要求，能夠用以檢測HCPITP基因轉錄水平。

A. cDNA不同稀釋梯度下β-tubulin與HCPITP之間ΔCt變化；B. HCPITP基因在捻轉血矛線蟲不同發育階段轉錄水平變化。差異顯著性用小寫字母表示，字母相同即為差異不顯著(P>0.05)，字母不相同即為差異顯著(P<0.05)A. Changes of ΔCt between β-tubulin and HCPITP under different dilution gradients of cDNA; B. Transcriptional changes of HCPITP gene in different developmental stages of Haemonchus contortus. The significance of the difference is indicated by lowercase letters, the same letter means the difference is not significant (P>0.05), and the different letter means the difference is significant (P<0.05)圖4 引物篩選結果及HCPITP轉錄水平階段性分析Fig.4 Results of primer screening and phased analysis of HCPITP transcript levels

HCPITP基因在捻轉血矛線蟲不同發育階段的轉錄水平有顯著差異(P<0.05)，在雌蟲、雄蟲、第三期幼蟲和蟲卵中的相對轉錄水平分別為1、10.2、0.47和0.58。

2.5 重組蛋白HCPITP與山羊PBMCs結合

間接免疫熒光結果顯示，Cy3標記(紅色熒光)的山羊抗大鼠抗體成功識別了結合HCPITP的大鼠多抗，并觀察到與DAPI染色(藍色熒光)的PBMCs共定位，而陰性對照組未見紅色熒光(圖5)，表明HCPITP能與山羊PBMCs結合。

HCPITP.重組蛋白;Control.陰性對照;DAPI.細胞核染色藍色熒光；Cy3.二抗標記紅色熒光； Merge.紅藍熒光通道疊加。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖HCPITP. Recombinant protein; Control. Negative control; DAPI. Nuclear staining (blue fluorescence); Cy3. Secondary antibody labeled red fluorescence; Merge. Red and blue fluorescence channel overlay. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article圖5 重組蛋白HCPITP與山羊PBMCs的體外結合Fig.5 In vitro binding of recombinant proteins HCPITP to goat PBMCs

2.6 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs增殖的影響

與陰性對照組相比，ConA刺激后能夠顯著促進PBMCs增殖(P<0.05)，而重組蛋白HCPITP能夠顯著抑制ConA對PBMCs增殖的促進作用(P<0.05)，其中10 μg·mL-1蛋白濃度組與其他濃度組相比抑制幅度較小(圖6)。

差異顯著性用小寫字母表示，字母相同即為差異不顯著(P>0.05)，字母不相同即為差異顯著(P<0.05)The significance of the difference is indicated by lowercase letters, the same letter means the difference is not significant (P>0.05), and the different letter means the difference is significant (P<0.05)圖6 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs增殖的影響Fig.6 Effects of recombinant proteins HCPITP on the proliferation of goat PBMCs

2.7 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs模式識別受體轉錄水平的影響

與陰性對照組相比，重組HCPITP能顯著抑制TLR2-TLR5、TLR7-TLR9、CLEC4D與CLEC4E的表達(P<0.05)，其中對TLR5的抑制作用最大，對TLR9的抑制作用隨濃度升高而增強，對于NLRC4與MDA5，10 μg·mL-1時明顯抑制(P<0.05)。HCPITP顯著提升TLR1和TLR10的轉錄水平(P<0.05)，其中對TLR1的作用呈劑量依賴性(圖7A～C)。

2.8 重組蛋白HCPITP對山羊PBMCs細胞因子轉錄水平的影響

與陰性對照組相比，HCPITP對IL-2、IL-4和IL-17都具有顯著刺激作用(P<0.05)，其中對IL-17的刺激效果最明顯，對IL-4的作用隨濃度升高而減弱。重組蛋白濃度為40和80 μg·mL-1時能顯著提升IL-6(P<0.05)表達。該蛋白能夠顯著抑制IL-10的轉錄水平(P<0.05)。重組蛋白濃度為80 μg·mL-1時可刺激TGF-β的轉錄。濃度為10和20 μg·mL-1時顯著抑制IFN-γ的轉錄，但80 μg·mL-1時顯著刺激其表達(P<0.05)。(圖7D)。

3 討 論

隨著捻轉血矛線蟲抗藥性的產生與發展[13-15]，研究捻轉血矛線蟲與宿主間相互作用、鑒定對宿主具有免疫調節能力的蟲體蛋白、篩選新的疫苗候選抗原對該病的免疫預防具有重要意義。

本試驗從前期通過質譜鑒定到的蛋白中選取了HCPITP，分析了該基因在蟲體不同發育階段的轉錄情況，目前認為HCPITP的作用主要是負責轉運磷脂酰肌醇以保證磷脂酰肌醇信號通路中PIP2的足量供應[8]，在蟲卵和第三期幼蟲中轉錄水平極低，推測可能是由于蟲體并未發育到入侵寄生的活躍階段，致表達量較低，為后續的功能研究提供參考依據。

Western blot分析顯示HCPITP具有良好的反應原性，間接免疫熒光試驗也驗證了其與山羊PBMCs的結合，已有研究證明，捻轉血矛線蟲多種重組蛋白抗原能夠與山羊PBMCs在體外結合并引起一系列免疫系統的變化效應[16-18]，因而進一步探究了HCPITP對山羊PBMCs功能的影響。結果表明HCPITP能夠顯著抑制ConA對PBMCs增殖作用，抑制結果與陰性對照組無明顯差異，說明該重組蛋白可能能夠抑制宿主的免疫反應[19-21]，推測或許與免疫逃避有關，需要進一步研究。

PRRs作為寄生蟲入侵時遭遇的第一道防線，將寄生蟲攜帶或分泌的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)作為其配體進行識別，觸發下游的先天免疫反應，主要分為TLRs、RLRs、CLRs和NLRs四大類[22-25]。HCPITP作用于PBMCs后，TLR2～TLR9、NLRC4、CLEC4D、CLEC4E、MDA5的轉錄水平表現為顯著抑制或無明顯變化，其中TLR5的水平最低，可能是該受體主要以細菌的鞭毛蛋白為配體[26]，與寄生蟲的關聯度較低的原因，TLR1與TLR10轉錄水平都顯著提升，其中TLR1的提升呈劑量依賴性，故HCPITP可能主要通過TLR1與TLR10激活下游先天免疫反應，某些寄生蟲先天免疫的文獻也報道了類似情況[27-29]。

輔助性T細胞(Th)在受到抗原刺激后能夠分化成不同的效應T細胞亞群，這些亞群又能夠分泌不同的細胞因子譜，指示免疫調節的不同方向[30-33]。PBMCs細胞因子轉錄水平變化情況顯示，Treg細胞相關的細胞因子IL-10與TGF-β表現為抑制或無明顯變化，炎癥因子IL-6呈劑量依賴性升高，IL-17又一直處于較高的轉錄水平，據此推測HCPITP對PBMCs的“促炎性”可能隨著濃度的升高而增強。對于IL-2和IL-4，HCPITP的提升作用顯著，其中IL-2一直處于較高的水平，而蛋白對IL-4的作用隨濃度升高而減弱，同時IFN-γ水平又有隨濃度逐漸提升的趨勢，已經有研究證明IL-2能夠決定抗原激活的CD4+T細胞向Th1或向Th2轉化的命運[34-35]，推測在HCPITP作用于PBMCs時，IL-2一直在維持Th1型與Th2型免疫反應的平衡，隨著濃度的升高，表現出了從Th2型逐漸偏向Th1型的傾向，如果屬實，這也證明了抗原對T細胞分化的誘導并不是一成不變的，可能由于濃度、時間或其他條件的變化，導致免疫調節的主要方向發生改變[31]。

綜上所述，HCPITP對PBMCs可能具有免疫調節作用。由于該蛋白是捻轉血矛線蟲外泌體蛋白，推測蟲體可能通過調節外泌體中該蛋白的攜帶量，靶向作用于宿主免疫細胞，靈活調節宿主免疫反應，從而達到免疫逃避的效果，但相關機制的可能性仍需進一步研究。

4 結 論

捻轉血矛線蟲HCPITP基因的轉錄具有明顯的階段差異性，HCPITP重組蛋白能夠抑制ConA對山羊外周血單個核細胞的增殖，對山羊細胞因子IL-2、IL-4、IL-6和IL-17以及模式識別受體TLR1和TLR10的轉錄具有促進作用。