多房棘球蚴感染對小鼠肝脂質代謝的影響

李 紅，李艷萍，劉婷麗，陳國梁，王立群，郭小臘，駱學農,2*

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046；2.揚州大學 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

多房棘球蚴病(echinococcosis multilocularis)是由多房棘球絳蟲的幼蟲——多房棘球蚴(Echinococcusmultilocularis)寄生于人和動物的肝、肺等器官所引起的一種嚴重危害人和動物健康的寄生蟲病[1]。多房棘球蚴病多發于牧區，我國西北地區和青藏高原東部地區為此病的重災區[2]。多房棘球蚴在宿主肝組織內以出芽的方式浸潤性增殖，不斷產生新的囊泡，并侵蝕鄰近組織[3]，當包囊直徑超過10 cm或肝等器官被包囊占據70%以上時，可引發門靜脈高壓、黃疽、肝功能異常等癥狀，繼續發展可能導致肝功能障礙[4]。肝纖維化是由多房棘球蚴持續刺激引發的保護性病理過程。早期肝纖維化可逆轉，膠原蛋白可限制蟲體的擴張及修復受損的肝組織。肝纖維化在中晚期開始惡化，達到不可逆的程度，進而發展為肝硬化和肝癌[5]。

肝是生物體內脂質生物合成和代謝的器官之一。肝包含多種細胞類型，包括肝實質細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)、Kupffer細胞(KC)和肝內皮細胞等。目前，多房棘球蚴病肝損傷的發病機制主要集中于其免疫細胞和HSC的功能研究[6-8]。而肝實質細胞是肝最主要的細胞，約占肝細胞總數的60%，在肝行使代謝和合成功能過程中發揮著重要作用。肝損傷和病變往往會累及肝實質細胞的功能[9]。此外，肝實質細胞在肝纖維化的發展過程中也發揮著重要的作用[10-11]。脂代謝水平紊亂可導致肝脂肪變性、脂肪性肝炎甚至肝硬化[12]。大量研究表明，肝脂代謝與肝纖維化和炎癥反應密切相關，且脂質代謝紊亂與HSC激活相關。肝組織內異常增加的脂質，特別是過氧化脂質、游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)等可通過影響脂質代謝平衡和增強脂質過氧化反應促進肝纖維化[13-14]。多房棘球蚴感染會導致肝損傷和纖維化，可能影響到肝或肝實質細胞的脂質代謝。因此，本研究從組織和分子水平上分析了多房棘球蚴感染對小鼠肝脂質代謝的影響，為進一步揭示多房棘球蚴的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲種與試驗動物

多房棘球蚴采自本實驗室飼養的保種宿主長爪沙鼠。60只6周齡的BALB/c雄性小鼠購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心。本研究由中國農業科學院蘭州獸醫研究所動物倫理委員會批準(批準號:LVRIAEC-2018009)，所有動物試驗嚴格按照動物福利指南進行。

1.2 主要試劑

小鼠麻醉劑購自南京有晴生物科技有限公司；膠原酶Ⅳ、DNase購自Sigma公司；PBS緩沖液、胎牛血清(FBS)、DMEM/High Glucose培養基購自Gibco公司；RNA提取試劑盒、RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒購自寶生物工程有限公司；實時定量PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 多房棘球蚴原頭蚴感染小鼠

頸椎脫臼處死腹腔接種過多房棘球蚴原頭蚴的腹圍明顯增大的長爪沙鼠，將其固定在專用解剖臺上，于超凈工作臺中剖解，無菌分離原頭蚴。將60只清潔級BALB/c小鼠(6周齡，雄性)隨機分為試驗組和對照組，每組30只。試驗組小鼠每只腹腔接種600個原頭蚴，對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS緩沖液。所有小鼠均在標準喂養條件下飼養，可自由獲得水和食物。

1.4 肝病理表征觀察

在感染2、3和6月時，各組隨機選取3只小鼠，頸椎脫位處死，解剖小鼠并迅速剪取少許肝組織，投入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃避光過夜固定。肝組織塊經乙醇梯度脫水后石蠟包埋，常規制備冰凍切片。將切片浸入60%異丙醇中預處理后，置于油紅O染液中浸染。60%異丙醇洗滌切片至背景基本無色，滴染蘇木精，PBS洗滌3次，返藍液返藍后封片并觀察。用Image pro plus軟件計算油紅染色面積。

1.5 肝實質細胞的分離

分別取感染多房棘球蚴2、3月的BALB/c小鼠各3只，腹腔注射50 μL麻醉劑，5～8 min后固定小鼠，用酒精棉球擦拭消毒，沿腹中線打開腹腔，經肝門靜脈緩慢灌注預熱的EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)溶液(每只小鼠10 mL，5 mL·min-1)。待肝充盈后，剪斷下腔靜脈使灌注液流出。用預熱的0.04%膠原酶IV原位灌注(每只小鼠30 mL，5 mL·min-1)后，小心取出肝，置于裝有20 mL預冷DMEM的培養皿中漂洗。小心剝除膽囊、結締組織等，將肝置于裝有預冷0.08% 膠原酶Ⅳ溶液(含有1% DNA酶)的培養皿中，剪碎，37 ℃水浴消化30 min。消化后的肝組織通過70 μm的細胞過濾器過濾至50 mL的試管中。細胞懸液4 ℃，50×g離心4 min，棄上清，沉淀用PBS懸浮，50×g離心4 min后棄上清。重復操作上述步驟3次。將37 ℃預熱的完全培養基(含10% FBS的高糖 DMEM)加入到已純化的肝實質細胞沉淀中，重懸細胞，并調整細胞密度，每孔1×106個細胞接種于12孔培養板中，在顯微鏡下觀察細胞的形態后，置于37 ℃的CO2培養箱中培養。

1.6 肝實質細胞RNA的提取

向裝有肝實質細胞的1.5 mL無RNA酶的離心管中加入0.70 mL的TRIzol，室溫靜置5 min，待細胞完全裂解后，加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置5 min。12 000×g離心15 min，分離上層水相，加入DNA酶(0.1 mg·mL-1)去除基因組DNA。加入異丙醇，混勻后置-20 ℃冰箱過夜沉淀。12 000×g離心15 min，棄上清。用75%乙醇洗滌沉淀，離心收集RNA，室溫干燥5 min，用適量無RNA酶水溶解，Nanodrop2000測定RNA的濃度，1.5%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。提取的RNA置-80 ℃保存。

1.7 肝實質細胞的轉錄組測序分析

將制備好的RNA樣品送華大公司進行高通量測序。采用FPKM標準化方法計算mRNA的表達水平。以差異倍數FC>2且校正后的P值Padj<0.05為條件，篩選差異表達基因，并對其進行KEGG和GO分析。

1.8 脂質代謝相關基因的qPCR分析

合成Acox1、Pparγ、Fasn等脂質代謝相關基因的特異性引物(見表1)，利用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒反轉錄后，qPCR分析與脂質代謝相關8個基因的相對表達量。qPCR反應體系如下:2 × All-in-one mix 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ROX 0.1 μL，ddH2O 3.9 μL。qPCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環。以Gapdh為內參基因，用2-ΔΔCt公式計算基因的相對表達水平。

1.9 數據的統計分析

應用GraphPad Prism 6.0分析數據，Student’st檢驗進行差異分析(*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001)。

2 結 果

2.1 原代肝實質細胞的形態特征

在顯微鏡下觀察，剛分離的肝實質細胞呈圓形、透明，胞膜完整而清晰(圖1A)。培養4 d后由貼壁前的圓形轉變為多邊形，出現脫落，死亡(圖1B)。上述結果表明所分離到的肝實質細胞形態與其他文獻報道的基本一致。

圖1 肝實質細胞的形態(200×)Fig.1 Morphology of hepatocytes

2.2 肝實質細胞的轉錄組分析

從感染多房棘球蚴3月的肝實質細胞測序文庫中篩選出1 111個上調表達基因和119個下調表達基因。KEGG分析表明，這些差異表達的基因主要富集于MAPK、PI3 K-Akt、Rap1、細胞因子-細胞因子受體相互作用，以及類固醇生物合成、磷脂酶D和脂肪細胞脂質分解等與脂質代謝相關的信號通路(圖2)。GO富集分析表明，在生物過程(biological process， BP)層面，差異基因主要富集于MAPK級聯的正向調節、ERK1和ERK2級聯的正調節等與脂質代謝相關的過程；在細胞組分(cellular component, CC)層面，差異基因主要富集于細胞表面、胞膜及含膠原細胞外基質等組分；在分子功能(molecular function, MF)層面，差異基因也富集于花生四烯酸環氧酶活性、低密度脂蛋白顆粒結合等相關功能(圖3)。

圖中每一個圓點表示一個KEGG通路Each dot represents a KEGG pathway圖2 差異表達基因KEGG通路富集散點圖Fig.2 Scatter plot of KEGG pathway of differentially expressed genes

此外，脂質合成相關的基因Scd1、Fasn、Srebf1和Cd36均上調表達，而脂質分解相關的基因Acox1、Pparγ、Pparα和Cpt1a均呈下調表達(表2)。

表2 肝實質細胞中脂質代謝相關基因的表達水平Table 2 Expression levels of lipid metabolism-related genes in hepatocytes

2.3 肝油紅O染色

如圖4所示，感染2月時，試驗組(E)小鼠肝油紅O染色點和面積較對照組(C)少；但在3月時，感染組小鼠肝細胞質及細胞間隙含有密集的油紅O著色點，油紅O染色面積由46 523 pixel2(平方像素)顯著增加至158 326 pixel2，面積增加率達70%，且細胞質中充滿脂質空泡；在6月時，感染組小鼠肝細胞質及細胞間隙較對照組小鼠油紅O著色點更加密集，染色面積由86 592 pixel2顯著增加至326 252 pixel2，面積增加近73%。說明多房棘球蚴感染可促進小鼠肝的脂質沉積。

圖4 多房棘球蚴感染小鼠肝油紅O染色(200×)Fig.4 Oil red O staining of livers of E multilocularis infected mice

2.4 肝實質細胞脂質代謝相關基因的表達水平

與未感染對照組相比，多房棘球蚴感染小鼠2月時，Scd1、Fasn、Srebf1 mRNA水平明顯上調(P<0.001,P<0.001,P<0.05)，Cd36的水平明顯降低(P<0.001)，而Acox1和Cpt1a的mRNA水平明顯上調(P<0.01,P<0.05),Pparγ和Pparα的mRNA水平無明顯變化(圖5)；感染3月時，Scd1、Fasn、Srebf1和Cd36的表達水平均明顯升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.05)，而Acox1、Cpt1α、Pparγ和Pparα的表達水平明顯降低(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.01)(圖5)。

圖5 多房棘球蚴感染2月小鼠肝實質細胞脂質代謝相關基因的表達水平Fig.5 Expression levels of lipid metabolism related genes in hepatic parenchyma cells of mice infected with E. multilocularis for 2 months

圖6 多房棘球蚴感染3月小鼠肝實質細胞脂質代謝相關基因的表達水平Fig.6 Expression levels of lipid metabolism related genes in hepatic parenchyma cells of mice infected with E. multilocularis for 3 months

3 討 論

肝脂代謝與肝纖維化和炎癥反應密切相關，肝細胞是脂代謝發生的重要場所。但至今尚沒有多房棘球蚴感染引起的宿主肝細胞脂質代謝功能改變的相關研究。為此，本研究初步探討了多房棘球蚴感染后，肝和肝細胞脂質代謝變化情況。研究結果顯示，多房棘球蚴感染時間越長，肝脂質沉積越明顯。而肝的主要細胞——肝實質細胞，其脂質合成逐漸增多，而脂質分解氧化逐漸減少。因此，多房棘球蚴感染可促進肝細胞脂質合成能力，抑制脂質氧化分解能力，從而使肝的脂質發生沉積。上述研究結果將為從肝細胞代謝角度揭示多房棘球蚴致病機制奠定基礎。

作為肝中最多的細胞，肝實質細胞不僅在維持肝正常生理功能中發揮重要作用，而且還參與肝纖維化的發生、發展。在非酒精性脂肪性肝病中，肝細胞中脂質過度積累，產生大量反應氧物質，激活PI-3k激酶等信號通路，TGFβ等信號分子的產生增加，進而導致肝星狀細胞的活化和纖維化的發生[15-16]。另外，肝細胞中大量的脂質可作為生物活性物質，作用于Pparγ、TLR4、胰島素和P53介導的信號通路，促進肝炎癥和纖維化發展[17-18]。此外，大量的研究已經證明，多房棘球蚴感染會導致肝纖維化[8,19]。本研究表明，多房棘球蚴感染可以促進小鼠肝脂質沉積。多房棘球蚴感染是否可以通過促進肝實質細胞脂質沉積，進而導致肝纖維化，需要進一步的深入研究。

本研究證實多房棘球蚴感染可促進肝實質細胞的脂質合成，降低脂質氧化水平，從而導致肝脂質沉積。但多房棘球蚴感染能否引起宿主機體的脂肪沉積，尚需進一步研究。已有研究表明，細粒棘球蚴感染可導致羊肉的蛋白質、脂肪、鈣和能量值大大降低，尤其是肌肉中的脂肪較健康羊下降了37%，并且單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的水平顯著降低[20]。Corbin等[21]采用核磁共振(NMR)技術研究了感染肥頭絳蟲(Taeniacrassiceps)對小鼠肝脂質譜的影響。感染小鼠肝的氯仿/甲醇提取物顯示，與對照組相比，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、總甘油磷脂、三酰甘油、總脂肪酸(FA)和所有測定的FA成分的濃度較低。此外，用脂肪酸濃度除以總脂肪酸濃度得到的比值表明，感染引起的不飽和脂肪酸(FAs)濃度下降比其他脂肪酸要小。Lu等[22]的研究表明，與對照組相比，細粒棘球蚴感染小鼠的脂肪組織的質量減少，脂肪細胞變小。間接量熱法揭示，細粒棘球蚴感染后小鼠的能量代謝發生了變化，其特征是CO2的產生和O2的消耗減少，碳水化合物氧化急劇下降，脂肪氧化略有增加。KEGG和GO分析表明，寄生蟲的感染重構了一個復雜的代謝網絡。脂氧合酶、精氨酸和脯氨酸代謝途徑顯著上調，而糖酵解、三羧酸循環、脂肪新生和脂滴形成途徑顯著下調，提示細粒棘球絳蟲感染可促進肝的脂肪分解。上述結果雖然與本研究多房棘球蚴感染引起肝脂肪沉積的結論相矛盾，但究竟是細粒棘球蚴與多房棘球蚴對宿主脂肪代謝的影響差異，還是不同宿主、不同組織之間的差異，還需進一步研究。但可以確定的是，棘球蚴或絳蟲蚴感染對宿主脂肪代謝確實產生了很大影響?；蚪M測序表明，絳蟲缺乏從頭合成脂肪酸和膽固醇的編碼基因，而存在6個高水平表達的脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding proteins，FABPs)。棘球蚴等絳蟲蚴生長發育所需的脂類物質可通過其FABPs從宿主組織獲取，從而可能影響到宿主的脂質代謝[23]。此外，由于多房棘球蚴感染可引起肝炎癥反應和肝纖維化，使肝微環境發生巨大變化。所以，肝脂質沉積增多除與多房棘球蚴的直接作用有關外，還可能與肝微環境改變造成的間接影響有關。后續的研究將進一步探索肝實質細胞脂質沉積與多房棘球蚴感染引起的肝炎癥反應及HSC活化之間的關系，從脂代謝角度深入探究多房棘球蚴的致病機制。

4 結 論

多房棘球蚴感染小鼠后3、6月肝脂肪沉積明顯增多，且感染3月肝實質細胞脂質合成相關基因表達水平明顯升高，而脂質氧化分解相關基因表達水平明顯降低。多房棘球蚴感染早期可能通過促進肝實質細胞的脂質合成，抑制脂質氧化分解，從而導致肝脂質沉積。本研究結果為深入研究多房棘球蚴感染與肝脂肪代謝紊亂提供了有益線索。